Transgene Zebrafische haben sich als entscheidend für unser Verständnis der Embryonalentwicklung erwiesen. Das Tol2-System ist ein vielseitiges Werkzeug, das es Forschern ermöglicht, schnell und systematisch mehrere transgene Zebrafische für FASD-Studien zu generieren. Der modulare Aufbau und die einfache Generierung neuer Kit-Komponenten machen das Tol2-System zu einem vielseitigen Werkzeug für die Generierung neuer Transgenetik, ohne dass Komponenten des Kits neu entworfen werden müssen.
Mein Rat an Forscher, die diese Technik zum ersten Mal anwenden, ist, mehrere Testläufe durchzuführen, um die Präzision der Erzeugung und Injektion transgener Konstrukte zu trainieren. Linearisieren Sie zunächst das Tol2-Kit-Plasmid, das Transposase enthält, mit einer Endonuklease mit einer Restriktionsendonuklease von null, indem 10 Mikroliter Transposase-Plasmid, 1,5 Mikroliter Restriktionsendonuklease-Reaktionspuffer und 0,3 Mikroliter Null-Eins-Endonuklease in einem 500-Mikrozentrifugen-Röhrchen kombiniert werden. Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 Mikroliter mit RNAse-freiem Wasser.
Mischen und bei 37 Grad Celsius über Nacht verdauen. Stoppen Sie am nächsten Tag den Aufschluss, indem Sie dem Reaktionsgemisch einen Mikroliter 0,5 molaren EDTA, zwei Mikroliter fünfmolaren Ammoniumacetat und 80 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzufügen. Mixen und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius kalt stellen.
Zentrifugieren und aspirieren Sie den Überstand am nächsten Tag, bevor Sie das DNA-Pellet in RNAse-freiem Wasser resuspendieren. Bestimmen Sie dann die lineare Plasmidkonzentration in Nanogramm pro Mikroliter auf einem Fluorometer, indem Sie zwei Mikroliter der Probe laufen lassen. Richten Sie die SP6-mRNA-Produktion ein, indem Sie 10 Mikroliter 2X NTP/CAP, zwei Mikroliter 10X-Reaktionspuffer, 0,1 bis ein Mikrogramm lineare DNA-Matrize in zwei Mikrolitern SP6-Enzymmischung in einem 500-Mikroliter-Röhrchen kombinieren.
Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 Mikroliter mit RNAse-freiem Wasser und mischen Sie sie vor der Inkubation bei 37 Grad Celsius. Nach zwei Stunden einen Mikroliter DNAse hinzufügen, gut mischen und weitere 15 Minuten inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 30 Mikroliter Lithiumchlorid-Fällungslösung hinzufügen.
Mixen und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius kalt stellen. Zentrifugieren Sie am nächsten Tag die Lösung, um die mRNA zu pelletieren, und saugen Sie den Überstand an, bevor Sie das Pellet mit einem Milliliter 80%igem Ethanol waschen. Trocknen Sie das Pellet an der Luft und resuspendieren Sie es in 20 Mikrolitern RNAse-freiem Wasser.
Bestimmen Sie die mRNA-Konzentration mit einem Fluorometer, aliquotieren Sie dann 100 Nanogramm mRNA pro Röhrchen für den einmaligen Gebrauch und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Um die Reaktion durchzuführen, sammeln Sie jeweils 10 Femtomole von P5E, PME und P3E und 20 Femtomol des Zielvektors PDEST. Bestimmen Sie die Größe aller vier Vektoren und Basenpaare aus der Plasmidquelle.
Nachdem Sie die Konzentration aller vier Vektoren unter Verwendung des Gewichts der DNA von 660 Gramm pro Mol und der Plasmidgröße und der Basenpaare bestimmt haben, berechnen Sie die gesamten Nanogramm Plasmid, die benötigt werden, um entweder 10 Femtomol für Eintrittsvektoren oder 20 Femtomol für Zielvektoren zu erreichen. Als nächstes generieren Sie das Konstrukt sox17:EGFP-CAAX unter Verwendung der im Manuskript beschriebenen Komponenten. Berechnen Sie anhand der Plasmidkonzentration die gesamten Mikroliter jedes Plasmids, die benötigt werden, um entweder 10 Femtomol oder 20 Femtomol zu erreichen, und teilen Sie diese dann durch zwei für die Verwendung in den Fünf-Mikroliter-Halb-LR-Reaktionen.
Erzeugen Sie 10 Femtomol P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) und 20 Femtomol Zielvektor. Richten Sie eine fünf-Mikroliter-Halb-LR-Reaktion ein, indem Sie die Volumina von P5E, PME, P3E und PDEST in einem 500-Mikroliter-Röhrchen kombinieren. Fügen Sie dann steriles Wasser hinzu, um das Volumen auf vier Mikroliter zu erhöhen.
Wirbeln Sie die LR-Enzymmischung zweimal für jeweils eine Minute vortex, bevor Sie der Reaktion einen Mikroliter hinzufügen, und mischen Sie sie gründlich, bevor Sie bei 25 Grad Celsius inkubieren. Stoppen Sie am nächsten Tag die LR-Reaktion durch Zugabe von 0,5 Mikrolitern Proteinase K.10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen. Als nächstes wandeln Sie drei bis vier Mikroliter des Plasmids in aufgetaute chemisch kompetente Zellen um, indem Sie das Plasmid hinzufügen und die Zellen 25 bis 30 Minuten auf Eis ruhen lassen.
Anschließend werden die Zellen in einem 42 Grad Celsius warmen Wasserbad für 30 Sekunden erhitzt. Nach dem Hitzeschock 250 Mikroliter antibiotikafreie, reichhaltige flüssige Medien in die Zellen geben und unter Schütteln bei 37 Grad Celsius 1,5 Stunden inkubieren. Verteilen Sie 300 Mikroliter Bakteriensuspension auf einer Ampicillin-Luria-Bertani-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht.
Untersuchen Sie die Kolonien am nächsten Tag auf das Vorhandensein von zwei Phänotypen: klar und undurchsichtig. Pflücken Sie die klaren Kolonien nacheinander, beimpfen Sie die Flüssigkultur und schütteln Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Kombinieren Sie 150 Nanogramm Plasmid, 100 Nanogramm Transposase-mRNA und 2 % Phenolrot auf Eis.
Fügen Sie dann RNA-freies Wasser hinzu, um das Volumen auf drei Mikroliter zu erhöhen. Übertragen Sie einen Embryo im Zellstadium mit Transferpipetten auf die mit EM gefüllte Injektionsplatte, die den Agar vollständig bedeckt, und drücken Sie dann vorsichtig etwa 50 bis 75 Embryonen pro Schlitz der Injektionsplatte. Geben Sie die mRNA-Plasmid-Phenolrot-Mischung auf das offene Ende einer Kapillarinjektionsnadel.
Setzen Sie die Kapillarnadel in die Armatur der Injektionsanlage ein und schalten Sie die Injektionsanlage ein. Senken Sie die Nadel in die Injektionsplatte und brechen Sie die Spitze mit einer Pinzette, damit nur eine kleine Menge des Gemisches von der Injektionsanlage abgepumpt werden kann. Injizieren Sie den Embryonen einen drei Nanoliter großen Bolus der mRNA-Plasmid-Phenol-Rot-Mischung in den Zellkörper des Embryos.
Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Embryonen von der Injektionsplatte, indem Sie sie vorsichtig aus dem Schlitz nehmen und pipettieren Sie sie in eine 100-Millimeter-Petrischale mit frischem EM. Inkubieren bei 28,5 Grad Celsius. Wählen Sie das geeignete Entwicklungsstadium für die Fluoreszenztransgenexpression aus und screenen Sie es unter einem Fluoreszenzpräparationsmikroskop. Screening auf nicht-fluoreszierende Transgene durch Screening auf fluoreszierende transgene Marker wie GFP, die durch den kardialen Promotor für das Gen Cmlc2 gesteuert werden.
Wenn sich die Embryonen, die für die transgene Insertion positiv sind, zu erwachsenen Embryonen entwickeln und das Zuchtalter erreichen, werden sie einzeln auf Keimbahnübertragung und Transgenexpressivität untersucht, indem sie mit Wildtyp-Zebrafischen verpaart werden. Beispielhaft werden Bakterienkolonien gezeigt, die aus der Transformation der LR-Rekombination gewonnen wurden. Klare Kolonien enthielten in mehr als 85 % der Fälle ein korrektes LR-Rekombinationsprodukt, während undurchsichtige Kolonien nie ein korrektes Rekombinationsprodukt enthielten.
Die diagnostische Verdauung der drei Kolonien aus der Transformation der LR-Rekombinationsprodukte zeigte, dass die einzelne opake Kolonie kein Plasmid enthielt, während die beiden klaren Kolonien eine einzelne Bande bei 9,544 Basenpaaren enthielten. Die Transposase-mRNA bei 1,950 Basenpaaren ist hier dargestellt. Die Expression des Mosaik-Endoderms EGFP-CAAX wurde bei 75% der injizierten Embryonen beobachtet.
Die transgene Markerexpression von Cmlc2 EGFP im sich entwickelnden Herzen wurde 24 Stunden nach der Befruchtung beobachtet. Adulte Zebrafische wiesen eine Keimbahnübertragung von sox17:EGFP-CAAX erzeugten fluoreszierenden Embryonen auf, wobei das Endoderm vollständig mit EGFP-CAAX markiert war. Sowohl die anterior-posteriore Länge des Endoderms als auch die dorsal-ventrale Länge jedes Beutels aus den Beuteln eins bis fünf wurden in Kontroll- und Ethanol-behandelten Wildtyp-BMP-mutierten Embryonen gemessen.
Die Gesamtlänge des Endoderms wurde weder durch den Genotyp noch durch die Behandlung beeinflusst. Die Beutel eins und drei zeigten jedoch eine signifikante Zunahme der Beutellänge zwischen unbehandelten und mit Ethanol behandelten Wildtyp-Embryonen, aber eine signifikante Abnahme der Länge zwischen unbehandelten und ethanolbehandelten BMP-Mutanten. Beutel zwei zeigte signifikante Anstiege der Beutelgröße zwischen der unbehandelten und der ethanolbehandelten Wildtyp- bzw. BMP-Mutantengruppe.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, beim Pipettieren und Verdünnen des Tol2-Systems sowie beim Berühren des Zellkörpers während der Embryoinjektion präzise vorzugehen.
