עבודה זו ממומנת על ידי קרן Wellcome, המועצה למחקר רפואי, החברה המלכותית, בירמינגהאם סיטי המדע ואת האמון מחקר פוריות. ברצוננו להודות סיוע מומחה לחקר הגלעד בבנייה שילוב אסדות הדמיה.

זרע מהזכרים פורייה ובריאה, עם ניתוח זרע נורמלית, מוכנים בדרך כלל כדלקמן הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות הזרע מאוחסנים על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות לא יותר מאשר 30. תאים מבודדים פלזמה הזרע על ידי לשחות לתוך פתרון בתוספת מלח מאוזנת של ארל (sEBSS: mm: 1.8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5.37 KCl, 0.81 MgSO 4 0.7 H 2 O, 26.2 NaHCO 3, 1.0 לאא 2 PO 4. 2H 2 O, 116.4 NaCl, 55.6 D-גלוקוז, 2.73 pyruvate Na, Na 41.8 לקטט) בתוספת 0.3% de-lipidated/fatty פחם חומצה חינם שבר V BSA (באיכות של BSA הוא קריטי עבור capacitation מוצלחת של הזרע). 1 מ&quot;ל של sEBBS הוא pipetted לתוך כל סדרה של צינורות 5 מ&quot;ל ו underlayered בעדינות עם 0.3 מ&quot;ל של נוזל הזרע. לאחר הדגרה במשך שעה 1 (37 ° C; 6% CO 2) מעל 0.7 מ&quot;ל מוסרת בעדינות מהצינור כל ונקווה. 10 μl של השעיה הזרע הוא מדולל עם 90 μl של 1% (v / v) פורמלין כדי לשתק את התאים, אז זרע נספרים בתא Neubauer. צפיפות התאים בתרחיף הוא מותאם אז (עם sEBSS) עד 6 מיליון תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם נחלק אז צינורות רופף הכתיר וטופחו (37 ° C; 6% CO 2) אל aliquots של μl 200 ב עבור 5-6 שעות כדי לאפשר capacitation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips (22x50 מ&quot;מ) בעבר שטופלו poly-D-ליזין. 10 μl של פתרון poly-D-ליזין (10% w / v) מוחל גם מספר טיפות קטנות למרכז coverslip. Poly-D-ליזין מותר אז לייבוש באוויר. זה יכול להיות על במה מחוממת צריכה להיות יבשה לחלוטין. Coverslip מצורף עם גריז ואקום סגורה, ייעודית, perfusable, פוליקרבונט הדמיה קאמרית (מידות 35 מ&quot;מ x 20 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ; יכולת ≈ 180 μl). דומה לחדר וורנר פולי RC20-D-ליזין, coverslip מצופה מהווה את הבסיס של החדר כאשר תאים נתפסים על מיקרוסקופ הפוך בקוטר 12 מ&quot;מ עגול coverslip צורות פני השטח העליון של החדר, המאפשר העברת אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורגון גרין BAPTA1-AM (OGB) או סידן גרין 1-AM משמשים התאים תיוג. OGB מוכן ידי המסת ב DMSO. Pluronic חומצה F127 (חומר ניקוי) נכלל DMSO כדי למנוע &quot;clumping&quot; של צבע. זה יכול להיות מוכן במעבדה (100 Pluronic מ&quot;ג 0.5 מ&quot;ל DMSO), מיד לפני השימוש, או ניתן לרכוש מוכנה מראש. 20 μl מתווסף aliquot 50 מיקרוגרם של OGB (2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל). בקבוקון אז יכול להיות מאוחסן קפוא מופשר לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר capacitation של הזרע (5-6 שעות ב sEBBS, 37 ° C; 6% CO 2) צינור נבחרה הדמיה 1.2 μl של פתרון OGB הוא הוסיף, נותן ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. הצינור הוא מודגרות מכן 40 דקות נוספות, לאחר ההשעיה תא מוזרק בעדינות לתוך הנמל יבוא של חדר הדמיה עם טיפ p1000 פיפטה (כחול). החדר ממוקם בצד coverslip חממה, poly-D-ליזין מצופה למטה, עבור 20 דקות. תאים נוטים לשחות לאורך פני השטח של התא ו תדבק אזור poly-D-ליזין מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר מותקן עכשיו על המיקרוסקופ, קשור למנגנון זלוף ו perfused דקות ב כ 0.5 מ&quot;ל /. משאבת הרים הזנות מלוחים לתוך החדר ואת הצפת מנמל היציאה הוסר על ידי משאבה יניקה עם מלכודת. הכנה נשאר בחושך דקות לפחות 10 תוך התאים רופף לצבוע תאיים יוסרו על ידי טפטוף של החדר. יציבות טמפרטורה היא חשיבות מכרעת כי תנודות קטנות לא רק להשפיע על התא Ca 2 + הומאוסטזיס, אך עשוי גם להשפיע על K d של צבע. הניסויים מבוצעים בדרך כלל על 25 מעלות צלזיוס, מושגת על ידי שמירה על טמפרטורת החדר החשוך ברמה זו. מצאנו כי שמירה על טמפרטורת החדר ברמה הנדרשת מספק יציבות טמפרטורה גבוהה יותר מאשר שימוש להתמקד במה טמפרטורה מבוקרת או תנור חימום מבוקר תרמוסטטית על יבוא מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נתפסים תחת בניגוד שלב (40X או 60x הנפט טבילה) אובייקטיבי אזור הדמיה נבחרה. החלק של האזור poly-D-ליזין מצופה כי הוא סמוך לנמל כניסת עדיפה, שם זרימת מלוחים היא למינרית ועקבית. חשוב גם להשתמש אזור שבו צפיפות התאים מתאים (צפיפות יתר משפיע על איכות ושלמות של איסוף נתונים באמצעות האות מ תאים סמוכים) והיכן תאים מחוברים כראוי, אך פעילות flagellar ניכרת. תמונה בניגוד שלב נשמר. מיקרוסקופ הוא החליף אז למצב פלואורסצנטי (עירור 480 ננומטר, 540 ננומטר פליטה) וחשיפה הזמן מצטמצם למינימום הנדרש כדי לקבל תמונה ברורה הקרינה (בדרך כלל 5-20 מילישניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניסוי אשר נכתבו על ידי הפעלת בזמן רכישת התמונה סדרה תוכנה (IQ). בדרך כלל תמונות נרכשים בבית הרץ 0.1 ואת התאורה מוגבל לתקופות הרכישה של התמונה רק באמצעות Softwaמחדש תריס מבוקר. הרבה יותר שיעורי רכישת תמונה ניתן להשתמש אך הקצבה חייבת להתבצע על בעיות של הלבנת דור של חפצים בשל נזק תמונה לתאים (ראה דיון). מנת המשכל (ורוב האחרים פלטפורמות תוכנה רכישת) יאפשר בזמן אמת גרפים של הקרינה במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת השליטה של מניפולציה 3-5 דקות משך מרכיבים מלוחים (כגון [Ca 2 +] o) ויישום של תרופות מושגת על ידי החלפת מלוחים בכותרת זלוף. זמן של תוספת של גירוי כל כך ציין זמן ההגעה בחדר הדמיה ניתן לחשב, מתן דיוק מספיק הערכה של התגובות איטי המתואר כאן (שנדגמו ב 0.1 הרץ). לקבלת תגובות מהירות יותר דיוק רב יותר ניתן להשיג על ידי הוספת גירויים ישירות לזרם מלוחים דרך נמל יבוא second כאמור RC20 וורנר קאמרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות מנותחים מחובר באמצעות IQ. אזורי עניין (ROIs) נמשכים סביב כל תא (או חלק של התא) וגם שטח התא חינם נבחרה (עבור אוטומטית רקע חיסור על ידי התוכנה. הסדרה תמונה מסומנת ואז להסיר תאים אשר מתו או עברו התגובה acrosome ( אשר מופיע עליה גדולה המהירה הקרינה ואחריו הפסד של צבע cytoplasmic) במהלך הניסוי ואלה הראו תנועה מספיק כדי לגרום חפצים כאשר ניתחו כסדרה זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרת זמן עוצמת הקרינה מתקבל אז ההחזר על ההשקעה עבור כל הנתונים הללו מנותחים מחובר ב-Excel. בתחילה הקרינה הוא מנורמל לערך אומר שהושגו במהלך תקופת הביקורת, באמצעות המשוואה R = [(מנוחה FF) / F שאר] x 100%, כאשר R הוא שינוי% ב הקרינה לעומת התקופה שליטה, F, היא עוצמת הקרינה בזמן t זמן לנוח F הוא ממוצע של לפחות 30 קביעות של F שהושגו במהלך תקופת הביקורת. </li></ol> נציג תוצאות איור 1 מציג סדרה של תמונות מתוך ניסוי שבו תאים היו מגורה עם פרוגסטרון 3 מיקרומטר. השורה העליונה הסרט 1 להראות את התמונות הקרינה בקנה מידה אפור ואת המגים אותו מוצגים להלן (וגם בסרט 2) ב pseudocolor (בדיקת &#39;16_colors שולחן &quot;ב תמונה J), שבו&quot; מגניב &quot;הצבעים מצביעים על עוצמת פלורסנט נמוך &quot;חמים&quot; הצבעים מצביעים עוצמת הקרינה גבוהה. תאים ניתן לראות pseudocolor במהלך הניסוי, באמצעות טבלאות בדיקת רמת משכל, אלא באמצעות סולם אפור בדרך כלל יותר אינפורמטיבי להערכת. אם התאים היטב בתווית. הראשון שתי תמונות נאספו 0 s ו 100 s לאחר תחילת ההקלטה. הקרינה צריכה להיות יציבה נוטה להיות החזק ביותר באזור acrosomal הודעה והצוואר הזרע. הפרוגסטרון נכנס לחדר הדמיה בכ 175 s ו rd 3 ו -4 תמונות ה (180 וה 220 ים) מראה גידול מהיר [Ca 2 +] i (הקרינה) שמקורם ראש האחוריים ובאזור הצוואר של התא. תמונות לאחר נמצאים 290, 360, 740, 990 ו - 1440 s, מראה את הדעיכה של הראשונית [Ca 2 +] אני חולף ופיתוח של העלאת מתמשכת משני. איור 2 מראה הניתוח של גליונות אלקטרוניים, המרת ערכי הקרינה גלם ROI לכל הקרינה מנורמל (שינוי% ב הקרינה לעומת התקופה שליטה) איור 3 מראה זמן מנורמל מגרשים הקרינה במשך 3 תאים מראה &quot;טיפוסי&quot; התגובות פרוגסטרון 3 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. נתונים דוגמה מתא מגורה עם פרוגסטרון. סדרה של תמונות הקרינה בקנה מידה אפור (בשורה העליונה) ו pseudocolor (בשורה התחתונה) מוצגים. נקודות זמן הם 0, 180, 220, 290, 360 ו 990s. 3 פרוגסטרון מיקרומטר נכנס לחדר הדמיה ב 175 s. ROIs מוצגים בלוח הראשון. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ניתוח נתונים יחיד פלואורסצנטי תא ב-Excel. דמויות בשחור הם סדרה של נתונים בזמן הקרינה, מסודרים אנכית. דמויות אדום (להלן) הם נתונים מנורמל שהושגו באמצעות המשוואה נתון בטקסט. גרף מציג עלילה מנורמל הקרינה בזמן עבור 64 תא בניסוי הזה, אשר על גירוי, מראה עלייה של חולפות הקרינה ולאחריה עלייה סדרה איטית של תנודות קטנות. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Fluorescence בזמן עקבות במשך 3 תאים בודדים, כפי שבאה לידי ביטוי השינוי% ביחס לשליטה ערך .. 3 פרוגסטרון מיקרומטר נוספה בזמן מסומן בחץ. מראה קו מקווקו אומר הקרינה שליטה.

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאשר בוצעו בהצלחה, טכניקה זו מאפשרת הקלטה של ההפצה קינטיקה של ספונטניות המושרה Ca 2 + אותות זרע אנושי. תגובות ניתן לקבל מספר גדול של תאים (עד 200) וזה חשוב כי זרע האדם יכול להראות הרבה וריאציה ספונטנית מגורה Ca 2 + האותות שלהם. תיוג מוצלחת ואת ההישרדות של תאים במהלך ההקלטה הם תלויים במידה רבה על איכות המדגם. דגימות Poor לתת תיוג עניים, תגובות עניים תאים עלולים למות במהלך ההקלטה. זרע אדם רגישים מאוד נזק תמונה ולכן אנו משתמשים בתאורה מינימלית הכרחי (גם עוצמת וזמן חשיפה) על מנת למקסם את הישרדות התא ולמזער חפצים בשל מוות של תאים. מצלמה רגישות גבוהה (המתיר שימוש תאורה בעוצמה נמוכה) הוא היתרון הגדול מאז המצלמה יאסוף את הקרינה חלשה. חזור מואר, EM-CCD מצלמות במיוחד מתאים היטב, אם כי יקר מאוד. LED תאורה (במקום להשתמש קסנון או מנורת כספית עם מסנן עירור גם משפר הישרדות התא (Nishigaki et al, 2006). אנחנו לא משתמשים Fura-2, למרות היתרונות הברורים של הדמיה יחס מטרי, כי Fura מחייב עירור עם האור האולטרה סגול ובגלל זה הכרחי לקחת שתי תמונות עבור כל יחס. לקבלת נתונים המתקבלים עם אורך גל יחיד, צבעי האור הנראה, נורמליזציה של עוצמת הקרינה בעיקר מפצה על ההבדל בין טעינה לצבוע תאים, אך לא עבור הפצה לצבוע בתוך תא יחיד, ואת זה צריך לזכור. למרות צבעים אורך גל יחיד יכול, עקרונית, להיות מכויל, את הדיוק של הטכניקה היא עניים ואנחנו לא מנסים לעשות את זה. בעוד הנתונים המתקבלים עם יחס Fura-2 (או יחס פליטת לצבוע הודו), גם ללא כיול, לתת ייצוג נאמן מקובלת של שינויים יחסית [Ca 2 +] אני, את עוצמת הקרינה של צבעים אורך גל יחיד רחוק מלהיות ליניארי הקשורים [Ca 2 +] i. על החלק השימושי ביותר של עקומת הרוויה הקשר עבור צבעים אורך גל יחיד בדרך כלל קירוב ל לוגריתמי. בשלב זה אנו משתמשים אורגון גרין BAPTA-1 (איור 4) כי הוא רגיש שינויים קטנים [Ca 2 +] אני קרוב לרמה של מנוחה (5-10 ננומטר). כאשר [Ca 2 +] אני עולה מעל 1 תגובות מיקרומטר יהיו תחת ייצוג במונחים של שינוי הקרינה ואת צבע יכול להרוות. אפשרות לשיפור של הטכניקה בלי להזדקק עירור UV היא להכפיל תאים לטעון עם צבע כגון Fluo-3 ו Fura אדום. שניהם יכולים להיות נרגש ב 488 nM אבל התגובות סימולטני שלהם שונים מאוד. הקלטה של פליטה ב 540 ו 650 nM מספק יחס אשר יכול לספק שיטה טובה יותר עבור ניטור מדויק של [Ca 2 +] i (Haughland, 2002) עשויות לחול על זרע (Nisigaki et al, 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הקשר בין חינם [Ca 2 +] (ננומטר) ועל פליטת הקרינה בשיא גל (525 ננומטר כ) עבור אורגון גרין BAPTA-1 ו אורגון גרין BAPTA-2. OGB1 נותן הקרינה גבוה יותר נח [Ca 2 +] אבל מרווה ברמות נמוכות יותר, ולכן יש מגוון קטן יותר שמיש. נתונים עבור חלקות אלה נתקבלו בדיקות מולקולריות מדריך (Haughland, 2002).

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים עמוסה ניאון, Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; רגיש צבעים משמש למדידת היבטים במרחב ובזמן של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; איתות בתאים חיים. כאן אנו מתארים את שיטת במעבדות שלנו לטעינת השעיות של זרע אנושי עם Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; דיווח צבעים ומדידת אותות הקרינה במהלך גירוי פיזיולוגי. ניעתי תאים מבודדים על ידי ישיר לשחות כלפי מעלה מודגרות בתנאים capacitating עבור 0-24 שעות, תלוי בניסוי. התא permeant AM (acetoxy מתיל אסתר) אסתר צורה של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; דיווח צבע נוסף ואז aliquot תא תקופה של 1 ש &#39;מותר לטעינה של צבע לתוך הציטופלסמה. אנו משתמשים בצבעים אורך הגל הנראה כדי למזער צילום נזק לתאים, אך זה אומר כי הקלטת ratiometric אינו אפשרי. יתרונות וחסרונות של גישה זו הם דנו. במהלך תקופת העמסה תאים מוכנסים לחדר הדמיה מותר לדבוק coverslip poly-D-ליזין מצופה. בסוף לצבוע טעינת תקופה עודף תאים רופף יוסרו על ידי חיבור של החדר למנגנון זלוף. תא הוא perfused ברציפות, גירויים salines שונה מתווספים אז לכותרת זלוף. ניסויים מתועדים על ידי רכישת זמן לשגות של תמונות פלואורסצנציה לנתח מחובר פרט, על ידי ציור ידני אזורים של עניין. הנתונים מנורמל מראש רמות גירוי כזה, עבור כל תא (או חלק של תא), גרף המראה את Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; בתגובה כשינוי% ב הקרינה מתקבל.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm at JoVE.com

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-עורר [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] אני אותות של זרע אנושי הפרט מוערכים. תאים ניעתי נטענים עם Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; רגיש צבע פלואורסצנטי (AM-אסתר שיטה) ו משותקת בתא perfusable. תאים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות ועורר דרך המדיום המרוססת. התגובות של תאים בודדים (או אזורים) מנותחים מחובר באמצעות Excel.

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

17.0K Views.  University of Birmingham. Stimulus-עורר [Ca 2 +] אני אותות של זרע אנושי הפרט מוערכים. תאים ניעתי נטענים עם Ca 2 + רגיש צבע פלואורסצנטי (AM-אסתר שיטה) ו משותקת בתא perfusable. תאים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות ועורר דרך המדיום המרוססת. התגובות של תאים בודדים (או אזורים...

Video: Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

בשנת vivo Ca 2 + - הדמיה של נוירונים גוף אינפקטד במהלך הלמידה חוש הריח של דבורת הדבש

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

ויזואליזציה של כלי דם Ca 2 + איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

מדידת תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do not allow for accurate interpretation of this interplay. Using a quantitative imaging-based approach, we present a high-content protocol for characterizing the dynamic phenotypic responses (i.e. morphology changes, proliferation, apoptosis) of heterogeneous cell populations to changes in environmental stimuli. We highlight our ability to distinguish between cell types based upon either fluorescence intensity or inherent morphology features depending on the application. This platform allows for a more comprehensive characterization of subpopulation response to perturbation while utilizing shorter time, smaller amounts of reagents, and lower likelihood of error than traditional cell biology assays. However, in some cases, cell populations may be difficult to identify and quantitate based on complex cellular features and will require additional troubleshooting; we highlight some of these circumstances in the protocol. We demonstrate this application using response to drug in a cancer model; however, it can easily be applied more broadly to other physiological processes. This protocol allows one to identify subpopulations within a co-culture system and characterize the particular response of each to external stimuli.

We have developed a novel protocol for studying heterocellular population dynamics in response to perturbations. This manuscript describes an imaging-based platform that produces quantitative datasets for simultaneous characterization of multiple cellular phenotypes of heterocellular populations in a robust manner.

אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...