أثبتت أسماك الزرد المعدلة وراثيا أهميتها لفهمنا لتطور الجنين. نظام Tol2 هو أداة متعددة الاستخدامات تمكن الباحثين من توليد العديد من أسماك الزرد المعدلة وراثيا بسرعة وبشكل منهجي لدراسات FASD. يجعل التصميم المعياري وسهولة توليد مكونات مجموعة جديدة من نظام Tol2 أداة متعددة الاستخدامات لتوليد جينات محورة جديدة دون الحاجة إلى إعادة تصميم أي مكونات للمجموعة.
نصيحتي للباحثين الذين يقومون بهذه التقنية لأول مرة هي إجراء العديد من التجارب للتدريب على دقة توليد وحقن التركيبات المعدلة وراثيا. للبدء ، قم بخطي بلازميد مجموعة Tol2 التي تحتوي على ترانسبوزاز مع نوكلياز داخلي مقيد من خلال الجمع بين 10 ميكرولتر من بلازميد الترانسبوزاز ، و 1.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل النوكلياز الداخلي للتقييد ، و 0.3 ميكرولتر من نوكلياز واحد في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 500 ميكرولتر. املأ التفاعل حتى 20 ميكرولترا بالماء الخالي من الحمض النووي الريبي.
تخلط وتهضم عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، أوقف عملية الهضم بإضافة ميكرولتر واحد من 0.5 مولار EDTA ، واثنين ميكرولتر من خمسة أسيتات الأمونيوم المولية ، و 80 ميكرولتر من الإيثانول 100٪ إلى خليط التفاعل. تخلط وتبرد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل.
في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي واستنشاق المادة الطافية قبل تعليق حبيبات الحمض النووي في الماء الخالي من الحمض النووي الريبي. ثم حدد تركيز البلازميد الخطي بالنانوجرام لكل ميكرولتر على مقياس الفلورومتر عن طريق تشغيل ميكرولتر من العينة. قم بإعداد إنتاج SP6 mRNA من خلال الجمع بين 10 ميكرولتر من 2X NTP / CAP ، واثنين من ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل 10X ، و 0.1 إلى ميكروغرام واحد من قالب الحمض النووي الخطي في ميكرولتر من مزيج إنزيم SP6 في أنبوب 500 ميكرولتر.
املأ التفاعل حتى 20 ميكرولترا بالماء الخالي من الحمض النووي الريبي واخلطه قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية. بعد ساعتين ، أضف ميكرولتر واحد من DNAse ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة إضافية. أوقف التفاعل بإضافة 30 ميكرولترا من محلول ترسيب كلوريد الليثيوم.
تخلط وتبرد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي محلول لحبيبات mRNA ونضح المادة الطافية قبل غسل الحبيبات بمليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 80٪. جفف الحبيبات في الهواء وأعد تعليقها في 20 ميكرولترا من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي.
أوجد تركيز الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) باستخدام مقياس الفلورومتر، ثم قلص 100 نانوجرام من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) لكل أنبوب للاستخدام مرة واحدة، ثم خزن عند درجة حرارة 80 درجة سلزية تحت الصفر. لإجراء التفاعل ، اجمع 10 فيمتومول لكل من P5E و PME و P3E و 20 فيمتومول من ناقل الوجهة PDEST. حدد حجم جميع المتجهات الأربعة وأزواج القواعد من مصدر البلازميد.
بعد تحديد تركيز جميع النواقل الأربعة، باستخدام وزن الحمض النووي (DNA) على أنه 660 جراما لكل مول وحجم البلازميد وأزواج القواعد، احسب إجمالي نانوجرام من البلازميد اللازم للوصول إما إلى 10 فيمتومول لناقلات الدخول أو 20 فيمتومول للمتجه الوجهة. بعد ذلك ، قم بإنشاء البناء sox17: EGFP-CAAX باستخدام المكونات الموضحة في المخطوطة. باستخدام تركيز البلازميد، احسب إجمالي الميكرولترات لكل بلازميد مطلوب للوصول إلى 10 فيمتومول أو 20 فيمتومول، ثم اقسم هذا على اثنين للاستخدام في تفاعلات نصف الميكرولتر LR الخمسة.
توليد 10 فيمتومول من P5E sox17 و PME EGFP-CAAX و P3E Poly (A) و 20 فيمتومول من ناقل الوجهة. قم بإعداد تفاعل خمسة ميكرولتر نصف LR من خلال الجمع بين أحجام P5E و PME و P3E و PDEST في أنبوب سعة 500 ميكرولتر. ثم أضف الماء المعقم لجعل الحجم أربعة ميكرولتر.
دوامة يخلط إنزيم LR مرتين لمدة دقيقة واحدة لكل منهما قبل إضافة ميكرولتر واحد إلى التفاعل ويخلط جيدا قبل الحضانة عند 25 درجة مئوية. في اليوم التالي ، أوقف تفاعل LR بإضافة 0.5 ميكرولتر من البروتيناز K.Incubate عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتحويل ثلاثة إلى أربعة ميكرولترات من البلازميد إلى خلايا مذابة ذات كفاءة كيميائية عن طريق إضافة البلازميد وترك الخلايا تجلس على الجليد لمدة 25 إلى 30 دقيقة.
ثم صدم الخلايا الحرارية في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. بعد الصدمة الحرارية ، أضف 250 ميكرولترا من الوسائط السائلة الغنية الخالية من المضادات الحيوية إلى الخلايا واحتضانها بالاهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. نشر 300 ميكرولتر من تعليق البكتيريا على لوحة أمبيسلين لوريا بيرتاني واحتضان بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي ، قم بفحص المستعمرات بحثا عن وجود نمطين ظاهريين: واضح وغير شفاف. اختر المستعمرات الصافية واحدة تلو الأخرى ، وقم بتلقيح الثقافة السائلة ، ورجها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. اجمع بين 150 نانوجرام من البلازميد و 100 نانوجرام من الحمض النووي الريبوزي المرسال الترانسبوزاز و 2٪ فينول أحمر على الجليد.
ثم أضف الماء الخالي من الحمض النووي الريبي لجعل الحجم ثلاثة ميكرولتر. انقل جنينا في مرحلة خلية واحدة باستخدام ماصات النقل إلى لوحة الحقن المملوءة ب EM التي تغطي الآجار بالكامل ثم اضغط برفق على ما يقرب من 50 إلى 75 جنينا لكل فتحة من لوحة الحقن. أضف خليط الفينول الأحمر البلازميد mRNA إلى الطرف المفتوح لإبرة حقن الشعيرات الدموية.
ضع الإبرة الشعرية في حديد التسليح بجهاز الحقن وقم بتشغيل جهاز الحقن. اخفض الإبرة في لوحة الحقن وكسر الطرف باستخدام ملقط للسماح بضخ كمية صغيرة فقط من الخليط بواسطة جهاز الحقن. حقن الأجنة ببلعة نانولتر من خليط الفينول الأحمر البلازميد mRNA في جسم خلية الجنين.
عند الانتهاء ، قم بإزالة الأجنة من لوحة الحقن عن طريق إخراجها برفق من الفتحة ونقل ماصة إلى طبق بتري 100 ملم مع EM طازج. احتضان عند 28.5 درجة مئوية. اختر المرحلة التنموية المناسبة للتعبير الفلوري عن الجينات المحورة وفحصها تحت مجهر تشريح الفلورسنت. فحص جينات التحوير غير الفلورية عن طريق فحص العلامات الفلورية المعدلة وراثيا مثل GFP التي يقودها المروج الخاص بالقلب للجين Cmlc2.
عندما تتطور الأجنة الإيجابية للإدخال الوراثي إلى البالغين وتصل إلى سن التكاثر ، قم بفحصها بشكل فردي بحثا عن انتقال الخط الجرثومي والتعبير الجيني عن طريق تكاثرها إلى الزرد من النوع البري. يتم عرض أمثلة على المستعمرات البكتيرية التي تم الحصول عليها من تحول إعادة تركيب LR. احتوت المستعمرات الواضحة على منتج إعادة تركيب LR صحيح أكثر من 85٪ من الوقت ، في حين أن المستعمرات غير الشفافة لم تحتوي أبدا على منتج إعادة التركيب الصحيح.
أظهر الهضم التشخيصي للمستعمرات الثلاث من تحول منتجات إعادة التركيب LR أن المستعمرة المفردة غير الشفافة لا تحتوي على أي بلازميد ، بينما احتوت المستعمرتان الواضحتان على شريط واحد عند 9،544 زوج قاعدة. يظهر هنا الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) عند 1،950 زوج من القواعد. لوحظ تعبير الأديم الباطن الفسيفسائي EGFP-CAAX في 75٪ من الأجنة المحقونة.
لوحظ تعبير علامة معدلة وراثيا ل Cmlc2 EGFP في القلب النامي بعد 24 ساعة من الإخصاب. كان لدى أسماك الزرد البالغة انتقال جرثومي ل sox17: EGFP-CAAX ولدت أجنة فلورية مع الأديم الباطن المسمى بالكامل ب EGFP-CAAX. تم قياس كل من الطول الأمامي الخلفي للأديم الباطن والطول الظهري البطني لكل كيس من الأكياس من واحد إلى خمسة في الأجنة الطافرة BMP من النوع البري المعالج بالإيثانول.
لم يتأثر الطول الكلي للأديم الباطن بالنمط الجيني أو العلاج. ومع ذلك ، أظهرت الأكياس الأولى والثالثة زيادات كبيرة في طول الحقيبة بين الأجنة البرية غير المعالجة والمعالجة بالإيثانول ، ولكن هناك انخفاضات كبيرة في الطول بين طفرات BMP غير المعالجة والمعالجة بالإيثانول. أظهرت الحقيبة الثانية زيادات كبيرة في حجم الحقيبة بين النوع البري غير المعالج والمعالج بالإيثانول والمجموعات الطافرة BMP على التوالي.
عند محاولة هذا الإجراء ، من الأهمية بمكان أن تكون دقيقا في سحب وتخفيف نظام Tol2 ، وكذلك ضرب جسم الخلية أثناء حقن الجنين.
