형질전환 제브라피쉬는 배아 발달에 대한 우리의 이해에 중요한 것으로 입증되었습니다. Tol2 시스템은 연구자들이 FASD 연구를 위해 여러 형질전환 제브라피쉬를 빠르고 체계적으로 생성할 수 있도록 하는 다목적 도구입니다. 모듈식 설계와 새로운 키트 구성 요소 생성의 용이성으로 인해 Tol2 시스템은 키트의 구성 요소를 재설계할 필요 없이 새로운 형질전환체를 생성할 수 있는 다목적 도구입니다.
이 기술을 처음으로 수행하는 연구자들에게 드리는 조언은 형질전환 구조물의 생성 및 주입의 정밀도를 훈련하기 위해 여러 차례 시운전을 하라는 것입니다. 먼저, 500 마이크로리터 마이크로원심분리기 튜브에서 10 마이크로리터의 트랜스포사제 플라스미드, 1.5 마이크로리터의 제한 엔도뉴클레아제 반응 완충액 및 0.3 마이크로리터의 엔도뉴클레아제를 조합하여 트랜스포사제를 함유하는 Tol2 키트 플라스미드를 노우트 원 제한 엔도뉴클레아제로 선형화합니다. RNAse가 없는 물로 최대 20마이크로리터의 반응을 채웁니다.
섭씨 37도에서 밤새 섞고 소화하십시오. 다음날, 0.5 몰 EDTA 1 마이크로 리터, 5 몰 암모늄 아세테이트 2 마이크로 리터 및 100 % 에탄올 80 마이크로 리터를 반응 혼합물에 첨가하여 소화를 중지시킨다. 밤새 섭씨 영하 20도에서 섞고 식히십시오.
다음날, RNAse가 없는 물에 DNA 펠릿을 재현탁하기 전에 상층액을 원심분리하고 흡인합니다. 그런 다음 2마이크로리터의 샘플을 실행하여 형광계에서 마이크로리터당 나노그램 단위의 선형 플라스미드 농도를 결정합니다. 500 마이크로리터 튜브에서 2 마이크로리터의 SP6 효소 혼합물에 10 마이크로리터의 2X NTP/CAP, 2 마이크로리터의 10X 반응 완충액, 0.1 내지 1 마이크로그램의 선형 DNA 주형을 결합하여 SP6 mRNA 생산을 설정합니다.
RNAse가 없는 물로 최대 20마이크로리터의 반응을 채우고 섭씨 37도에서 배양하기 전에 혼합합니다. 2 시간 후, 1 마이크로 리터의 DNAse를 첨가하고, 잘 섞고, 추가로 15 분 동안 배양한다. 30 마이크로리터의 염화리튬 침전 용액을 첨가하여 반응을 중지시킨다.
밤새 섭씨 영하 20도에서 섞고 식히십시오. 다음날, 용액을 원심분리하여 mRNA를 펠릿화하고 상청액을 흡인하기 전에 펠릿을 1밀리리터의 80% 에탄올로 세척합니다. 펠릿을 자연 건조하고 20마이크로리터의 RNAse가 없는 물에 재현탁합니다.
형광측정기를 사용하여 mRNA 농도를 측정한 다음 튜브당 mRNA 100나노그램을 일회용으로 분취하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 반응을 수행하기 위해 P5E, PME 및 P3E의 각각 10 펨토몰과 대상 벡터 PDEST의 20 펨토몰을 수집합니다. 플라스미드 소스에서 4개의 벡터와 염기쌍의 크기를 모두 식별합니다.
DNA의 무게를 몰당 660g으로 사용하고 플라스미드 크기 및 염기쌍을 사용하여 4개 벡터 모두의 농도를 결정한 후 진입 벡터의 경우 10펨토몰 또는 대상 벡터의 경우 20펨토몰에 도달하는 데 필요한 플라스미드의 총 나노그램을 계산합니다. 다음으로, 원고에 설명된 구성 요소를 사용하여 구조 sox17:EGFP-CAAX를 생성합니다. 플라스미드 농도를 사용하여 10 펨토몰 또는 20 펨토몰에 도달하는 데 필요한 각 플라스미드의 총 마이크로리터를 계산한 다음 이를 2로 나누어 5마이크로리터 반 LR 반응에 사용합니다.
P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A)의 10펨토몰 및 대상 벡터의 20펨토몰을 생성합니다. 500마이크로리터 튜브에서 P5E, PME, P3E 및 PDEST의 부피를 결합하여 5마이크로리터 절반 LR 반응을 설정합니다. 그런 다음 멸균 수를 넣어 부피를 4 마이크로 리터로 만듭니다.
반응물에 1마이크로리터를 추가하기 전에 LR 효소 혼합물을 각각 1분 동안 두 번 소용돌이하고 섭씨 25도에서 배양하기 전에 완전히 혼합합니다. 다음날, 0.5 마이크로 리터의 단백질 분해 효소 K.Incubate를 섭씨 37도에서 10 분 동안 첨가 한 다음 실온으로 냉각하여 LR 반응을 중지하십시오. 다음으로, 플라스미드를 첨가하고 세포를 25 내지 30분 동안 얼음 위에 방치함으로써 플라스미드 3 내지 4 마이크로리터를 해동된 화학적으로 유능한 세포로 변형시킨다.
그런 다음 섭씨 42도의 수조에서 30초 동안 세포를 열 충격합니다. 열 충격 후 250마이크로리터의 항생제가 없는 풍부한 액체 배지를 세포에 넣고 섭씨 37도에서 1.5시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 하나의 암피실린 Luria-Bertani 플레이트에 300 마이크로 리터의 박테리아 현탁액을 뿌리고 밤새 배양합니다.
다음 날, 두 가지 표현형이 있는지 콜로니를 스크리닝합니다: 투명 및 불투명. 투명한 콜로니를 한 번에 하나씩 골라 액체 배양액을 접종하고 섭씨 37도에서 밤새 흔든다. 플라스미드 150 나노그램, 트랜스포이즈아제 mRNA 100 나노그램, 2% 페놀 레드를 얼음 위에 올려 놓습니다.
그런 다음 RNA가 없는 물을 추가하여 부피를 3마이크로리터로 만듭니다. 이식 피펫을 사용하여 한 세포 단계 배아를 EM으로 채워진 주입 플레이트에 이식하고 한천을 완전히 덮은 다음 주입 플레이트의 슬롯 당 약 50-75 개의 배아를 부드럽게 누릅니다. mRNA 플라스미드 페놀 레드 혼합물을 모세관 주사 바늘의 열린 끝에 추가합니다.
모세관 바늘을 사출 장비 전기자에 놓고 사출 장비를 켭니다. 바늘을 주입판으로 내리고 집게를 사용하여 팁을 부수어 주입 장비에서 소량의 혼합물만 펌핑할 수 있도록 합니다. mRNA 플라스미드 페놀 레드 혼합물의 3나노리터 볼루스를 배아의 세포체에 주입합니다.
완료되면 주입 플레이트에서 배아를 슬롯에서 부드럽게 꺼내 제거하고 신선한 EM이 있는 100mm 페트리 접시에 피펫팅하여 옮깁니다. 섭씨 28.5도에서 배양하십시오. 형광 이식유전자 발현을 위한 적절한 발달 단계를 선택하고 형광 해부 현미경으로 스크리닝합니다. 유전자 Cmlc2에 대한 심장 특이적 프로모터에 의해 구동되는 GFP와 같은 형광 형질전환 마커를 스크리닝하여 비형광 이식유전자를 스크리닝합니다.
형질전환 삽입에 양성인 배아가 성체로 발달하여 번식기에 도달하면 야생형 제브라피쉬로 번식하여 생식계열 전파 및 형질전환 유전자 발현성을 개별적으로 선별합니다. LR 재조합의 형질전환으로부터 얻어진 박테리아 콜로니의 예가 도시되어 있다. 투명한 콜로니는 85% 이상 정확한 LR 재조합 산물을 함유한 반면, 불투명한 콜로니는 올바른 재조합 산물을 포함하지 않았습니다.
LR 재조합 산물의 형질전환으로부터 3개의 콜로니의 진단적 소화는 단일 불투명 콜로니가 어떠한 플라스미드도 함유하지 않은 반면, 2개의 투명 콜로니는 9, 544 염기쌍에서 단일 밴드를 함유하는 것으로 나타났다. 1, 950 염기쌍에서의 트랜스포이즈아제 mRNA가 여기에 제시되어 있다. 모자이크 내배엽 EGFP-CAAX 발현은 주입된 배아의 75%에서 관찰되었다.
발달 중인 심장에서 EGFP의 형질전환 마커인 Cmlc2의 발현은 수정 후 24시간에 관찰되었다. 성체 제브라피쉬는 sox17:EGFP-CAAX의 생식계열 전달을 가지고 있었고 내배엽은 EGFP-CAAX로 완전히 표지된 형광 배아를 생성했습니다. 내배엽의 전후부 길이 및 각 파우치의 등-복부 길이 1 내지 5 둘 다를 대조군 및 에탄올 처리된 야생형 BMP 돌연변이 배아에서 측정하였다.
내배엽의 전체 길이는 유전자형이나 치료에 영향을 받지 않았습니다. 그러나, 파우치 1 및 3은 처리되지 않은 야생형 배아와 에탄올 처리된 야생형 배아 사이에서 파우치 길이에서 유의한 증가를 보였지만, 처리되지 않은 BMP 돌연변이체와 에탄올 처리된 BMP 돌연변이체 사이에서는 길이가 유의하게 감소하였다. 파우치 2는 각각 처리되지 않은 야생형 및 BMP 돌연변이 그룹과 에탄올 처리된 군에서 파우치 크기의 현저한 증가를 보였다.
이 절차를 시도할 때 Tol2 시스템의 피펫팅 및 희석과 배아 주입 중 세포체에 부딪히는 것을 정밀하게 하는 것이 중요합니다.
