Os peixes-zebra transgênicos têm se mostrado fundamentais para nossa compreensão do desenvolvimento embrionário. O sistema Tol2 é uma ferramenta versátil que permite aos pesquisadores gerar de forma rápida e sistemática múltiplos peixes-zebra transgênicos para estudos de FASD. O design modular e a facilidade de gerar novos componentes do kit tornam o sistema Tol2 uma ferramenta versátil para gerar novos transgênicos sem ter que redesenhar nenhum componente do kit.
Meu conselho aos pesquisadores que realizam essa técnica pela primeira vez é fazer vários testes para treinar a precisão de gerar e injetar construções transgênicas. Para começar, linearize o plasmídeo do kit Tol2 contendo transposase com uma endonuclease de restrição nought one combinando 10 microlitros de plasmídeo transposase, 1,5 microlitros de tampão de reação de endonuclease de restrição e 0,3 microlitros de endonuclease nought one endonuclease em um tubo de microcentrífuga de 500 microlitros. Encha a reação até 20 microlitros com água sem RNAse.
Misture e digerir a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, interrompa a digestão adicionando um microlitro de EDTA 0,5 molar, dois microlitros de acetato de amônio cinco molares e 80 microlitros de etanol 100% à mistura de reação. Misture e resfrie a menos 20 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, centrifugar e aspirar o sobrenadante antes de ressuspender a pelota de DNA em água livre de RNAse. Em seguida, determine a concentração de plasmídeo linear em nanogramas por microlitro em um fluorômetro executando dois microlitros da amostra. Configure a produção de mRNA SP6 combinando 10 microlitros de 2X NTP/CAP, dois microlitros de tampão de reação 10X, 0,1 a um micrograma de molde de DNA linear em dois microlitros de mistura enzimática SP6 em um tubo de 500 microlitros.
Encha a reação até 20 microlitros com água sem RNAse e misture antes de incubar a 37 graus Celsius. Após duas horas, adicione um microlitro de DNAse, misture bem e incube por mais 15 minutos. Pare a reação adicionando 30 microlitros de solução de precipitação de cloreto de lítio.
Misture e resfrie a menos 20 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, centrifugar a solução para pellet do mRNA e aspirar o sobrenadante antes de lavar o pellet com um mililitro de etanol 80%. Seque o pellet ao ar e ressuspenda-o em 20 microlitros de água livre de RNAse.
Determine a concentração de mRNA usando um fluorômetro e, em seguida, alíquota 100 nanogramas de mRNA por tubo para uso único e armazene a menos 80 graus Celsius. Para realizar a reação, reunir 10 femtomole cada de P5E, PME e P3E e 20 femtomole do vetor de destino PDEST. Identificar o tamanho de todos os quatro vetores e pares de bases da fonte de plasmídeo.
Depois de determinar a concentração de todos os quatro vetores, usando o peso do DNA como 660 gramas por mol e tamanho do plasmídeo e pares de bases, calcule o total de nanogramas de plasmídeo necessários para atingir 10 femtomole para vetores de entrada ou 20 femtomole para vetor de destino. Em seguida, gere o construto sox17:EGFP-CAAX usando os componentes descritos no manuscrito. Usando a concentração plasmidial, calcule o total de microlitros de cada plasmídeo necessário para atingir 10 femtomole ou 20 femtomole e, em seguida, divida isso por dois para o uso nas reações de cinco microlitros de meio LR.
Gerar 10 femtomole de P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) e 20 femtomole do vetor de destino. Configure cinco microlitros de reação meio LR combinando os volumes do P5E, PME, P3E e PDEST em um tubo de 500 microlitros. Em seguida, adicione água estéril para fazer o volume de quatro microlitros.
Vórtice a enzima LR misturar duas vezes por um minuto cada antes de adicionar um microlitro à reação e misturar completamente antes de incubar a 25 graus Celsius. No dia seguinte, pare a reação LR adicionando 0,5 microlitros de proteinase K.Incube a 37 graus Celsius por 10 minutos e depois resfrie até a temperatura ambiente. Em seguida, transforme três a quatro microlitros do plasmídeo em células quimicamente competentes descongeladas, adicionando o plasmídeo e deixando as células ficarem no gelo por 25 a 30 minutos.
Em seguida, choque térmico as células em banho-maria de 42 graus Celsius por 30 segundos. Após o choque térmico, adicione 250 microlitros de meio líquido rico sem antibióticos às células e incube com agitação a 37 graus Celsius por 1,5 horas. Espalhe 300 microlitros de suspensão bacteriana em uma placa de ampicilina Luria-Bertani e incube durante a noite.
No dia seguinte, rastreie as colônias para a presença de dois fenótipos: claro e opaco. Escolha as colônias claras, uma de cada vez, inocular a cultura líquida e agite a 37 graus Celsius durante a noite. Combine 150 nanogramas de plasmídeo, 100 nanogramas de mRNA de transposase e 2% de vermelho de fenol no gelo.
Em seguida, adicione água sem RNA para fazer o volume de três microlitros. Transfira um embrião em estágio celular usando pipetas de transferência para a placa de injeção preenchida com EM cobrindo completamente o ágar e, em seguida, pressione suavemente aproximadamente 50 a 75 embriões por slot da placa de injeção. Adicione a mistura de vermelho de fenol plasmidial de mRNA à extremidade aberta de uma agulha de injeção capilar.
Coloque a agulha capilar na armadura da plataforma de injeção e ligue a plataforma de injeção. Abaixe a agulha para dentro da placa de injeção e quebre a ponta usando pinças para permitir que apenas uma pequena quantidade de mistura seja bombeada para fora pelo equipamento de injeção. Injetar os embriões com um bolus de três nanolitros da mistura vermelha de fenol plasmidial de mRNA no corpo celular do embrião.
Quando terminar, remova os embriões da placa de injeção retirando-os suavemente da ranhura e transfira-os para uma placa de Petri de 100 milímetros com EM fresco. Incubar a 28,5 graus Celsius. Escolha o estágio de desenvolvimento apropriado para a expressão de transgenes fluorescentes e faça a triagem em um microscópio dissecante fluorescente. Triagem de transgenes não fluorescentes por triagem de marcadores transgênicos fluorescentes, como GFP, impulsionada pelo promotor cardíaco-específico para o gene Cmlc2.
Quando os embriões positivos para inserção transgênica se desenvolverem em adultos e atingirem a idade reprodutiva, selecione-os individualmente para transmissão germinativa e expressividade transgênica, reproduzindo-os para peixes-zebra selvagens. Exemplos de colônias bacterianas obtidas a partir da transformação da recombinação LR são mostrados. As colônias claras continham um produto de recombinação LR correto mais de 85% do tempo, enquanto as colônias opacas nunca continham um produto de recombinação correto.
A digestão diagnóstica das três colônias a partir da transformação dos produtos da recombinação LR mostrou que a única colônia opaca não continha nenhum plasmídeo, enquanto as duas colônias claras continham uma única banda em 9.544 pares de bases. O mRNA transposase em 1, 950 pares de bases é mostrado aqui. A expressão do EGFP-CAAX no endoderme em mosaico foi observada em 75% dos embriões injetados.
A expressão transgênica do EGFP Cmlc2 no coração em desenvolvimento foi observada 24 horas após a fecundação. Zebrafish adultos tiveram transmissão germinativa de embriões fluorescentes gerados por sox17:EGFP-CAAX com a endoderme totalmente marcada com EGFP-CAAX. Tanto o comprimento anteroposterior da endoderme quanto o comprimento dorso-ventral de cada bolsa das bolsas um a cinco foram medidos em embriões mutantes de BMP selvagens do tipo controle e tratados com etanol.
O comprimento total da endoderme não foi afetado pelo genótipo ou tratamento. No entanto, as bolsas um e três mostraram aumentos significativos no comprimento da bolsa entre embriões selvagens não tratados e tratados com etanol, mas diminuições significativas no comprimento entre mutantes BMP não tratados e tratados com etanol. A bolsa dois mostrou aumentos significativos no tamanho da bolsa entre os grupos selvagem não tratado e tratado com etanol e mutante BMP, respectivamente.
Ao tentar este procedimento, é fundamental ser preciso na pipetagem e diluição do sistema Tol2, bem como atingir o corpo celular durante a injeção do embrião.
