עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01-HD093827 ו- R03-HD090304 (A.J.T).

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו תחת ההנחיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קורנל (#2002-0095). עכברי AcroSensEבני 8-10 שבועות 2 שימשו במחקר הנוכחי. בקשות למידע על זמינותם של עכברי AcroSensE ניתן להגיש למחבר המתאים.
1. איסוף זרע ושטיפתו
<ol><li>איסוף זרע קאודה אפידידימלי (פרטים נוספים על הליך זה מסופקים ב-11) מעכברי AcroSensE. אפשר 15 דקות לשחה החוצה בצלחת תרבית רקמה של 3.5 ס"מ המכילה 0.5 מ"ל של מדיום וויטן שונה (MW) ב 37 ° C. צלחת צריך להיות מכוסה כדי להפחית אידוי של MW, ויש להטות כך המדיום יש מספיק עומק כדי לכסות את אפידידימידים cauda. הערה: המדיום של וויטן שונה (MW) כולל 22 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1 mM חומצה פירובית, 4.8 mM חומצה לקטית hemi-Ca2+ מלח, pH 7.35. גלוקוז (5.5 מילימול), NaHCO3 (10 מילימול) ו-2-הידרוקסיפרופיל - ציקלודקסטרין (CD; 3 מילימול) מתווספים (ראה טבלת חומרים) לפי הצורך להשראת קיבול, וניתן לשנות ריכוזים לניסויים ספציפיים. בנוסף, ניתן להשתמש במקבלי סטרולים חלופיים במקום CD (למשל, אלבומין בסרום בקר או ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה).</li>
	<li>בעזרת מלקחיים עדינים, הסירו כל רקמה אפידידימלית מצלחת האיסוף שניתן לשחות החוצה. מעבירים את התווך המכיל את הזרע לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגו את המתלה ב 100 x גרם למשך דקה אחת ברוטור דלי מתנדנד בטמפרטורת החדר. בעזרת פיפטה מפלסטיק, הסר את הסופרנאטנט MW המכיל את הזרע מכל פסולת רקמה גסה שתצטבר בשלב זה.</li>
	<li>הביאו את הסופרנאטנט MW המכיל את הזרע לנפח כולל של 3 מ"ל על ידי הוספת MW ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 8 דקות (בטמפרטורת החדר) בצינור בעל תחתית עגולה. הסר לאט את supernatant של MW מן הזרע כדורי רופף.</li>
	<li>אם הוא בר קיימא, הזרע צריך להופיע כגלולה "רכה" למראה. השהה מחדש בעדינות את הזרע באמצעות טריטורציה עם פיפטת העברה גדולה או באמצעות נקישות ידניות עדינות על הצינור ("הזזת אצבע"). לאחר השעייתם באופן שווה, העבירו אותם לצינור חדש בעל תחתית עגולה. השתמש 10-20 μL של תרחיף הזרע כדי לספור ולהעריך תנועתיות. לדלל זרע ב- MW לשימוש. הערה: ברוב הניסויים הכוללים קיבול זרע עכבר, נעשה שימוש בריכוז סופי של 5-10 מיליון זרע/מ"ל MW. פרוטוקול ההדמיה המתואר כאן אינו דורש קיבול של זרע, אם כי יש צורך בזרע כדי לרכוש את היכולת לעבור אקסוציטוזה אקרוזום רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. אפשר ללמוד אקסוציטוזה פתולוגית או אקסוציטוזה הנגרמת באמצעות ריאגנטים כגון סידן יונופור מבלי לקלוט את הזרע. נוסף על כך, ניתן לחקור שינויים אפשריים בסידן אקרוזומלי בתאים שאינם קבוליים בתגובה לגירויים שונים.</li>
	<li>השתמש בזרע תוך 3-5 שעות מאיסוף, תוך שמירה על זמן קצר ככל האפשר ועקבי בין ניסויים ניסיוניים.</li>
	<li>בצע את כל שלבי האיסוף והשטיפה בטמפרטורה של 37°C באמצעות MW בינוני, תוך שימוש בשיטות למזעור הנזק לממברנה. זה כולל את השימוש פיפטות העברת פלסטיק גדול או קצוות פיפטה גדול, אשר מומלץ לשימוש במהלך כל שלבי ההליך.</li>
</ol>2. ציפוי פולי-D-ליזין של צלחות כיסוי להדמיה
הערה: יש להכין מנות פולי-D-ליזין (PDL) טריות לפני כל ניסוי.
<ol><li>יש להוציא טיפה של 0.5 מיקרוליטר PDL (0.5 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) במרכז צלחת כיסוי.</li>
	<li>בעזרת קצה מדורג של 10 μL, מרחו את טיפת ה-PDL על פני הכיסוי (תבנית קרוסקרוס כפי שמוצג באיור 1B).</li>
	<li>הניחו לייבוש ב-37°C למשך 10 דקות. יש לשמור כלים מצופים PDL מכוסים ובטמפרטורה של 37°C עד לשימוש.</li>
</ol>3. משיכה נימית, העמסה לנשיפה
<ol><li>משוך נימי זכוכית בורוסיליקט (O.D, 2 מ"מ, תעודת זהות, 1.56 מ"מ, ראה טבלת חומרים) באמצעות הגדרות כדלקמן- חום: 330, משיכה: 250, מהירות: 250, וזמן: 70. שלב זה צריך להיות מותאם עבור המושך הספציפי בשימוש.</li>
	<li>לפני כל ניסוי, טען נימי יחיד בתמיסה מעוררת המכילה ריכוז של פי 3-5 מהתמריץ (כדי להסביר את הדיפוזיה המהירה של התמיסה בעת הנשיפה). לפני המילוי, השתמשו בפינצטה עדינה כדי לפתוח את קצה הנימים בערך 1-2 מ"מ מהסוף. זה אמור לייצר קוטר פתיחה של ∼5 מיקרומטר. אין צורך בליטוש חום.</li>
	<li>בעזרת פיפטת העברה דקה מפלסטיק, מזריקים לאט את התמיסה המגרה לתוך הנימים עד ששלושת רבעי אורכו מלאים.</li>
	<li>הסר את כל בועות האוויר שנוצרו במהלך המילוי על ידי תנועה עדינה של הנימים.</li>
	<li>הר נימי מלא על המיקרומניפולטור (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>4. הכנת משלוח של גירוי עבור נשיפה
הערה: כדי למזער את הסיכון לפגיעה במשתמש, יש להרכיב משקפי מגן במהלך פעולת הליך הנשיפה.
<ol><li>הגדר את הגדרות מערכת המסירה של תא יחיד כדי לספק פעימה של 10 שניות ב- 5 psi.</li>
	<li>חבר את נימי הבורוסיליקט למחזיק פיפטה של מערכת העברה חד-תאית. ודאו שהאטמים הדוקים.</li>
	<li>בעת התבוננות בקצה הנימים, יש למרוח נשיפה קצרה של 2 שניות ב-20 psi כדי לוודא שאכן התמיסה מופצת דרך קצה הקצה (טיפה קטנה צריכה להיות ברורה בסוף הקצה).</li>
</ol>5. מיקרוסקופיה ורכישת תמונה
הערה: מספר מותגים של מיקרוסקופים זמינים וניתן להשתמש בהם; עם זאת, רצוי קצב מסגרות מינימלי של 3 מסגרות לשנייה. לגבי טמפרטורה ובקרת סביבה, שים לב כי הטמפרטורה בפועל של המדיום בצלחת צריכה להיות מאושרת, למשל, באמצעות מדחום אינפרא אדום ללא מגע.
<ol><li>הוסף 80 μL של זרע מדולל למרכז צלחת כיסוי 35 מ"מ מצופה פולי-D-ליזין. עבור רוב הניסויים הכוללים קיבול זרע עכבר, ריכוז סופי של 5-10 מיליון זרע / מ"ל משמש.</li>
	<li>הוסף לאט לזרע 3 מ"ל של מדיה בסיסית חמה (37 ° C) MW בתוספת 10 mM CaCl2. הערה: אפשר לבצע ניסויים בטמפרטורת החדר כדי להאט תהליכים תאיים, אך חשוב לציין שמכיוון שקיבול מתווך על ידי חילופי שומנים ונזילות של מיקרו ומאקרו-דומיינים, יש לזכור שקיבול רלוונטי פיזיולוגית ואקסוציטוזה אקרוזומית הם תהליכים תלויי טמפרטורה.</li>
	<li>הר את המנה עם הזרע על המיקרוסקופ (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>הרגש את GCaMP3 באמצעות קו לייזר של 488 ננומטר והצג באמצעות מסנן פס פס (BP) של 505-550 ננומטר. הרגש את mCherry באמצעות קו לייזר של 555 ננומטר והצג עם מסנן BP של 575-615 ננומטר.</li>
	<li>באמצעות מיקרומניפולטור (מומלץ להצמיד את המניפולטור לשולחן האוויר שעליו הוצב המיקרוסקופ), מקם את קצה הנימים כ-100 מיקרומטר בצד וכ-5-10 מיקרומטר מעל מישור התא המעניין. הערה: התמיסות הממריצות מיוצרות בריכוז גבוה פי 3-5 מהריכוז הרגיל כדי לפצות על הדיפוזיה המהירה המתרחשת בנפח שבין הנימים לתא.</li>
	<li>התחל את רצף ההדמיה במיקרוסקופ.</li>
	<li>דמיינו תאי זרע בקצב פריימים גבוה, רצוי >10 פריימים לשנייה. כאן נעשה שימוש בסורק תהודה המאפשר הדמיה במהירות של 33ms/frame.</li>
	<li>עשר שניות לאחר תחילת רכישת התמונה במיקרוסקופ, הפעל את מערכת ההעברה של תא בודד כדי להתחיל את הנשיפה של 10 שניות של ממריץ.</li>
	<li>תמונה של תאים למשך 10-15 דקות.</li>
	<li>באמצעות מערכת ההעברה של תא בודד, דמיינו תאים מרובים מצלחת אחת בהתאם למיקומים המופיעים באיור 1B. הערה: זרע לא מטופל / לא מגורה תחת המיקרוסקופ צריך להופיע בעיקר אדום, עם עוצמה נמוכה של האות הירוק. ראשי זרע צריכים להיות מחוברים לתלוש הכיסוי, וניתן לזהות זרע חי על ידי זנבותיהם הנעים. בזרע שעובר AE, האות הירוק GCaMP3 יגדל בתחילה, וגם האות האדום mCherry וגם האות הירוק GCaMP3 ייעלמו אם AE שלם, כפי שמודגם באיור 2. הפחתת פלואורסצנטיות mCherry מספקת אינדיקטור ספציפי יותר לזמן שבו AE מתחיל מכיוון ששינויים בריכוזי Ca2+ יגרמו ללא הרף לשינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של GCaMP3.</li>
</ol>6. ניתוח תמונות ונתונים
הערה: ניתוח תמונה לא מקוון מתבצע באמצעות ImageJ (ראה טבלת חומרים). בעבר, דווח על מספר שלבי ביניים בתהליך המוביל ל-AE, כולל עליית סידן אקרוזומלית (ACR), ואיחוי מלא של הממברנה. האחרון מוביל לאובדן פלואורסצנטיות mCherry ולכן מייצג AE מלא. בתאים מסוימים, אותות הדומים לאירועי כף רגל טרום ספייק (PSF) נצפים בעת שימוש בגישות אמפרומטריות במחקרים של אקסוציטוזה (לפרטים נוספים, ראה2). קיימות מספר שיטות אופציונליות לניתוח הנתונים הגולמיים של AcroSensE לכימות ACR, AE ושלבי הביניים שלהם. להלן תיאור של כמה מהשיטות האנליטיות הבסיסיות.
<ol><li>בהתאם לסיומת הקובץ הספציפית של מערכת המיקרוסקופ, השתמש בכלי הערוץ המפוצל (Image > Colors > Split Channels) כדי ליצור חלונות נפרדים עבור ערוצי GCaMP3 ו- mCherry.</li>
	<li>סנכרן את החלונות הבודדים באמצעות הכלי "סנכרן חלון" (ניתוח כלי > > סינכרון חלונות).</li>
	<li>בחרו אזור עניין (ROI) סביב ראש הזרע בתעלה האדומה כדי לכלול את אזור האקרוזום (איור 3A,B). כלי הסנכרון מאפשר להחיל את אותו אזור בחירת באופן אוטומטי על הערוץ הירוק, שבו הזרע עדיין עמום מכדי להיות גלוי.</li>
	<li>בחר תוסף "Z Profiler" (תוספים > ערימות > Z Profiler) או "מנתח סדרות זמן" (תוספים > ערימות > מנתח סדרות זמן) כדי להתוות את השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות כפונקציה של מסגרות / זמן עבור כל אחד משני הערוצים.</li>
	<li>העתק נתונים לתוכנת גיליון אלקטרוני (לדוגמה, Microsoft Excel) לצורך תכנון וניתוח נוסף. הערה: לאחר העתקת הנתונים לגיליון אלקטרוני, ניתן לחלץ פרמטרים מרובים לניתוח, כולל הפרמטרים הבאים, כפי שמודגם באיור 4.<ol><li>שעת התחלה של Fusion Pore (FP): מדוד את הזמן מנקודת זמן 0 לנקודת הזמן שבה אות GCaMP3 מתחיל לעלות. פרמטר זה מציין את ההשהיה בין הגירוי לבין תגובת ACR הזרע.</li>
		<li>זמן התחלה AE: מדוד את הזמן מנקודת זמן 0 לנקודת הזמן שבה אות mCherry מתחיל לדעוך. פרמטר זה מציין את ההשהיה בין הגירוי לבין תגובת AE הזרע. פרמטר זה יכול לשמש גם לחישוב ההשהיה בין היווצרות FP לבין תגובת AE.</li>
		<li>משרעת FP שיא: למדוד את האות הפלואורסצנטי מהבסיס לשיא עליית האות GCaMP3. פרמטר זה מציין את הגידול הכולל בתגובת ACR.</li>
		<li>קצב אובדן mCherry: קבע פרמטר זה על ידי התאמה ליניארית או מעריכית על החלק של אובדן האות mCherry (כפי שמצוין על ידי "שיפוע" באיור 4B). הערה: לחלופין, קבע את קצב הדעיכה לפי שיטת האות השיורי (R) בנקודות זמן שונות (לדוגמה, R60: משך זמן בשניות לאות שיורי של 60% מקו הבסיס של אות mCherry). ניתן להשתמש בפרמטר זה כדי לכמת את הקצב שבו התוכן האקרוזומלי מפוזר על AE.</li>
		<li>ירידת אות עבור אובדן mCherry: קבע את ההבדל באמפליטודה בין עוצמת הפלואורסצנטיות mCherry הבסיסית לבין האות שלאחר AE. פרמטר זה מציין את הכמות הכוללת של תוכן אקרוזומלי המפוזר על AE.</li>
		<li>התווה את השינויים בפלואורסצנטיות (F) עבור הערוצים האדומים והירוקים כאחד כנתונים גולמיים, או נרמל אותם על ידי הפלואורסצנטיות הראשונית (F0) ובטא אותם כ- ΔF/F0. האחרון מספק הדמיה טובה יותר של השינויים הן באדום והן בירוק בחלקה אחת (למשל, ראו איור 3D ואיור 3H). הערה: לבסוף, ניתן להשוות את הפרמטרים השונים שנמדדו בין תנאים שונים כדי לקבוע את הקשר בין שינויים בריכוז הסידן האקרוזומלי לבין AE. לדוגמאות להשוואות שונות בין מצבי ניסוי, ראו הפניה2.</li>
	</ol></li>
</ol>

שילוב הדמיה עם מערכת העברת ממריצים לחקר זרע עכבר חי

<ol>
	<li>Austin, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+penetration+of+the+sperm+in+the+mammalian+egg.">Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg.</a> Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+sensor+reveals+spatial+and+temporal+dynamics+of+acrosomal+calcium+and+sperm+acrosome+exocytosis.">A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis.</a> J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).</li><li>Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+regulation+of+acrosome+exocytosis.">Lipid regulation of acrosome exocytosis.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).</li><li>Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+resolution+of+acrosomal+exocytosis+in+human+sperm.">Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm.</a> J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).</li><li>Sosa, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+sperm+acrosomal+exocytosis).">Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis).</a> Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).</li><li>Balestrini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing:+Current+methods+to+observe+sperm+acrosomal+exocytosis+in+real+time.">Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time.</a> Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).</li><li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+acrosomal+dispersal+from+mouse+sperm+using+GFP+as+a+marker+protein.">Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein.</a> FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).</li><li>Kim, K. S., Gerton, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+soluble+and+matrix+components:+evidence+for+intermediate+states+of+secretion+during+spontaneous+acrosomal+exocytosis+in+mouse+sperm.">Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm.</a> Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).</li><li>Hasuwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+sperm+that+have+green+acrosome+and+red+mitochondria+allow+visualization+of+sperm+and+their+acrosome+reaction+in+vivo.">Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo.</a> Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).</li><li>Henderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low-Affinity+GCaMP3+Variant+(GCaMPer)+for+imaging+the+endoplasmic+reticulum+calcium+store.">A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store.</a> PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+modulation+of+calcium+flux+through+CaV2.3+regulates+acrosome+exocytosis+and+fertilization.">Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization.</a> Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).</li><li>Sanchez-Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+and+Ca(2)(+)+imaging+in+single+human+spermatozoa:+new+regulatory+roles+of+[Ca(2)(+)]i.">Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i.</a> Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).</li></ol>

לאף מחבר אין ניגודי אינטרסים לדווח עליו הקשורים לעבודה זו.

כאן, מתוארת שיטה מבוססת מיקרוסקופיה המשתמשת במודל העכבר החדש שנוצר AcroSensE לניטור וניתוח בזמן אמת, תא בודד של יחסי הגומלין בין דינמיקת סידן אקרוזומלית ושלבי ביניים המובילים ל- AE. יחד עם גישות גנטיות זמינות, כגון הכלאה עם מודלים גנטיים אחרים של עכברים או עריכת גנים, מודל ושיטה אלה מספקים מערכת...

הזרע רוכש את היכולת להפרות בתהליך שנקרא קיבול1. נקודת קצה אחת של תהליך זה היא שהזרע רוכש את היכולת לעבור AE. יותר משני עשורים של נתונים תומכים בנוכחותו של מודל מורכב ורב-שלבי של AE בזרע יונקים (מסוכםב-2,3). עם זאת, חקר AE בזרע חי הוא מאתגר, והשיטות הזמינות כיום לניטור תהליך זה ברזולוציה נאותה הן מסורבלות ודורשות שלבי הכנה מרובים4, מוגבלות לזיהוי השלב הסופי של AE (למשל, באמצעות PNA5), מוגבלות למדידות של שינויים בסידן ציטוסולי (בניגוד לדינמיקה של סידן אקרוזומלי), או מוגבלים למדידות של דינמיקת סידן ציטוסולית או AE6.
כדי להתגבר על כמה מהמגבלות העיקריות של מחקרי AE בזמן אמת בתנאים פיזיולוגיים ולאפשר חקירה של יחסי הגומלין בין דינמיקת סידן ו- AE, נוצר מודל עכבר ייחודי. במודל עכבר זה, חלבון היתוך המורכב מחיישן Ca2+ המקודד גנטית (GCaMP3) ו-mCherry מבוטא וממוקד לאקרוזום באמצעות מקדם אקרוסין ופפטיד איתות2. חיישן GCaMP3-mCherry כפול ממוקד מאפשר מדידות סימולטניות בזמן אמת של ריכוזי הסידן ומצב התוכן האקרוזומלי בזרע חי בתנאים פיזיולוגיים באמצעות מיקרוסקופיה ומערכת העברת ממריצים חד-תאית (איור 1). כמרכיב של המטריצה האקרוזומלית, איחוי הממברנה, ו- AE יגרום לאובדן פלואורסצנטיות mCherry שאינה רגישה לפוטו ול- pH מהזרע, מכיוון שחלבון זה מתפזר החוצה משלפוחית האקרוזומים. בהקשר זה, היכולת של המודל לשקף את העיתוי וההתרחשות של AE דומה ליתרונות של קו העכבר GFP ממוקד אקרוזום 7,8,9.
גרסת GCaMP3 המשמשת בקו עכברים מהונדס זה היא בעלת KD משוער של 400 מיקרומטר וטווח דינמי עבור Ca2+ של 10-4-10-3 M10, המתאים לשלפוחית זו. הראינו כי שילוב תכונות זה של GCaMP3 יכול לחשוף היווצרות נקבוביות היתוך בין קרום הפלזמה לבין הממברנה האקרוזומלית החיצונית (OAM)2. זיהוי נקבוביות האיחוי הוא תוצאה של גודל הנקבוביות קטן מכדי לאפשר לחלבון AcroSensE להתפזר החוצה מהאקרוזום (באמצעות אובדן תוכן אקרוזומים) תוך מתן "תערוץ" ממברנה המאפשר זרימה של יוני Ca2+ לתוך לומן האקרוזומים, מה שמוביל לעלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של GCaMP3.
החלבון הפלואורסצנטי mCherry הבהיר, המונומרי והלא רגיש לסידן תומך בהדמיה של האקרום בזמן שהאות GCaMP3 חלש (למשל, לפני קשירת Ca2+ , איור 2), וחשוב מכך, הוא גם מאפשר זיהוי של תאי זרע שלמים אקרוזומים, המתאימים להדמיה.
הפרוטוקול הבא מתאר את השימוש במודל העכבר הייחודי AcroSensE ואת שיטות המיקרוסקופ המשמשות באופן ניסיוני לחקר AE ודינמיקת סידן זרע ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x oil objective&#160;</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>UPlanApo,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverslip dish, 1.5 thickness</td>
			<td>MatTek Corp.&#160;</td>
			<td>P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottomed tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capilarries</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>B200-156-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>Olympus FluoView&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated tip&#160;</td>
			<td>TipOne, USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Microscope Incubation Systems&#160;</td>
			<td>TOKAI HIT Shizuoka, Japan</td>
			<td>Model STX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette&#160;</td>
			<td>FisherBrand&#160;</td>
			<td>13-711-6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell delivery system</td>
			<td>Parker, Hauppauge, NY</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of acrosomal calcium dynamics and exocytosis in live mouse sperm

אקסוציטוזה אקרוזום (AE), שבה השלפוחית האקזוציטוטית היחידה של הזרע מתמזגת עם קרום הפלזמה, היא תהליך מורכב ותלוי סידן החיוני להפריה. עם זאת, ההבנה שלנו לגבי האופן שבו איתות סידן מווסת AE עדיין אינה שלמה. בפרט, יחסי הגומלין בין דינמיקת הסידן התוך-אקרוזומלית לבין שלבי הביניים המובילים ל-AE אינם מוגדרים היטב. במאמר זה אנו מתארים שיטה המספקת תובנות מרחביות וזמניות על דינמיקת הסידן האקרוזומלית והקשר שלה לאיחוי קרום ולאקסוציטוזה שלאחר מכן של שלפוחית האקרוזומים. השיטה משתמשת בעכבר מהונדס חדשני המבטא חיישן ממוקד אקרוזום לאקסוציטוזה (AcroSensE). החיישן משלב מחוון סידן מקודד גנטית (GCaMP) המאוחה עם mCherry. חלבון היתוך זה תוכנן במיוחד כדי לאפשר תצפית בו זמנית של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואירועי איחוי ממברנה. ניטור בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ו-AE בזרע חי של AcroSensE מושג באמצעות שילוב של הדמיה בקצב פריימים גבוה ומערכת העברת חומרים ממריצים שיכולה להתמקד בזרע יחיד. פרוטוקול זה מספק גם מספר דוגמאות לשיטות בסיסיות לכימות וניתוח הנתונים הגולמיים. מכיוון שמודל AcroSensE מקודד גנטית, ניתן להעצים את חשיבותו המדעית על ידי שימוש בכלים גנטיים זמינים, כגון הכלאה עם מודלים גנטיים אחרים של עכברים או שיטות מבוססות עריכה גנטית (CRISPR). בעזרת אסטרטגיה זו, ניתן לפתור את תפקידיהם של מסלולי איתות נוספים בקיבול הזרע ובהפריה. לסיכום, השיטה המתוארת כאן מספקת כלי נוח ויעיל לחקר דינמיקת סידן בתא תת-תאי ספציפי - אקרוזום הזרע - וכיצד דינמיקות אלה מווסתות את שלבי הביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.

Sperm acquire the ability to fertilize during a process called capacitation1. One endpoint of this process is that the sperm acquire the ability to undergo AE. Over two decades of data support the presence of a complex, multi-step model of AE in mammalian sperm (summarized in2,3). However, studying AE in live sperm is challenging, and currently available methods to monitor this process with adequate resolution are cumbersome and require multiple preparation steps4, are limited to the detection of the final step of AE (e.g., using PNA5), are limited to measurements of changes in cytosolic calcium (in contrast to acrosomal calcium dynamics), or are limited to measurements of either cytosolic calcium dynamics or AE6.
To overcome some of the key limitations of real-time AE studies under physiological conditions and to enable investigation of the interplay between calcium dynamics and AE, a unique mouse model was generated. In this mouse model, a fusion protein composed of the genetically encoded Ca2+-sensor (GCaMP3) and mCherry is expressed and targeted to the acrosome using an acrosin promoter and signaling peptide2. The targeted dual GCaMP3-mCherry sensor enables simultaneous real-time measurements of calcium concentrations and the status of the acrosomal contents in live sperm under physiological conditions using microscopy and a single-cell stimulant delivery system (Figure 1). As a component of the acrosomal matrix, membrane fusion, and AE would result in the loss of the photostable and pH-insensitive mCherry fluorescence from the sperm, as this protein diffuses out of the acrosome vesicle. In this regard, the model&#39;s ability to reflect the timing and occurrence of AE is akin to the benefits of the acrosome-targeted GFP mouse line7,8,9.
The GCaMP3 variant used in this transgenic mouse line has an approximate KD of 400 &#181;M and a dynamic range for Ca2+ of 10-4-10-3 M10, which is suitable for this vesicle. We showed that this combination of features of GCaMP3 could reveal fusion pore formation between the plasma membrane and the outer acrosomal membrane (OAM)2. The fusion pore detection is a result of the pore size being too small to allow the AcroSensE protein to disperse out of the acrosome (via loss of acrosome content) while providing a membrane &#34;channel&#34; that enables the influx of Ca2+ ions into the acrosome lumen, leading to an increase in fluorescence intensity of the GCaMP3.
The bright, monomeric, non-calcium-sensitive fluorescent protein mCherry supports visualization of the acrosome while the GCaMP3 signal is faint (e.g., prior to Ca2+ binding, Figure 2), and importantly, it also allows for the identification of acrosome-intact sperm cells suitable for imaging.
The following protocol describes the utilization of the unique AcroSensE mouse model and the methods for microscopy used experimentally to study AE and sperm calcium dynamics with high spatial and temporal resolution.

מחבר זרקור: טכניקת דימות תאים חיים לחקר איתות סידן ואקרוזום אקסוציטוזה בזרע עכבר 

הדמיה בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואקסוציטוזה בזרע עכבר חי

Our research goal is to better understand the molecular mechanisms that regulate sperm function, including the processes such as capacitation and fertilization. Specifically, we're exploring how membrane lipids activate calcium signaling and acrosome exocytosis. This protocol addresses the gap in our understanding of the interplay between capacitation, sperm activation, calcium signaling, and acrosome exocytosis.The advantages of this protocol include imaging sperm under physiological conditions, as well as its ability to simultaneously monitor both calcium signaling and acrosome exocytosis without the need for complicated preloading or standing procedures.

איור 2 מספק המחשה פשוטה שמראה את רצף השינויים הפלואורסצנטיים הצפויים בעקבות גירוי מוצלח של זרע. הפאנל העליון של איור 2 מדגים את השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של GCaMP3, כאשר האות עמום בתחילה (ריכוזי הסידן האקרוזומליים הבסיסיים נמוכים מ-GCaMP3 KD), ועם כניסתם של יו...

Watch this Scientific Journal Video about A Live Cell Imaging Technique to Study Calcium Signaling and Acrosome Exocytosis in Mouse Sperm at JoVE.com

מודל העכבר AcroSensE ושיטות הדמיה של תאים חיים המתוארים כאן מספקים גישה חדשה לחקר דינמיקת הסידן בתא התת-תאי של אקרוזום הזרע וכיצד הם מווסתים שלבי ביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...

מטרת המחקר שלנו היא להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את תפקוד הזרע, כולל תהליכים כגון קיבוליות והפריה. באופן ספציפי, אנו חוקרים כיצד שומנים בקרום מפעילים איתות סידן ואקסוציטוזה אקרוזומית. פרוטוקול זה מטפל בפער בהבנתנו את יחסי הגומלין בין קיבול, הפעלת זרע, איתות סידן ואקסוציטוזה אקרוזומית.היתרונות של פרוטוקול זה כוללים הדמיה של זרע בתנאים פיזיולוגיים, כמו גם יכולתו לנטר בו זמנית הן איתות סידן והן אקסוציטוזה אקרוזום ללא צורך בפרוצדורות מסובכות של טעינה מוקדמת או עמידה.

real-time-imaging-acrosomal-calcium-dynamics-exocytosis-live-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

687 Views.  Cornell University. מטרת המחקר שלנו היא להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את תפקוד הזרע, כולל תהליכים כגון קיבוליות והפריה. באופן ספציפי, אנו חוקרים כיצד שומנים בקרום מפעילים איתות סידן ואקסוציטוזה אקרוזומית. פרוטוקול זה מטפל בפער בהבנתנו את יחסי הגומלין בין קיבול, הפעלת זרע, א...

Video: מחבר זרקור: טכניקת דימות תאים חיים לחקר איתות סידן ואקרוזום אקסוציטוזה בזרע עכבר 

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process essential for fertilization. However, our understanding of how calcium signaling regulates AE is still incomplete. In particular, the interplay between intra-acrosomal calcium dynamics and the intermediate steps leading to AE is not well-defined. Here, we describe a method that provides spatial and temporal insights into acrosomal calcium dynamics and their relationship to membrane fusion and subsequent exocytosis of the acrosome vesicle. The method utilizes a novel transgenic mouse expressing an Acrosome-targeted Sensor for Exocytosis (AcroSensE). The sensor combines a genetically encoded calcium indicator (GCaMP) fused with mCherry. This fusion protein was specifically designed to enable the concurrent observation of acrosomal calcium dynamics and membrane fusion events. Real-time monitoring of acrosomal calcium dynamics and AE in live AcroSensE sperm is achieved using a combination of high frame-rate imaging and a stimulant delivery system that can target single sperm. This protocol also provides several examples of basic methods to quantify and analyze the raw data. Because the AcroSensE model is genetically encoded, its scientific significance can be augmented by using readily available genetic tools, such as crossbreeding with other mouse genetic models or gene-editing (CRISPR) based methods. With this strategy, the roles of additional signaling pathways in sperm capacitation and fertilization can be resolved. In summary, the method described here provides a convenient and effective tool to study calcium dynamics in a specific subcellular compartment-the sperm acrosome-and how those dynamics regulate the intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

The AcroSensE mouse model and live cell imaging methods described here provide a new approach to studying calcium dynamics in the subcellular compartment of the sperm acrosome and how they regulate intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

Collection and Washing of Sperm from the AcroSensE Mouse Model for Real-Time Imaging

Begin by collecting sperm from the cota epididymus, isolated from a transgenic model mouse expressing AcroSensE. Perform the sperm collection in a 3.5 centimeter tissue culture dish containing 0.5 milliliters of MW medium by allowing a 15 minute swim out procedure at 37 degrees Celsius. Then using fine forceps, carefully remove any epididymal tissue from the swim out collection dish.Transfer the medium containing the sperm into a 15 milliliter conical tube and using a swinging bucket rotor centrifuge the suspension at 100 G for one minute at room temperature. With the help of a plastic pipette, collect the MW supernatant containing the sperm while discarding any pellet of gross tissue debris and transfer it to a round bottom tube. Adjust the supernatant volume to one milliliter by adding 500 microliters of MW medium prewarmed to 37 degrees Celsius.Centrifuge this mixture at 400 G for eight minutes at room temperature in a round bottom tube. Then carefully remove the supernatant while leaving behind the loosely pelleted sperm. Using a large bore transfer pipe, re-suspend the sperm by gently tapping the tube manually known as finger flicking.Once the sperm are evenly re-suspended, transfer them into a new round bottom tube.

איסוף ושטיפת זרע ממודל העכבר AcroSensE לצורך הדמיה בזמן אמת

Setting up the Single Cell Stimulant Delivery System for Real-Time Monitoring of Live Mouse Sperm

To begin, pull borosilicate glass capillaries with an outer diameter of two millimeters and an inner diameter of 1.56 millimeters, following appropriate settings. Prior to filling the capillary before each experiment, use fine tweezers to break open the tip of the capillary. For loading the capillary, use the stimulating solution at three to five times the normal concentration of the stimulant required.With a thin plastic transfer pipette, slowly inject the stimulating solution into the capillary until 3/4 of its length is filled. Eliminate any air bubbles that may form during the filling process by gently flicking the capillary. Then, mount the filled capillary on the micromanipulator.Configure the single cell delivery system settings to provide a 10-second pulse at five psi. Connect the borosilicate capillary mounted on the micromanipulator to the single cell delivery system pipette holder. Apply a brief puff lasting two seconds at a pressure of 20 psi, while observing the capillary tip to confirm that the solution is being dispensed through the tip's end.The setup is now ready for use with microscopy for real-time imaging of a single mouse sperm.

הגדרת מערכת העברת ממריצים של תא בודד לניטור בזמן אמת של זרע עכבר חי

Combining Microscopy with a Stimulant Delivery System to Monitor Live Sperm from an AcroSensE Model Mouse

Begin by coating the 35-millimeter coverslip dishes with Poly-D-Lysine, or PDL. To do so, dispense a 0.5 microliter droplet of PDL at the center of a coverslip dish. Using a 10-microliter graduated pipette, smear the PDL droplet across the coverslip.Allow the coated coverslip dish to dry at 37 degrees Celsius for 10 minutes. For imaging the freshly collected sperm from a mouse model expressing AcroSensE, add 80 microliters of the prepared sperm suspension to the center of the PDL-coated coverslip dish. Then, slowly add three milliliters of supplemented, modified Whitten's base media pre-warmed to 37 degrees Celsius to the dish.Proceed to perform the imaging using a combination of a microscope with the single cell stimulant delivery setup. First, mount the dish containing the sperm on the microscope. Then, using the micromanipulator, position the capillary tip of the stimulant delivery system about 100 microns to the side and five to 10 microns above the plane of the cell of interest.Position the capillary within 100 microns from the sperm head. Next, start the imaging sequence on the microscope. Image sperm cells at a high frame rate, preferably greater than 10 frames per second.10 seconds after initiating the image acquisition, activate the single cell delivery system to deliver a 10-second puff of stimulant. Continue capturing images of cells for a duration of 10 to 15 minutes. In a similar manner, image multiple cells from a single dish according to the locations shown on the screen.