דגי זברה טרנסגניים הוכיחו את עצמם כקריטיים להבנתנו את התפתחות העוברים. מערכת Tol2 היא כלי רב-תכליתי המאפשר לחוקרים ליצור במהירות ובשיטתיות דגי זברה טרנסגניים מרובים עבור מחקרי FASD. העיצוב המודולרי והקלות של יצירת רכיבי ערכה חדשים הופכים את מערכת Tol2 לכלי רב-תכליתי ליצירת טרנסגניות חדשות ללא צורך בעיצוב מחדש של רכיבים כלשהם בערכה.
עצתי לחוקרים המבצעים טכניקה זו בפעם הראשונה היא לבצע מספר ריצות ניסוי כדי להתאמן על הדיוק של יצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים. כדי להתחיל, ליניאריזציה של פלסמיד ערכת Tol2 המכיל טרנספוזאז עם אנדונוקלאז הגבלה אחד על ידי שילוב של 10 מיקרוליטר של פלסמיד טרנספוזאז, 1.5 מיקרוליטר של חיץ תגובת הגבלה אנדונוקלאז, ו 0.3 מיקרוליטר של אנדונוקלאז אחד בצינור מיקרוצנטריפוגה של 500 מיקרוליטר. מלא את התגובה עד 20 מיקרוליטר עם מים ללא RNAse.
מערבבים ומעכלים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך הלילה. למחרת, לעצור את העיכול על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 0.5 EDTA טוחן, שני מיקרוליטר של חמישה אמוניום אצטט טוחן, ו 80 מיקרוליטר של 100% אתנול לתערובת התגובה. מערבבים ומצננים במינוס 20 מעלות למשך הלילה.
למחרת, צנטריפוגות ושאפו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את כדורית הדנ"א במים נטולי RNAse. לאחר מכן לקבוע את ריכוז פלסמיד ליניארי בננוגרם למיקרוליטר על פלואורומטר על ידי הפעלת שני מיקרוליטרים של הדגימה. הגדר את ייצור ה- mRNA SP6 על ידי שילוב של 10 מיקרוליטר של 2X NTP/CAP, שני מיקרוליטרים של מאגר תגובה 10X, 0.1 עד מיקרוגרם אחד של תבנית DNA ליניארית בשני מיקרוליטרים של תערובת אנזימים SP6 בשפופרת של 500 מיקרוליטר.
ממלאים את התגובה עד 20 מיקרוליטר במים נטולי RNAse ומערבבים לפני הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים, מוסיפים מיקרוליטר אחד של DNAse, מערבבים היטב ודגרים במשך 15 דקות נוספות. עצור את התגובה על ידי הוספת 30 מיקרוליטר של תמיסת משקעים ליתיום כלורי.
מערבבים ומצננים במינוס 20 מעלות למשך הלילה. למחרת, צנטריפוגו את התמיסה לגלולת ה-mRNA ושאפו את הסופרנאטנט לפני ששטפו את הגלולה במיליליטר אחד של 80% אתנול. ייבשו באוויר את הגלולה והשהו אותה מחדש ב-20 מיקרוליטר מים נטולי RNAse.
לקבוע את ריכוז mRNA באמצעות פלואורומטר, ולאחר מכן aliquot 100 ננוגרם של mRNA לכל צינור לשימוש יחיד ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לבצע את התגובה, אסוף 10 femtomole כל אחד של P5E, PME ו- P3E ו- 20 femtomole של וקטור היעד PDEST. זהה את הגודל של כל ארבעת הווקטורים וזוגות הבסיס ממקור הפלסמיד.
לאחר קביעת הריכוז של כל ארבעת הווקטורים, תוך שימוש במשקל הדנ"א כ-660 גרם לכל שומה וגודל פלסמיד וזוגות בסיסים, מחשבים את סך כל הננוגרמים של פלסמיד הדרושים כדי להגיע ל-10 פמטומול עבור וקטורי כניסה או 20 פמטומולי עבור וקטור יעד. לאחר מכן, צור את המבנה sox17:EGFP-CAAX באמצעות הרכיבים המתוארים בכתב היד. באמצעות ריכוז הפלסמיד, חשב את סך כל המיקרוליטרים של כל פלסמיד הדרוש כדי להגיע ל -10 פמטומול או 20 פמטומול, ולאחר מכן חלק זאת בשניים לשימוש בתגובות חצי LR של חמישה מיקרוליטרים.
צור 10 femtomole של P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) ו- 20 femtomole של וקטור יעד. הגדר תגובת חצי LR של חמישה מיקרוליטרים על ידי שילוב הנפחים של P5E, PME, P3E ו- PDEST בשפופרת של 500 מיקרוליטר. לאחר מכן מוסיפים מים סטריליים כדי להפוך את נפח ארבעה מיקרוליטר.
מערבבים את אנזים ה-LR פעמיים במשך דקה כל אחד לפני הוספת מיקרוליטר אחד לתגובה ומערבבים היטב לפני הדגירה ב-25 מעלות צלזיוס. למחרת, להפסיק את תגובת LR על ידי הוספת 0.5 מיקרוליטר של proteinase K.Incubate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן מגניב לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הפוך שלושה עד ארבעה מיקרוליטרים של פלסמיד לתאים מופשרים מבחינה כימית על ידי הוספת הפלסמיד ולתת לתאים לשבת על קרח במשך 25 עד 30 דקות.
ואז חום לחשמל את התאים באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. לאחר הלם החום, הוסיפו 250 מיקרוליטר של מדיה נוזלית עשירה ללא אנטיביוטיקה לתאים ודגרו עם רעידות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. מורחים 300 מיקרוליטר של תרחיף חיידקי על צלחת אחת של אמפיצילין לוריא-ברטאני ודגרים למשך הלילה.
למחרת, סנן את המושבות לנוכחות שני פנוטיפים: ברור ואטום. קוטפים את המושבות השקופות אחת בכל פעם, מחסנים את התרבית הנוזלית ומנערים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך הלילה. ערבבו 150 ננוגרם פלסמיד, 100 ננוגרם mRNA טרנספוזאז ו-2% פנול אדום על קרח.
לאחר מכן להוסיף מים ללא RNA כדי להפוך את נפח שלושה מיקרוליטר. העבר עובר אחד בשלב התא באמצעות פיפטות העברה לצלחת ההזרקה המלאה ב- EM המכסה לחלוטין את האגר ולאחר מכן לחץ בעדינות על כ 50 עד 75 עוברים לכל חריץ של צלחת ההזרקה. הוסף את תערובת פנול פנול אדום mRNA לקצה הפתוח של מחט הזרקת נימים.
מניחים את מחט הנימים בזרוע מתקן ההזרקה ומפעילים את מתקן ההזרקה. הורידו את המחט לתוך צלחת ההזרקה ושברו את הקצה באמצעות מלקחיים כדי לאפשר רק כמות קטנה של תערובת להישאב החוצה על ידי מתקן ההזרקה. להזריק את העוברים עם בולוס שלושה ננוליטר של תערובת פנול פנול אדום mRNA לתוך גוף התא של העובר.
בסיום, הוציאו את העוברים מצלחת ההזרקה על ידי הוצאתם בעדינות מהחריץ והעבירו אותם לצלחת פטרי 100 מ"מ עם EM טרי. דוגרים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. בחר את השלב ההתפתחותי המתאים לביטוי טרנסגנים פלואורסצנטיים וסנן תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי. סינון עבור טרנסגנים שאינם פלואורסצנטיים על ידי סינון עבור סמנים טרנסגניים פלואורסצנטיים כגון GFP מונע על ידי מקדם ספציפי ללב עבור הגן Cmlc2.
כאשר העוברים החיוביים להחדרה טרנסגנית מתפתחים למבוגרים ומגיעים לגיל הרבייה, מסננים אותם בנפרד להעברת קו הנבט ואקספרסיביות טרנסגנית על ידי הרבאתם לדגי זברה מסוג בר. לדוגמה, מושבות חיידקים המתקבלות מהטרנספורמציה של רקומבינציית LR מוצגות. מושבות שקופות הכילו מוצר רקומבינציה LR נכון יותר מ-85% מהזמן, בעוד שמושבות אטומות מעולם לא הכילו מוצר רקומבינציה נכון.
עיכול אבחוני של שלוש המושבות מטרנספורמציה של תוצרי רקומבינציה LR הראה כי המושבה האטומה היחידה לא הכילה פלסמיד, בעוד ששתי המושבות השקופות הכילו רצועה אחת בזוג בסיס 9, 544. Transposase mRNA ב 1, 950 זוג בסיס מוצג כאן. ביטוי EGFP-CAAX של אנדודרם פסיפס נצפה ב-75% מהעוברים שהוזרקו.
ביטוי סמן מהונדס של Cmlc2 EGFP בלב המתפתח נצפה 24 שעות לאחר ההפריה. לדגי זברה בוגרים הייתה העברת קו נבט של עוברים פלואורסצנטיים שנוצרו על ידי sox17:EGFP-CAAX כאשר האנדודרם מסומן במלואו עם EGFP-CAAX. הן האורך הקדמי-אחורי של האנדודרם והן האורך הגבי-גחוני של כל כיס משקיות אחת עד חמש נמדדו בעוברים מוטנטיים מסוג BMP שטופלו באתנול.
אורכו הכולל של האנדודרם לא הושפע מגנוטיפ או טיפול. עם זאת, שקיות 1 ו-3 הראו עלייה משמעותית באורך השקית בין עוברים פראיים שלא טופלו לעוברים מסוג בר שטופלו באתנול, אך ירידה משמעותית באורכם בין מוטציות BMP שלא טופלו לבין מוטציות BMP שטופלו באתנול. פאוץ' 2 הראה עלייה משמעותית בגודל השקית בין קבוצות הבר שלא טופלו וטופלו באתנול ומוטציות BMP בהתאמה.
כאשר מנסים הליך זה, קריטי להיות מדויקים בצנרת ודילול של מערכת Tol2, כמו גם פגיעה בגוף התא במהלך הזרקת העובר.
