Diese Arbeit wurde durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter der Fördernummer unterstützt. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), der Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), der Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), der Mallinckrodt Research Grant (S.C.) und der Margaret E. Early Medical Research Trust 2024 Zuschuss (S.C.). S.C. wird auch vom NIH/NCI unter der Award-Nummer P30CA016042 unterstützt.

1. Markierung von Proteinen in Zellen
<ol><li>Exprimieren Sie das Protein von Interesse, das mit HaloTag fusioniert ist, in der gewünschten Zelllinie.</li>
	<li>Stabiles exprimieren Halo-markiertes H2B im gleichen Zelltyp wie in 1.1 unter Verwendung von Transposons oder viraler Transduktion.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Deckgläsern
<ol><li>Reinigen Sie vor der Verwendung von Deckgläsern für die Zellkultur die Deckgläser, um autofluoreszierende Verunreinigungen zu entfernen.<ol><li>Montieren Sie die Deckgläser #1,5 mit einem Durchmesser von 25 mm auf einem Keramikfärbegestell und legen Sie sie in einen Polypropylenbehälter.</li>
		<li>Deckgläser vollständig in eine 1 M Lösung aus KOH tauchen und 1 h beschallen.</li>
		<li>Deckgläser dreimal mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) abspülen.</li>
		<li>Deckgläser vollständig in 100% Ethanol tauchen und 1 h beschallen.</li>
		<li>Deckgläser vollständig in 20%iges Ethanol mit ddH2O verdünnt tauchen und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vorbereitung der Zellen für die Mikroskopie
HINWEIS: Führen Sie die Schritte aus diesem Abschnitt in einer Biosicherheitswerkbank durch, um eine Kontamination der Zellen zu verhindern.
<ol><li>Plattenzellen auf gereinigten Deckgläsern. Führen Sie 2 Tage vor der Bildgebung durch, wenn das Halo-markierte Protein vorübergehend exprimiert werden soll. Führen Sie 1 Tag vor der Bildgebung durch, wenn das Halo-markierte Protein stabil oder endogen exprimiert wird.<ol><li>Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um Deckgläser in eine 6-Well-Platte (ein Deckglas/Well pro Zellprobe) zu legen und das restliche Ethanol verdampfen zu lassen.</li>
		<li>Plattieren Sie jede Vertiefung mit einer geeigneten Anzahl von Zellen, um zum Zeitpunkt der Bildgebung eine Konfluenz von 70 % zu erreichen. Plattieren Sie ein zusätzliches Well mit Zellen, die H2B-Halo mit der gleichen Zielkonfluenz stabil exprimieren.</li>
		<li>Befolgen Sie diesen Schritt nur, wenn Sie das Halo-markierte Protein von Interesse vorübergehend exprimieren. Die Zellen werden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Transfizieren Sie dann die Zellen mit dem Plasmid, das für das markierte Protein von Interesse kodiert, unter Verwendung geeigneter Transfektionsreagenzien und gemäß den Richtlinien des Herstellers.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Färben Sie die Zellen, die das Halo-markierte Protein von Interesse exprimieren, sowohl mit einem nicht photoaktivierbaren Halo-Liganden (z. B. JFX549) als auch mit einem photoaktivierbaren Halo-Liganden (z. B. PA-JF646). Färbezellen, die H2B-Halo exprimieren, nur mit dem photoaktivierbaren Halo-Liganden. HINWEIS: Die hier aufgeführten Konzentrationen von Halo-Liganden sollten als Ausgangspunkt verwendet werden; Die optimale Konzentration hängt vom Expressionsniveau und der lokalen Konzentration des interessierenden Proteins im Kondensat ab.<ol><li>Für jede Zellprobe, die das interessierende Halo-markierte Protein exprimiert, werden 100 nM JFX549 Halo-Ligand35 und 20 nM PA-JF646 Halo-Ligand36 in 500 μl geeignetem Zellmedium verdünnt. Für jede Probe, die H2B-Halo exprimiert, verdünnen Sie nur 20 nM PA-JF646 Halo-Liganden in 500 μl geeignetem Zellmedium.</li>
		<li>Aspirieren Sie für jede Vertiefung vorhandene Medien, fügen Sie 2 ml 1x PBS hinzu, aspirieren Sie dann PBS (dies wird für den Rest des Protokolls als "Spülung" bezeichnet) und ersetzen Sie es durch Medien, die die entsprechenden Halo-Liganden enthalten.</li>
		<li>1 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.</li>
		<li>Viermal mit PBS spülen und durch frische Medien ersetzen, die keine Halo-Liganden enthalten.</li>
		<li>15 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.</li>
		<li>Die Schritte 3.2.4 und 3.2.5 dreimal wiederholen (insgesamt vier Spül-Inkubationszyklen).</li>
		<li>Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um das Deckglas mit den Zellen in eine Zellkultur-Deckglaskammer zu übertragen, die mit dem Mikroskoptisch kompatibel ist.</li>
		<li>Geben Sie phenolrotfreie Medien in die Kammer und fahren Sie mit der Bildgebung fort. Inkubieren Sie die Proben, die nicht sofort bei 37 °C und 5 % CO2 abgebildet werden, bis sie benötigt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Einzelmolekül-Bildgebung
HINWEIS: Unabhängige Experimente, die die Verweilzeiten sowohl von H2B als auch des interessierenden Proteins messen, sollten über mehrere (≥3) Tage durchgeführt werden, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen. Richten Sie die beiden Kameras vor der Abbildung von Zellproben am Mikroskop mit 0,1 μm gefärbten Mikrokugeln (Table of Materials) oder einem ähnlichen Kalibrierungsstandard aus.
<ol><li>Bereiten Sie das Mikroskop vor.<ol><li>Schalten Sie das Mikroskop und den Computer ein, der das Mikroskop steuert.</li>
		<li>Schalten Sie die Inkubationskomponenten für lebende Zellen (Heizung und CO2) am Mikroskop ein und stellen Sie es auf 37 °C und 5 % CO2 ein. Lassen Sie das System ausgleichen.</li>
		<li>Geben Sie einen Tropfen des entsprechenden Öls auf ein 100x TIRF-Ölimmersionsobjektiv am Mikroskop und laden Sie die Zellprobe auf den Mikroskoptisch.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifizieren Sie eine Zelle, die abgebildet werden soll.<ol><li>Bilden Sie die Zellprobe unter Hellfeldbeleuchtung ab und passen Sie die z-Position an, bis die Zellen scharf sind.</li>
		<li>Identifizieren Sie eine Zelle, die morphologische Merkmale gesunder Zellen aufweist.</li>
		<li>Schneiden Sie das Sichtfeld (FOV) so zu, dass es nur den Zielzellkern erfasst.</li>
		<li>Verwenden Sie die Laserbeleuchtung und stellen Sie den TIRF-Winkel ein, bis die HILO-Beleuchtung41 mit optimalem Signal-Rausch-Verhältnis der einzelnen Moleküle erreicht ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Bild H2B-Halo in lebenden Zellen. HINWEIS: Die in diesem Abschnitt verwendeten Laserleistungen sind spezifisch für dieses Experiment und als Beispiel enthalten. Geeignete Laserleistungen sollten nach den in der Diskussion aufgeführten Kriterien ausgewählt werden.<ol><li>Richten Sie eine Akquisitionskonfiguration wie folgt ein. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 500 ms ein. Während jeder 500-ms-Exposition werden PA-JF646-markierte H2B-Halo-Moleküle mit einem 9,1 mW, 640 nm-Strahl angeregt. Während der Totzeit zwischen den Bildern (158,01 μs auf dem hier verwendeten Bildgebungssystem) photoaktivieren Sie die Moleküle mit einem 111 μW, 405 nm Strahl.</li>
		<li>Nehmen Sie mit diesen Einstellungen 2000 Frames kontinuierlich auf. Erhöhen Sie die Leistung des 405-nm-Strahls im Laufe der Aufnahme allmählich, wenn die Anzahl der photoaktivierten Moleküle nicht mehr ausreicht.</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie sich das Halo-markierte Protein von Interesse in lebenden Zellen vor.<ol><li>Verwenden Sie einen dichroitischen Langpassspiegel, um die Emissionswellenlängen auf zwei Kameras aufzuteilen, eine zum Nachweis von PA-JF646 und die andere zum Nachweis von JFX549. Verwenden Sie geeignete Emissionsfilter vor den Kameras.</li>
		<li>Verwenden Sie die gleiche Erfassungskonfiguration, die in 4.3.1 beschrieben ist, mit der folgenden Änderung. Fügen Sie einen zusätzlichen JFX549-Kanal hinzu, um die Positionen der Halo-markierten Proteinkondensate im Laufe der Zeit zu verfolgen. Erfassen Sie alle 10 s ein Bild (500 ms, 2,1 mW, 561 nm Anregung) im JFX549-Kanal, während die Erfassung des PA-JF646-Kanals beibehalten wird. Dies führt zu einem Durchbluten des PA-JF646-Kanals, das bei der Datenanalyse nach der Erfassung berücksichtigt wird.</li>
		<li>Nehmen Sie mit diesen Einstellungen 2000 Frames kontinuierlich auf. Erhöhen Sie die Leistung des 405-nm-Strahls im Laufe der Aufnahme allmählich, wenn die Anzahl der photoaktivierten Moleküle nicht mehr ausreicht.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analyse von Einzelmolekül-Bildgebungsdaten
HINWEIS: Die in Abschnitt 5 verwendeten Parameter sind spezifisch für dieses Experiment und als Beispiel enthalten. Geeignete Parameter sollten nach den in der Diskussion aufgeführten Kriterien ausgewählt werden.
<ol><li>Bereiten Sie Bildrohdaten für die Verarbeitung vor.<ol><li>Konvertieren Sie für die Daten des interessierenden Proteins jeden Kanal aus der Rohbilddatendatei mit ImageJ oder einer ähnlichen Bildverarbeitungssoftware in eine unabhängige .tif Datei. Konvertieren Sie für die Daten von H2B den einzelnen Kanal aus der Rohbilddatendatei auf die gleiche Weise in eine .tif Datei. HINWEIS: Abhängig von der verwendeten Erfassungssoftware kann es zu leeren Bildern im Kondensatfilm kommen, da nur alle 10 s ein Kondensat-Tracking-Bild aufgenommen wird. Die leeren Rahmen sollten mit dem neuesten Kondensatrahmen gefüllt werden (einige Erfassungssoftware erledigt dies automatisch). Wenn während dieser Kondensatverfolgungsrahmen ein signifikantes Durchbluten vom Kondensatkanal (JFX549) in den Einzelmolekülkanal (PA-JF646) auftritt, sollten die entsprechenden Einzelmolekülrahmen durch den neuesten Einzelmolekülrahmen ersetzt werden.</li>
		<li>Wenn es Frames gibt, die aus den oben genannten Gründen in einem der beiden Filme ersetzt werden müssen, ersetzen Sie sie durch den neuesten Frame aus diesem Film, indem Sie (falls erforderlich) pretracking_comb.txt, ein ImageJ-Makro, das in Chong et al.1 verfügbar ist, ändern und ausführen und den Anweisungen folgen.</li>
	</ol></li>
	<li>Erzeugung von Einzelpartikeltrajektorien unter Verwendung einer SPT-Software, z. B. SLIMfast39, einer GUI-Implementierung des MTT-Algorithmus38 , die in Teves et al.42 verfügbar ist.<ol><li>Laden Sie die Datei aus 5.1.2 mit dem Einzelmolekülfilm in SLIMfast, indem Sie auf Load > Imagestack klicken.</li>
		<li>Stellen Sie die Parameter ein (Lokalisierungsfehlerrate: 10-6; Deflationsschleifen: 3) für die Lokalisierung durch Klicken auf OPT > Blatt: Lokalisierung.</li>
		<li>Stellen Sie die Parameter ein (Spitzenemission: 664 nm; Verzögerungszeit: 500 ms) für die Erfassung durch Klicken auf OPT > Blatt: Erfassung.</li>
		<li>Visualisieren Sie die Lokalisierungen aller Moleküle in einem einzigen Frame, um sicherzustellen, dass die gewählten Parameter angemessen sind (TEST LOC). Ändern Sie die Parameter in den Schritten 5.2.2 und 5.2.3 und wiederholen Sie diesen Schritt, falls dies nicht zulässig ist.</li>
		<li>Generieren Sie eine Datei, die die Lokalisierungen aller Moleküle in jedem Frame enthält (LOC ALL).</li>
		<li>Laden Sie die Datei von 5.2.5 in SLIMfast, indem Sie > Partikeldaten laden > SLIMfast klicken.</li>
		<li>Stellen Sie die Parameter ein (maximal erwarteter Diffusionskoeffizient: 0,1 μm2/s; Maximale Anzahl von Wettbewerbern: 5) für die Trajektoriengenerierung durch Klicken auf OPT > Sheet: Tracking.</li>
		<li>Generieren Sie eine Datei mit den Trajektorien aller Moleküle (GEN TRAJ).</li>
	</ol></li>
	<li>Filtern Sie die Trajektorien heraus, die kürzer als tmin, 2,5 s sind, mit evalSPT39, verfügbar in Drosopoulos et al.43, um Tracking-Fehler zu berücksichtigen, die zu künstlich kurzen Trajektorien führen.<ol><li>Laden Sie die Datei von 5.2.8 in evalSPT (+ > Datei von 5.2.8 > OK).</li>
		<li>Stellen Sie die Parameter ein (min.: 5 Bilder; max: maximale Trajektorienlänge für Datei aus 5.2.8), um die Trajektorien herauszufiltern, die kürzer als 2,5 s sind.</li>
		<li>Generieren Sie eine Datei mit allen gefilterten Trajektorien (EXPORT DATA).</li>
	</ol></li>
	<li>Befolgen Sie diesen Schritt nur für die Trajektorien des interessierenden Proteins. Sortieren Sie die Trajektorien in die in den Kondensaten und aus den Kondensaten heraus und extrahieren Sie dann die mittlere Verweilzeit im Kondensat. HINWEIS: Alle Codes für diesen Abschnitt sind in Chong et al.1 verfügbar.<ol><li>Legen Sie einen Schwellenwert für alle Frames des Films fest, die im JFX549-Kanal erfasst wurden, um einen Zeitrafferfilm zu erzeugen, der mit der zeitentwickelnden Binärmaske gefüllt ist, die Kondensatpositionen hervorhebt, indem Sie die ImageJ-Makro-, Nukleus- und Cluster-mask_v2.txt ausführen und den Eingabeaufforderungen folgen.</li>
		<li>Formatieren Sie die in 5.3.3 generierten Einzelmolekül-Trajektorien neu. Verwenden Sie das MATLAB-Skript ConvertASCII_SlowTracking_css3.m und passen Sie die Dateinamen, Pfade und Parameter nach Bedarf an. (Parameter: Belichtung, 0,5 s; Auflösung, 0,16 μm/Pixel).</li>
		<li>Sortieren Sie Trajektorien basierend auf dem Bruchteil der Lebensdauer, die ein bestimmtes Molekül in einem Kondensat (F) verbringt, indem Sie das MATLAB-Skript categorization_v4.m verwenden und die Dateinamen und Pfade nach Bedarf anpassen.</li>
		<li>Fahren Sie nur mit In-Kondensat-Trajektorien fort.</li>
	</ol></li>
	<li>Extrahieren Sie kobs,s und kpb und berechnen Sie die korrigierte mittlere Verweilzeit, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">.<ol><li>Extrahieren Sie kobs,s aus dem interessierenden Protein im Kondensat mit dem MATLAB-Skript PLOT_ResidenceHist_css.m und passen Sie Dateinamen, Pfade und Parameter nach Bedarf an. (Parameter: Belichtung, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 Frames).</li>
		<li>Extrahieren Sie kpb aus den H2B-Trajektorien mit dem MATLAB-Skript PLOT_ResidenceHist_css.m und passen Sie Dateinamen, Pfade und Parameter nach Bedarf an. (Parameter: Belichtung, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 Frames).</li>
		<li>Berechnen Sie die korrigierte mittlere Verweilzeit des interessierenden Proteins, das spezifisch an seine Kondensate gebunden ist, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">als <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;"> HINWEIS: Es sollten Kontrollen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass unterschiedliche Belichtungszeiten, die lang genug sind, um mobile Partikel zu verwischen, z. B. 300 ms und 800 ms, immer noch zur gleichen mittleren Verweilzeit des interessierenden Proteins führen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Lebendzell-Einzelmolekül-Imaging-basierte Quantifizierung von Proteininteraktionen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier vorgestellte Protokoll ist für Systeme wie die in Irgen-Gioro et al.40 untersuchten konzipiert. Je nach Anwendung können einige Komponenten des Protokolls modifiziert werden, z. B. das Verfahren zur Erzeugung fluoreszenzmarkierter Zelllinien, das fluoreszierende Markierungssystem und die Art des verwendeten Deckglases. Das Halo-Tagging eines Proteins in einer Zelle kann mit zwei Strategien erfolgen, je nachdem, welche für ein bestimmtes Experiment besser geeignet ist. 1) Exogene Expres...

Eine wachsende Zahl von Arbeiten deutet darauf hin, dass biomolekulare Kondensate eine wichtige Rolle bei der zellulären Organisation und zahlreichen zellulären Funktionen spielen, z. B. Transkriptionsregulation 1,2,3,4,5, DNA-Schadensreparatur 6,7,8, Chromatinorganisation 9,10,11,12, X-Chromosom Inaktivierung 13,14,15 und intrazelluläre Signalübertragung 16,17,18. Darüber hinaus ist die Dysregulation biomolekularer Kondensate an vielen Krankheiten beteiligt, darunter Krebs 19,20,21 und neurodegenerative Erkrankungen 22,23,24,25,26. Die Kondensatbildung wird häufig durch transiente, selektive und multivalente Protein-Protein-, Protein-Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Nukleinsäure-Wechselwirkungen angetrieben27. Unter bestimmten Bedingungen können diese Wechselwirkungen zur Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) führen, einem Dichteübergang, der bestimmte Biomoleküle lokal in membranlosen Tröpfchen anreichert. Solche multivalenten Wechselwirkungen werden oft durch die intrinsisch ungeordneten Regionen (IDRs) von Proteinen vermittelt 1,28,29. Die biophysikalische Charakterisierung dieser Wechselwirkungen auf molekularer Ebene ist entscheidend für unser Verständnis zahlreicher gesunder und abweichender zellulärer Funktionen, da Kondensate in ihnen allgegenwärtig sind. Obwohl Techniken, die auf der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie basieren, z. B. die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleaching (FRAP)30,31,32, weit verbreitet sind, um qualitativ zu zeigen, dass der molekulare Austausch zwischen Kondensaten und der umgebenden zellulären Umgebung dynamisch ist, ist die Quantifizierung der Interaktionsdynamik spezifischer Biomoleküle innerhalb von Kondensaten mit konventioneller konfokaler Mikroskopie oder Einzelmolekülen im Allgemeinen nicht möglich Mikroskopie ohne spezielle Datenanalysemethoden. Die in diesem Protokoll beschriebene Einzelpartikel-Tracking-Technik (SPT) basiert auf der Lebendzell-Einzelmolekülmikroskopie33 und bietet ein einzigartig leistungsfähiges Werkzeug zur Quantifizierung der Wechselwirkungsdynamik zwischen bestimmten Proteinen in Kondensaten. Die Auslesung von SPT für eine solche Messung ist die mittlere Verweilzeit eines Proteins von Interesse in den Kondensaten.
Das Protokoll kann in zwei Teile unterteilt werden - Datenerfassung und Datenanalyse. Der erste Schritt der bildgebenden Datenerfassung besteht darin, in Zellen ein Protein von Interesse zu exprimieren, das mit einem HaloTag34 fusioniert ist. Dies ermöglicht die Markierung des interessierenden Proteins mit zwei Fluorophoren, wobei ein Großteil der Proteinmoleküle mit einem nicht photoaktivierbaren Fluorophor (z. B. JFX549 Halo-Ligand35) und ein kleiner Teil von ihnen mit einem spektral unterschiedlichen, photoaktivierbaren Fluorophor (z. B. PA-JF646 Halo-Ligand36) markiert werden soll). Dies ermöglicht die gleichzeitige Erfassung aller Kondensatstellen in der Zelle und die Erfassung von Einzelmolekülfilmen des interessierenden Proteins, das an die Kondensate bindet und löst. In der Zwischenzeit wird derselbe Zelltyp modifiziert, um Halo-markiertes H2B stabil zu exprimieren, ein Histon, das auf Chromatin weitgehend unbeweglich ist. Die Zellen werden dann mit dem PA-JF646-Halo-Liganden gefärbt, um eine Einzelmolekül-Bildgebung von H2B zu ermöglichen. Wie im Folgenden ausführlich diskutiert wird, berücksichtigt dieses Experiment den Beitrag des Photobleaching, um eine präzise Quantifizierung der Interaktionsdynamik des interessierenden Proteins zu ermöglichen. Zellen für bildgebende Experimente müssen dann auf sauberen Deckgläsern kultiviert, mit HaloTag-Liganden gefärbt und in einer Bildgebungskammer für lebende Zellen zusammengesetzt werden. Von dort aus wird die Probe unter stark geneigter und laminierter optischer Blattbeleuchtung (HILO) auf einem TIRF-Mikroskop (Total Internal Reflection Fluorescence) abgebildet, das Zweikanal-Bildgebung und Einzelmoleküldetektion ermöglicht. Die Emission wird dann auf zwei Kameras aufgeteilt, eine verfolgt die Kondensatpositionen und eine verfolgt einzelne Moleküle. Die Akquisition wird mit einer langen Integrationszeit (in der Größenordnung von Hunderten von ms) durchgeführt, um frei diffundierende Proteine zu verwischen und nur Proteine einzufangen, die aufgrund der Bindung an stabile Strukturen in der Zelle weniger mobil sind37.
Der erste Schritt der Datenanalyse besteht darin, einen etablierten Einzelpartikel-Tracking-Algorithmus (SPT)38,39 zu verwenden, um einzelne Proteinmoleküle in jedem Bild des Films zu lokalisieren und die Lokalisierungen zu einer Trajektorie für jedes Molekül über seine nachweisbare Lebensdauer zusammenzusetzen. Die Trajektorien werden dann in diejenigen sortiert, die Moleküle innerhalb und Moleküle außerhalb der Kondensate repräsentieren, indem die Lokalisationen der Moleküle während ihrer Trajektorien mit den Lokalisationen aller Kondensate zu den entsprechenden Zeitenverglichen werden 1.
Als nächstes wird eine Überlebenskurve (1 - CDF) unter Verwendung der Längen aller In-Kondensat-Trajektorien erstellt. Die scheinbare mittlere Verweilzeit der Moleküle wird dann extrahiert, indem die Überlebenskurve an das folgende Zweikomponenten-Exponentialmodell der Proteinbindung angepasst wird:
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;">,
mit A als Anteil der unspezifisch gebundenen Moleküle und mit kobs,ns und kobs,s als den beobachteten Dissoziationsraten der unspezifisch gebundenen bzw. spezifisch gebundenen Moleküle. Von hier an werden nur noch kobs,s berücksichtigt. Die Dynamik sowohl der Proteindissoziation, ktrue,s, als auch der Photobleichung des Fluorophors, kpb, trägt zu kobs,s als
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;">;
Um die Effekte der Proteindissoziation zu isolieren, wird daher die spezifische Dissoziationsrate von H2B-Halo in der zuvor erwähnten Zelllinie gemessen.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;">
H2B ist ein Protein, das stabil in das Chromatin integriert ist und auf der Zeitskala einer Einzelmolekül-Filmaufnahme eine minimale Dissoziation erfährt37. Seine spezifische Dissoziationsrate ist dann gleich der Photobleichrate des PA-JF646-Halo-Liganden oder
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;">.
Die mittlere Verweilzeit des interessierenden Proteins im Kondensat, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, ist dann
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;">.
Repräsentative Ergebnisse von Irgen-Gioro et al.40 werden gezeigt, wobei dieses Protokoll angewendet wurde, um zu zeigen, dass die Fusion einer Oligomerisierungsdomäne mit IDR zu längeren Verweilzeiten der IDR in ihren Kondensaten führt. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die hinzugefügte Oligomerisierungsdomäne die homotypischen Wechselwirkungen der IDR stabilisiert, die LLPS antreiben. Im Prinzip kann die gleiche Methode mit leicht modifizierten Protokollen angewendet werden, um die homotypischen oder heterotypischen Wechselwirkungen jedes Proteins zu charakterisieren, das an der Bildung von Kondensaten jeglicher Art beteiligt ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m TetraSpeck microsphere</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Diameter, #1.5 Coverslips</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>111650</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>593/40 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>676/37 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-676/37-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well TC Plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-105MP</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line: U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 
			.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Rack</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>24957</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Low Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-567-022</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Lab Alley</td>
			<td>EAP200-1GAL</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evalSPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikon Ultra CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>X-13723</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R635-25x36</td>
			<td>Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUN-F Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: 405/488/561/640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nucleus and cluster mask_v2.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6984-06</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pretracking_comb.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLIMfast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubation system</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: For live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwinCam dual emission image splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>5800</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule measurement of protein interaction dynamics within biomolecular condensates

Biomolekulare Kondensate, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) gebildet werden, gelten als entscheidend für die zelluläre Organisation und eine zunehmende Anzahl zellulärer Funktionen. Die Charakterisierung von LLPS in lebenden Zellen ist auch deshalb wichtig, weil aberrante Kondensation mit zahlreichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde, darunter Krebs und neurodegenerative Erkrankungen. LLPS wird oft durch selektive, transiente und multivalente Wechselwirkungen zwischen intrinsisch ungeordneten Proteinen angetrieben. Von großem Interesse ist die Interaktionsdynamik von Proteinen, die an LLPS beteiligt sind, die durch Messungen ihrer Bindungsverweilzeit (RT), d.h. der Zeit, die sie in Kondensaten gebunden verbringen, gut zusammengefasst wird. Hier stellen wir eine Methode vor, die auf der Einzelmolekül-Bildgebung lebender Zellen basiert und es uns ermöglicht, die mittlere RT eines bestimmten Proteins in Kondensaten zu messen. Wir visualisieren gleichzeitig einzelne Proteinmoleküle und die Kondensate, mit denen sie assoziiert sind, verwenden Single-Particle Tracking (SPT), um Einzelmolekül-Trajektorien aufzuzeichnen, und passen die Trajektorien dann an ein Modell der Protein-Tröpfchen-Bindung an, um die mittlere RT des Proteins zu extrahieren. Schließlich zeigen wir repräsentative Ergebnisse, bei denen diese Einzelmolekül-Bildgebungsmethode angewendet wurde, um die mittleren RTs eines Proteins an seinen LLPS-Kondensaten zu vergleichen, wenn es mit einer oligomerisierenden Domäne fusioniert und nicht fusioniert ist. Dieses Protokoll ist allgemein anwendbar auf die Messung der Interaktionsdynamik jedes Proteins, das an LLPS beteiligt ist.

A growing body of work suggests that biomolecular condensates play an important role in cellular organization and numerous cellular functions, e.g., transcriptional regulation1,2,3,4,5, DNA damage repair6,7,8, chromatin organization9,10,11,12, X-chromosome inactivation13,14,15, and intracellular signaling16,17,18. In addition, the dysregulation of biomolecular condensates is implicated in many diseases, including cancers19,20,21 and neurodegenerative disorders22,23,24,25,26. Condensate formation is often driven by transient, selective, and multivalent protein-protein, protein-nucleic acid, or nucleic acid-nucleic acid interactions27. Under certain conditions, these interactions can lead to liquid-liquid phase separation (LLPS), a density transition that locally enriches specific biomolecules in membraneless droplets. Such multivalent interactions are often mediated by the intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins1,28,29. Biophysical characterization of these interactions at the molecular level is critical to our understanding of numerous healthy and aberrant cellular functions, given the pervasiveness of condensates across them. Although techniques based on confocal fluorescence microscopy, e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)30,31,32, have been widely used to qualitatively show that the molecular exchanges between condensates and the surrounding cellular environment are dynamic, quantifying the interaction dynamics of specific biomolecules within condensates is generally not possible using conventional confocal microscopy or single-molecule microscopy without specialized data analysis methods. The single-particle tracking (SPT) technique described in this protocol is based on live-cell single-molecule microscopy33 and provides a uniquely powerful tool to quantify the interaction dynamics between specific proteins within condensates. The readout of SPT for such measurement is the mean residence time of a protein of interest in the condensates.
The protocol can be broken down into two parts - data acquisition and data analysis. The first step of imaging data acquisition is to express in cells a protein of interest that is fused to a HaloTag34. This enables labeling of the protein of interest with two fluorophores, where a majority of the protein molecules are to be labeled with a non-photoactivatable fluorophore (e.g., JFX549 Halo ligand35) and a small fraction of them are to be labeled with a spectrally distinct, photoactivatable fluorophore (e.g., PA-JF646 Halo ligand36). This allows for the simultaneous acquisition of all condensate locations in the cell and the acquisition of single-molecule movies of the protein of interest binding and unbinding to the condensates. Meanwhile, the same type of cells are modified to stably express Halo-tagged H2B, a histone that is largely immobile on chromatin. The cells are then stained with the PA-JF646 Halo ligand to enable single-molecule imaging of H2B. As will be discussed in detail below, this experiment accounts for the contribution of photobleaching to enable precise quantification of the interaction dynamics of the protein of interest. Cells for imaging experiments must then be cultured on clean coverslips, stained with HaloTag ligand(s), and assembled into a live-cell imaging chamber. From there, the sample is imaged under highly inclined and laminated optical sheet (HILO) illumination on a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope capable of two-channel imaging and single-molecule detection. The emission is then split onto two cameras, one tracking condensate positions and one tracking single molecules. Acquisition is performed with a long integration time (on the order of hundreds of ms) to blur out freely-diffusing proteins and only capture proteins that are less mobile due to binding to stable structures in the cell37.
The first step of data analysis is using an established single-particle tracking (SPT) algorithm38,39 to localize individual protein molecules in each frame of the movie and assemble the localizations into a trajectory for each molecule over its detectable lifetime. The trajectories are then sorted into those representing molecules inside and those representing molecules outside the condensates by comparing the localizations of the molecules throughout their trajectories to the localizations of all the condensates at the corresponding times1.
Next, a survival curve (1 - CDF) is generated using the lengths of all the in-condensate trajectories. The apparent mean residence time of the molecules is then extracted by fitting the survival curve to the following two-component exponential model of protein binding,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" />,
with A as the fraction of molecules non-specifically bound and with kobs,ns and kobs,s as the observed dissociation rates of the non-specifically bound and specifically bound molecules, respectively. Only kobs,s is considered from here onward. The dynamics of both protein dissociation, ktrue,s, and photobleaching of the fluorophore, kpb, contribute to kobs,s as
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" />;
thus, to isolate the effects of protein dissociation, the specific dissociation rate of H2B-Halo in the cell line mentioned prior is measured.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" />
H2B is a protein that is stably integrated into chromatin and that experiences minimal dissociation in the time scale of a single-molecule movie acquisition37. Its specific dissociation rate is then equal to the photobleaching rate of the PA-JF646 Halo ligand, or
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" />.
The mean in-condensate residence time of the protein of interest, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" />, is then
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" />.
Representative results from Irgen-Gioro et al.40 are shown, where this protocol was applied to demonstrate that fusing an oligomerization domain to IDR results in longer residence times of the IDR in its condensates. This result suggests that the added oligomerization domain stabilizes the homotypic interactions of the IDR that drives LLPS. In principle, the same method with slightly modified protocols can be applied to characterize the homotypic or heterotypic interactions of any protein that participates in the formation of any types of condensates.

Autor im Rampenlicht: Bewertung der Protein-Kondensat-Dynamik in lebenden menschlichen Zellen

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Hier präsentieren wir repräsentative Ergebnisse von Irgen-Gioro et al.40, wo wir dieses SPT-Protokoll verwendet haben, um die Interaktionsdynamik zweier Proteine in ihren jeweiligen selbstorganisierten LLPS-Kondensaten zu vergleichen. TAF15 (TATA-Box-Bindungsprotein-assoziierter Faktor 15) enthält einen IDR, der bei Überexpression in menschlichen Zellen einer LLPS unterzogen werden kann. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Fusion von TAF15(IDR) mit FTH1 (Ferritin-Schwerkette 1), das ein O...

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Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

2.7K Aufrufe.  California Institute of Technology. 1 Unser Labor zielt darauf ab, das Interaktionsverhalten2 von intrinsisch ungeordneten Proteinregionen 3 zu verstehen und zu verstehen, wie sie eine Rolle bei der transkriptionellen Regulation 4 in gesunden und kranken menschlichen Zellen spielen. 5 In unserem Labor entwickeln und verwenden wir neuartige 6 Einzelmolekül-Mikroskopietechniken 7 in Kombination mit Molekularbiologie, 8 biochemischen und proteomischen Ansätzen 9, um biomolekulare Kondensate z...

Serie: Autor im Rampenlicht: Bewertung der Protein-Kondensat-Dynamik in lebenden menschlichen Zellen

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.