אנו מודים ו &#39;צימרמן לקבלת סיוע טכני מעולה לטיפול דגים. עבודה זו נתמכה על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע, מענק מספר: 310000_120611.

1. ציוד Set-up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלי העיקרי המשמש לביצוע cryoinjury הוא cryoprobe, מכשיר עט כזה עשוי נירוסטה (איור 1 א). ידית גלילי הוא 40 מ&quot;מ ארוך בעל קוטר של 8 מ&quot;מ. קצה המוליך הוא 6 מ&quot;מ אורך ו 0.8 מ&quot;מ בקוטר. צומת בין עצה לבין האחיזה הוא חרוטי 4 מ&quot;מ ארוכים. בנוסף, ידית cryoprobe צריך להיות מבודד עם צינור סרט פלסטיק כדי למנוע כוויות קור על האצבעות תוך כדי לחיצה על הכלי במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומרים אחרים שצריכים בהקפאה הם סטראו, מלקחיים חדות, מיקרו מספריים האביב הניתוח, פיפטה העברת פלסטיק. בנוסף להכין כוס של anesthetizing דגים כפית פלסטיק להעברת דגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הניתוח, דגים ממוקמות על ספוג לח עם למעלה בצד הגחון שלו (1B איור). להחזיק את החיה בהליך יציבה,חריץ המתאים יש לחתוך באופן ידני ספוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מיכל מים עם מערכת להעביר את הדג לאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת טיימר כפול 1 עם ספירה לאחור 2 10 ולאחר מכן באופן אוטומטי הספירה לאחור 24 2. </li></ol> 2. נוהל Cryoinjury <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצנן את cryoprobe ידי טבילה עצה 3-5 ס&quot;מ של חנקן נוזלי דקות לפחות 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים דג הזברה למבוגרים ידי immerging אותו tricaine 0.02% עד שהדג הופך על הגב שלה הזימים שלו כמעט להפסיק לנוע (כ -90 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הדג עם כפית פלסטיק ספוג לח כי נחתך להחזיק דג הפוך (1B איור). להחזיק דגים יציבה עם מלקחיים באמצעות הלא דומיננטית יד. מבחינה חזותית לאתר את שולי המדיאלי האחורי של הלב ולהשתמש מספריים iridectomy ישרים לנקב את העור. (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן (כ 2 מ&quot;מ) מעל הלב על ידי מ&quot;קtting ישר anteriorly דרך העור, השרירים (איור 1D). לא לחתוך את המנגנון branchial גרמית, כמו זה יהרוג את בעל החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורעים בעדינות את שכבת האפיתל כסוף של ובהיפודרמיס (איור 1E) עם קצה המספריים יש גישה ישירה אל החדר הפועם. אל תכניס את המספריים עמוק בתוך חלל הגוף, כמו לנקב את רצון הלב. הלב הפועם צריך להיות גלוי היטב, ולא דימום נרחב צריך להתרחש במהלך פתיחת בית החזה (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל את הטיימר מתוכנת כך נקבע למשך 10 שניות ולאחריה 24 שניות. במהלך 10 שניות להוציא את cryoprobe מ חנקן נוזלי. ודא כי אין חנקן יותר cryoprobe ידי ניעור אותו בעדינות. מורחים את החתך רוחבית באמצעות מלקחיים כדי לפתוח את בית החזה (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיימר טבעות 10 שניות, אבל מיד לגעת בעדינות עם קצה החדר של יחסי ציבורדואר מקורר cryoprobe (איור 1G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם אחת הטבעות טיימר 24 שניות, יוצקים 2-3 מ&quot;ל מים באמצעות מערכת טפטפת פלסטיק על החזה כדי לשחרר את cryoprobe מרקמות, ולהעביר את הדג לתוך מיכל עם מים במערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדג צריך להפעיל מחדש את הנשימה לאחר כמה שניות, ואז הוא צריך לחדש את השחייה. אם זה לא לנשום לאחר כ 45 שניות, לעורר את בעלי החיים על ידי התזת מים אל הזימים עם טפטפת פלסטיק עד שהוא מתחיל לנשום בכוחות עצמו. מניסיוננו, 95% של הדג לשרוד ניתוח, מקרי מוות מתרחשים כל יום של הניתוח. זה לא יהיה צורך לתפור חתכים. </li></ol> 3. הלב איסוף קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ל של 2% פורמלין בצינור microcentrifuge לתיקון הלב, שני מלקחיים, מיקרו המבתרים מספריים מחוררת ספוג לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל יום נבחר לאחר cryoinjury, להרדים את הדגים tricaine 0.1% במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אתדגים הצד הגחוני לתוך ספוג לח מחוררת. לעשות חתך גדול (כ 4 מ&quot;מ) מעל הלב באמצעות סחוס branchial עם מספריים המבתרים מיקרו. פתח נרחב חתך עם מלקחיים (איור 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט את bulbus arteriosus, מבנה לבן הקדמי אל החדר (איור 1 HI), ולהסיר את הלב מתוך חלל ידי משיכתו. הלב גזור כולו מוצג 1J תרשים ו -2 איור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציב עד 3 לבבות לתוך צינור microcentrifuge עם 1 מ&quot;ל של 2% פורמלין. בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים לשמור את זה בן לילה ב 4 ° C. </li></ol> 4. הלב הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את ליבם של PBS במשך 5 דקות. מעבירים את הלבבות לתוך 10 מ&quot;ל של סוכרוז 30% כי יש מראש מקורר ב 4 ° C, ומערבבים בעדינות. הדגימה צריכה בתחילה לצוף על פני השטח של פתרון סוכרוז. המשך הדגירה של 1 שעה 20 דקות ב 4 ° C. לאחרהפעם, לבבות ישקע לתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין קופסה עם קרח יבש. קח עובש הטבעה, ויוצקים שכבה 5 מ&quot;מ של המדיום אוקטובר גובר בתחתית התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים לשים לב אל T OC הרכבה בינונית בתבנית. תחת סטראו, לשנות את הכיוון של הדגימה להשיג איפקס חדרית בתחתית התבנית, ואת bulbus arteriosus כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבניות עם טיפוס על קרח יבש. כאשר הבינוני גובר מתחיל לקפוא, ממלאים את שאר התבנית עם המדיום אוקטובר ולתת לו לקפוא לחלוטין. שמור את התבנית עבור שעות לפחות 1 ב -80 ° C עד אחד בלבד. הדגימה קפוא יכול להיות מאוחסן במשך חודשים רבים ב -80 ° C. </li></ol> 5. לבבות חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת cryostat עם גודל חיתוך של 16 מיקרומטר, טמפרטורת החדר של -24 ° C, הטמפרטורה של הדגימה ב -22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גוש קפוא עםהדגימה ב cryostat ולתקן האוריינטציה שלו להתחיל לחתוך במקביל התחתון של הבלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין שש Superfrost פלוס שקופיות בלוק אחד למנות אותם 1-6. להתחיל לחתוך עד לרקמה הוא הגיע, וגם לקצץ את הבלוק סביב הדגימה עם גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג 6 משכפל לב אחד, לקחת את החלק הראשון בשקופית 1, סעיף 2 בשקופית 2, 3 על שקופית 3, וכו &#39;ברגע שאתה שם את סעיף 6 בשקופית 6, הפעל מחדש עם שקופית 1 וממשיכים עד כל איבר הוא חתך. איסוף שתי שורות של כ 8 קטעים בשקופית (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו השקופיות יבש לשעה 1 בטמפרטורת החדר. לאחסן אותם לתקופה של עד 1 שנה בקופסאות סגורות היטב ב -20 ° C. </li></ol> 6. נציג תוצאות פגיעה לב נציג בעקבות פרוטוקול זה מוצג בלב שלם גזור ב 4 dpci (cryoinjury ימים הודעה, איור 2 ד-F). כדי Visualize רקמת שריר הלב in vivo, השתמשנו דג מהונדס המבטא EGFP ו DsRed2 גרעינית תחת שליטה של האמרגן cmlc-2 לב ספציפית 11,12. העדר EGFP ו DsRed2 אותות ניאון התחום אזור בצורת דיסק האוטם לאורך הקיר הפסגה, לרוחב החדר. כדי לבצע ניתוחים תאית ומולקולרית של רקמה, לבבות היו קבועים מחולק עם cryostat. שקופית עם נציג סדרה רצופה של חלקים לב רחבי מוצגת באיור 3. הסעיפים ניתן לנתח בשיטות שונות (איור 4). כדי לקבוע את מידת ההתחדשות לב לעומת צלקות, ביצענו ניתוח היסטולוגית באמצעות חומצה Fuchsin Orange-G (AFOG) מכתים, אשר באופן דיפרנציאלי תוויות רקמות הלב ואת fibrotic 9. הביטוי ניתוחים גנים הושגו לפי בהליך הכלאה באתרו <sup&gt; 13. כדי לזהות את ההפצה של חלבונים סמן, אנחנו מוחלים assay immunofluorescence עם נוגדנים ספציפיים 9. שילוב של נהלים צביעה שונות מובילה לזיהוי של המנגנונים המולקולריים המעורבים ו הסלולר cryoinjury התחדשות הלב הבאה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig1.jpg" /> באיור 1. גרימת cryoinjury של החדר של דג הזברה הבוגרת. (א) תצלום של cryoprobe. (ב) דג הזברה מבוגר ממוקם חריץ של ספוג עם הצד שלה עד הגחון. (CF) חזה חתך לגשת לב. (C) חתך קטן דרך העור והשרירים נעשית בין שני סנפירי החזה (קו אדום). (ד) המספריים מוכנסים לתוך חתך לחתוך את העור בעקבות החץ האדום. (ה) מתחת לעור, שכבה דקה של ובהיפודרמיס כסוף (מוקף בקו מקווקו כחול) נפתח בעדינות לגשת לב. (ו) חתך מתפשטת עםמלקחיים ואת החדר הפועם (ירוק חץ) נגיש cryoinjury. (ז) cryoprobe קר מוכנס בעדינות לתוך החזה לגעת בלב. (HJ) אוסף הלב. (ג) חתך עמוק וארוך נעשית דרך קשתות branchial של החזה כדי לגשת חלל קרום הלב. שני מבנים לב גלויים: bulbus arteriosus (החץ הלבן) ואת החדר (חץ ירוק). (אני) arteriosus bulbus הוא מחזיק עם מלקחיים והוציא מתוך חלל הגוף. (י) לב שלם הוא נכרת מן הגוף. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig2.jpg" /> איור 2. השליטה ייצוגית לבבות cryoinjured גזור מן דג הזברה מהונדס למבוגרים להביע EGFP ו DsRed2 הגרעיני cardiomyocytes. (AC) וללא כל פגע לב. (A) תאורה שדה כהה מראה החדר (V), bulbus arteriosus (Ba, לבן) ואת השסתומים (VA), שם אטריום היתה קשורה החדר. (B ו-C) תמונות של פלורסנט לא<html> הוא החדר ללא שינוי התצוגה EGFP ו DsRed2 ביטוי cardiomyocytes. (DF) לב בבית cryoinjury 4 ימים הודעה (4 dpci) (ד) תאורה שדה כהה חושף האוטם בצורת דיסק (קו מקווקו צהוב). (EF) סמנים Cardiomyocyte EGFP ו DsRed2 לא מזוהים באזור האוטם, המציין את שריר הלב הפגוע (מוקף בקו מקווקו). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig3.jpg" /> איור 3. חתך של הלב. (א &#39;) בלב שלם עם ציור של חלקים חותך החל מקרב לב (1 ו 2, באדום) לכיוון החלק העליון של הלב (3 ו 4 בירוק). (ב) צילום של שקופית עם סדרה של קטעים עוקבים רחבי מוכתמים AFOG (חומצה Fuchsin Orange-G). הסעיפים הראשונים (1 ו 2, ריבועים אדומים) מכילים איפקס החדר, ואת הקטעים האחרונים של לב (3 ו 4, ריבועים ירוקים) מהווים bulbus arteriosus. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg &quot;/&gt; באיור 4. דוגמאות של ניתוח המבוצע על סעיפים לב ב cryoinjury 7 ימים לתגובה. (א) AFOG (חומצה Fuchsin אורנג&#39;-G) מדבקות צביעה בריאים שרירים תאים כתום, רקמה צלקתית המכיל קולגן בכחול הפיברין באדום. (ב) הכלאה באתרו של רשת חדרי שרירן כבד (vmhc) mRNA מדמיין שריר הלב ללא שינוי (כתמים כחולים). את הרקמות הפגועות נטול תעתיק הגן לב (קו מקווקו אדום). (ג) Immunoassaying של tropomyosin (ירוק) תוויות cardiomyocytes שלמים ולא רקמות פגועות (מוקף בקו מקווקו). DAPI (כחול) כתמים גרעינים של כל התאים. (ד) cardiomyocytes שכותרתו גנטית אקספרס DsRed2 (אדום) בגרעין שלהם. DAPI (כחול) מכנה את כל הגרעינים. אזור האוטם אינו מכיל DsRed2 חיובי תאים (קו מקווקו לבן).

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+of+newt:+a+recipe+for+regeneration.">Heart of newt: a recipe for regeneration.</a> J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Ausoni, S., Sartore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fish+to+amphibians+to+mammals:+in+search+of+novel+strategies+to+optimize+cardiac+regeneration.">From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration.</a> J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).</li><li>Borchardt, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+regeneration+in+non-mammalian+model+systems:+what+are+the+differences+between+newts+and+man.">Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man.</a> Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).</li><li>Bos, E. J. v. a. n. d. e. n., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+cryoinjury-induced+myocardial+infarction+in+the+mouse:+a+comparison+with+coronary+artery+ligation.">A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).</li><li>van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoinjury:+a+model+of+myocardial+regeneration.">Cryoinjury: a model of myocardial regeneration.</a> Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).</li><li>Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cryoinjury+induced+necrotic+heart+lesions+in+zebrafish+is+associated+with+epicardial+activation+and+cardiomyocyte+proliferation.">Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+heart+regenerates+after+cryoinjury-induced+myocardial+infarction.">The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction.</a> BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).</li><li>Gonz&#225;lez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptin+and+pontin+antagonistically+regulate+heart+growth+in+zebrafish+embryos.">Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos.</a> Cell. 111, 661-672 (2002).</li><li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate.">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li><li>Chablais, F., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF+signaling+between+blastema+and+wound+epidermis+is+required+for+fin+regeneration.">IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration.</a> Development. 137, 871-879 (2010).</li><li>Baust, J. G., Gage, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+cryosurgery.">The molecular basis of cryosurgery.</a> BJU Int. 95, 1187-1191 (2005).</li><li>Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+the+pathogenesis+of+heart+disease:+mechanisms+and+significance.">Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance.</a> Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).</li></ol>

ניסוי על בעלי חיים אושרה על ידי משרד וטרינרי הקנטון של פרייבורג.

Cryoinjury מוגדר נזק מבוקר של רקמה על ידי יישום מדויק של 14 קור קיצוניים. הלם תרמי ישירה הורסת את התאים על ידי הרס החלבון ועל ידי קרח תאיים היווצרות גבישים נוזלים כי נקרע קרום הפלזמה. כתוצאה מכך, התאים הפצועים למות תהליכי אפופטוזיס ונמק 14. שני אלה מנגנוני מוות של תאים הוכחו לתרום אובדן רקמות לאחר אוטם שריר הלב 15. לכן, cryoinjury מייצג מודל מתאים של גרימת אוטם שריר הלב. מספר מחקרים דיווחו על שיטה זו הוכיחה גם אצל יונקים שונים, כולל עכברים, חולדות, ארנבות וחזירים 6,7. עיבוד של פרוטוקול cryoinjury של דג הזברה מאפשר דיון השוואתי נוסף על התגובה האוטם בין מינים שונים. שתי קבוצות אחרות פיתחו באופן עצמאי את ההליך cryoinjury ללב דג הזברה מבוגר. ההבדלים העיקריים הם סורגרי שיטות, סוג של כלי וזמן הקפאה שימושית. במחקר ידי רוזה גונזלס, et al., קרום הלב נפתח על ידי קריעת רקמות במקום חיתוך. הם השתמשו נחושת 0.3 מ&quot;מ חוט קשור צינור פוליאמיד מראש מקורר בחנקן נוזלי להקפיא את הלב של שניות עד הפשרת יכול להיבחן 10. במחקר של שנאבל et al., פיסת חרוטי קרח יבש באורך 20 מ&quot;מ עם קצה מחודד של 2 מ&quot;מ בקוטר שלה שימש לגעת בלב למשך 10 שניות 8. שתי הקבוצות השיגו נזק חדרית דרך מותו של שריר הלב. היתרון של השיטה שלנו היא בתצהיר לשחזור יותר צלקת קולגן עשיר, אשר מחקה יותר טוב את הריפוי המוקדמות האוטם התגובות שנצפו מערכות יונקים. צעד קריטי במהלך ההליך cryoinjury על דג הזברה הוא עושה חתך דרך העור ואת שק קרום הלב, ללא ניקוב הלב הבסיסית. Performe נכוןניתוח ד גורמת לדימום קטן. דימום פזרני מציין לנקב לא מכוונת של החדר עם המספריים. במקרים כאלה, בעלי החיים יש חזר בו מן הניסוי. כדי למנוע ניקוב הלב, הצבע מספריים צריך להיות מכוון בזווית שטוחה על העור. היבט חשוב נוסף ליצירת פגיעה לשחזור הוא המיקום המדויק של cryoprobe קרים על החדר למשך מדויקת אופטימלית. זמן הקפאה קצר מדי תגרום לדלקת עם מוות של תאים קטן. הקפאה ממושכת, לעומת זאת, עלול לגרום נזק רב של הלב, דבר שעלול להוביל לתמותה מוגברת של בעלי החיים. קבענו כי הזמן האופטימלי להחזיק את החדר בטווחים המדינה קפואים בין 23-26 שניות על דג הזברה 2 ס&quot;מ מבוגר, והוא עשוי להיות שונה dependently על גודל של בעלי החיים. כי בפרוטוקול שלנו היא מאוד פשוטה ומהירה, אין גבול הניסיוניations ב העמדת מספר מספיק של בעלי חיים להשיג משוכפלים ביולוגיים מתאימים. טיפול cryosurgical נסבל היטב על ידי בעלי החיים. אוסף של לבבות בנקודות זמן שונות לאחר cryoinjury מאפשר אפיון מפורט של השלבים הבאים בתהליך ההתחדשות. ניתוח ניסיוני של לבבות cryoinjured עשויים לכלול 1) ויזואליזציה של שעתוק הגנים על ידי הכלאה ב באתרו, 2) זיהוי של חלבון על ידי חלוקת מכתים immunofluorescent, 3) הדמיה היסטולוגית של מבנים שונים. הבנת תהליכי ריפוי מפתח לאחר אוטם שריר הלב על דג הזברה ישפיע על תחום הביולוגיה רגנרטיבית. יתר על כן, זה יכול להיות מועיל עבור תכנון גישות טיפוליות חדשניות ברפואה רגנרטיבית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> מיקרו האביב מספריים המבתרים </td><td> Roboz כירורגית כלי ושות&#39; בע&quot;מ </td><td> RS-5602 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> פורמלדהיד ~ 36% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 47630 </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84100 </td></tr><tr><td> רקמת-Tek אוקטובר מתחם </td><td> סאקורה Finetek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> מחליק Superfrost פלוס </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> פיל, בכיוון הטבעת תבניות חד - תבניות קטועות T8 </td><td> Polyscience, Inc </td><td> 18985 </td></tr></tbody></table>

induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury

לב היונקים אינו מסוגל התחדשות משמעותית בעקבות פציעה אקוטית כגון אוטם שריר הלב 1. לעומת זאת, urodele דו חיים ודגים teleost לשמור על היכולת המדהימה של התחדשות לב עם מעט או ללא צלקות לאורך כל החיים 2,3. לא ידוע מדוע רק כמה חוליות שאינם יונקים יכולים לשחזר את איבר שלם מרקמות שריד 4.5. כדי להבין את ההבדלים מולקולרית תאית בין התגובות רגנרציה במינים שונים, אנחנו צריכים להשתמש גישות דומות עבור גרימת פציעות חריפה. אצל יונקים, המודל השכיח ביותר ללמוד תיקון הלב כבר איסכמיה חריפה לאחר קשירת העורק הכלילי או הרס רקמות לאחר cryoinjury 6,7. התחדשות לב ב הסלמנדרות ו דג הזברה נחקרה בעיקר לאחר כריתה חלקית של החדר איפקס 2,3. לאחרונה, מספר קבוצות יש established טכניקה cryoinjury ב 8-10 דג הזברה בוגרים. לשיטה זו פוטנציאל גדול, כי זה מאפשר דיון השוואתי של תוצאות שהתקבלו מיני יונקים ולא יונקים. כאן, אנו מציגים שיטה לגרום האוטם לשחזור בצורת דיסק של החדר על ידי דג הזברה cryoinjury. מודל זה מבוסס על פגיעה ברקמות הקפאה, הפשרה מהירה, שתוצאתה מוות של תאים מסיבית של 20% cardiomyocytes של קיר החדר. ראשית, חתך קטן נעשה דרך החזה עם מספריים iridectomy לגשת לב. קיר החדר היה קפוא ישירות על ידי יישום של 23-25 ​​שניות cryoprobe נירוסטה precooled בחנקן נוזלי. כדי להפסיק את הקפאת המים, הלב דגים בטמפרטורת החדר הושלכה על קצה cryoprobe. הליך זה נסבל היטב על ידי בעלי חיים, עם שיעור הישרדות של 95%. כדי לאפיין את תהליך ההתחדשות, לבבות היואסף קבועה בימים שונים לאחר cryoinjury. לאחר מכן הדגימה היו מוטבעים על cryosectioning. שקופיות עם חלקים עובדו לניתוח היסטולוגית, על ההכלאה immunofluorescence באתרו. התחייבות זו משפר את הבנתנו את הגורמים הנדרשים הפלסטיות רגנרטיבית של דג הזברה, ולספק תובנות חדשות על מכונות של התחדשות הלב. הבנה רעיונית המולקולרי של התחדשות לב דג הזברה תשפיע גם בביולוגיה התפתחותית ורפואה רגנרטיבית.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury at JoVE.com

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

דג הזברה מהווה מודל חשוב ללמוד את מנגנוני התחדשות לב אצל בעלי חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אינדוקציה של אוטם לב דג הזברה למבוגרים באמצעות cryoinjury. שיטה זו גורמת מוות של תאים מסיבית של 20% קיר החדר, בדומה לזו שנצפתה אוטמים יונקים.

אינדוקציה של אוטם שריר הלב ב דג הזברה למבוגרים באמצעות Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

induction-of-myocardial-infarction-in-adult-zebrafish-using-cryoinjury

Research

JoVE Journal

Medicine

22.1K Views.  University of Fribourg, Fribourg, Switzerland. דג הזברה מהווה מודל חשוב ללמוד את מנגנוני התחדשות לב אצל בעלי חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אינדוקציה של אוטם לב דג הזברה למבוגרים באמצעות cryoinjury. שיטה זו גורמת מוות של תאים מסיבית של 20% קיר החדר, בדומה לזו שנצפתה אוטמים יונקים.

Video: Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

באוטם שריר הלב אצל חולדות

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

אוטם שריר לב והערכת תוצאה תפקודית בחזירים

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

נוהל כירורגי זעיר פולשנית של גרימת אוטם שריר הלב בעכברים

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

הערכת התוצאה העיקרית במודל חזיר של באוטם שריר הלב

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

אוטם שריר לב עכברים ילודים, מודל התחדשות לב

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Real-time Pressure-volume Analysis of Acute Myocardial Infarction in Mice

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any potential therapeutic approach directed against acute left ventricular (LV) dysfunction. Current imaging modalities (e.g., echocardiography and magnetic resonance imaging) have several limitations since data on LV pressure cannot directly be measured. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion could serve as a novel method for a real-time evaluation of LV function.
At the beginning of the procedure, mice were anesthetized followed by endotracheal intubation. For LV catheterization, the right carotid artery was exposed via middle-neck incision. The catheter was introduced and placed into the LV cavity. Left thoracotomy was conducted and the left main coronary artery (LCA) was ligated. To induce reperfusion, the suture was released after 45 min. Pressure-volume data was recorded at all times.
Ligation of the LCA caused a decrease in LV systolic function as evidenced by a 30% reduction in stroke volume, LV ejection fraction (EF), and cardiac output. Maximum dP/dt as a parameter for LV contractility was also significantly reduced and diastolic function was severely impaired (minimum dP/dt -40%). Reperfusion over a period of 20 min did not lead to a complete recovery of LV function.
Real-time pressure-volume analysis served as a valid procedure for monitoring cardiac function during acute myocardial infarction in mice. Maintaining stable anesthesia and a standardized surgical approach was crucial to ensure valid results. As the early phase of acute myocardial infarction is critical for morbidity and mortality, the delineated method could be beneficial for preclinical evaluation of new strategies for cardioprotection.

Acute myocardial infarction in mice induces acute but incompletely characterized changes in left ventricular (LV) function. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion serves as a novel method for a real-time evaluation of LV function.

ניתוח בזמן אמת לחץ-נפח של אוטם אקוטי בעכברים

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

מודל לפציעה בהקפאה לחקור אוטם שריר הלב בעכבר

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...