תפקוד לקוי של לוקוס קורוליאוס היה מעורב בהפרעות נוירולוגיות ונוירופסיכיאטריות, כולל מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, דיכאון, הפרעה דו קוטבית וחרדה. בהתחשב בתפקידים אלה, ניתוח של לוקוס coeruleus הוא חיוני כדי ללמוד את תפקודו ואת תפקוד לקוי. במהלך ניתוח המוח של העכבר, ניתן לפספס בקלות את הלוקוס קורוליאוס בחלקים של קורונטל או קשת בשל גודלו הקטן.
לכן, כדי להציע הדרכה עבור לוקליזציה של לוקוס coeruleus, אנו מתארים פרוטוקול שפיתחנו כדי לאתר את האזור הזה במוח העכבר עבור מספר יישומים. התחל על ידי הצבת מוח מבודד טרי של עכבר הרדמה ולאחר מכן מנוון ב 4% PFA בצינור 50 מיליליטר. דגירה המוח במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.
השתמש במקלפים כדי להעביר את המוח לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר מלא 25 מיליליטר של 30% פתרון סוכרוז. דגירה זה בארבע מעלות צלזיוס במשך 48 עד 72 שעות עד המוח שוקע לתחתית הצינור. כדי להטמיע את החלק של גזע המוח, מניחים את המשטח החתוך שלו בתחתית תבנית הטבעה, ומוסיפים תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית כדי להקיף את גזע המוח.
להקפיא את המוח המוטבע במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס לפחות 12 שעות עד לשימוש נוסף. מניחים את התבנית עם המוח לתוך cryostat ו דגירה אותו במשך כמה שעות כדי להתאים את הטמפרטורה שלה לזה של קריוסטט. כדי לחשוף את בלוק OCT המכיל את המוח, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את ארבעת הקצוות של התבנית כל הדרך לתחתית, ולאחר מכן לקלף את התבנית הטבעה ממנו.
השתמש בסכיני גילוח כדי להסיר עודף של OCT מפני השטח של הבלוק, הקפד לא לגעת במוח. ואז לעלות בלוק OCT על צ'אק של cryostat, חשיפת פני השטח החתוכים של המוח לכיוון החזית. כדי לכוונן את המוח, כוון את פני השטח החתוכים במקביל לסכיני הגילוח של ההקפאה.
כוון נכון של הדגימה הוא צעד מכריע בפרוטוקול זה. מכיוון שאנו משתמשים בתכונות אנטומיות של פני השטח הגביים של המוח כדי לאתר LC, כגון גבול בין המוח הקטן לקוליקולוס נחות, חשוב שהקטעים יהיו מיושרים כראוי. זה דורש טיפול כראוי הגדרת המוח לתוך מטריצת כלי פריסה במוח העכבר.
לקצץ את המוח החל medulla, חיתוך 100 מיקרומטר קטעים rostrally. לאחר המוח הקטן ואת brainstem להתחיל לחתוך כמו פרוסה רציפה אחת ברמה של החדר הרביעי, להתחיל לאסוף פרוסות בעובי 50 מיקרומטר. השתמש מדפים כדי לאסוף כל פרוסת מוח ול למקם אותו באר של צלחת 24 באר מלא PBS.
לוקוס coeruleus יהיה בולט ביותר בפרוסה שבה המוח הקטן קוליקולוס נחות לפגוש אחד את השני על 5.52 מילימטרים האחורי של bregma. ביום הראשון, לשטוף את פרוסות המוח בצלחת 24 היטב שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד PBS. לאחר מכן הוסיפו 0.5% PBS עם חומר ניקוי וחלחלו אליהם בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
למחרת, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם 0.5% PBSD. לאחר מכן מוסיפים את הנוגדן העיקרי בדילול של 1 עד 500 ב 0.5% PBSD ודגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. ביום השלישי, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם 0.5% PBSD, ולאחר מכן להוסיף את הנוגדן המשני בדילול של אחד עד 1000 ב 0.5% PBSD.
עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום ודגירה בארבע מעלות במשך 16 שעות. לאחר הדגירה, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם 0.5% PBSD, ולאחר מכן במשך חמש דקות PBS. לכסות את המקטעים באמצעות מדיום הרכבה קשה ללא DAPI.
מכסים בכיסוי זכוכית ויבשים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ קונפוקל עם הגדרות כדי לזהות אות מאורך גל פלואורסצנטי מתאים לפרוסות מוח תמונה. לאחר התאמת המיקרוסקופ למישור המוקדי של פרוסת המוח, יש להשתמש בהגדלה פי 10 כדי לצלם תמונה אחת.
השתמש בחדר הרביעי הממוקם מתחת למוח הקטן ומעל פונס ו גזע המוח כדי לאתר אזור LC אפשרי בפרוסת המוח. התמקדו בקצוות האופטיביים של החדר הרביעי וה- LC ימוקם החל משולי החדר הרביעי ויצביע לכיוון אזור גזע המוח של הפונס. התפלגות תאית של דופמין בטא הידרוקסילאז, חלבון לידי ביטוי LC, הוערך באמצעות פרוטוקול זה על מנת לחקור מורפולוגיה LC וצפיפות עצבית.
חלבון אחר לידי ביטוי LC, טירוסין hydroxylase, הראה גם אות פלואורסצנטי ירוק חזק בפרוסות המוח המכיל את LC.Changes בהוקמפוס מתכת נצפו לעתים קרובות בהפרעות נוירולוגיות, כולל שינויים ב- LC.In דוגמה זו, כאשר פרוסת מוח לחתוך דרך LC נמדד עבור פוספט, אשלגן, אבץ, ונחושת, רק נחושת הראה עלייה ספציפית של האות. אנו ממליצים לחתוך סביב 500 מיקרון יותר רקמה לפני ו אחורי LC, כדי למנוע החמצת הגרעין, וחיתוך חלקים רבים יותר מהנדרש, במיוחד אם בפעם הראשונה ביצוע פרוטוקול זה. מחקר זהיר של תמונות אטלס המוח לפני הכתמים הוא מאוד מועיל.
לאחר LC ממוקם על ידי immunohistochemistry, פרוסות המוח הסמוכות ניתן להשתמש למחקרים נוספים, כולל ניתוח מורפולוגי מטבולי, כמו גם מחקרי הדמיה מתכת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי רנטגן. חלקי המוח הנוצרים באמצעות הפרוטוקול המתואר יכולים לשמש לכימות רמות הנחושת ומתכות אחרות ב- LC ולהשוות אותן לרמות באזורים מחוץ ל- LC, אשר הכרחי להבנת מנגנון המחלה. יישומים אפשריים נוספים של פרוטוקול זה כוללים זיהוי של שפע והפצה תאית של דופמין בטא הידרוקסילאז, טירוסין הידרוקסילאז, וחלבונים אחרים לידי ביטוי LC בנפרד, או בבדיקות כתם משותף, מחקרים של מורפולוגיה LC וצפיפות עצבית.
