تم دعم هذا العمل من قبل زمالة أبحاث الدراسات العليا لمؤسسة العلوم الوطنية بموجب المنحة رقم. DGE-1745301 (SY) ، جائزة Pew-Stewart Scholar (SC) ، جائزة Searle Scholar (SC) ، منحة أبحاث مؤسسة Shurl and Kay Curci (SC) ، منحة Merkin Innovation Seed Grant (SC) ، منحة Mallinckrodt للأبحاث (SC) ، و Margaret E. منحة صندوق البحوث الطبية المبكرة 2024 (SC). كما يتم دعم SC من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NCI بموجب الجائزة رقم P30CA016042.

1. وضع العلامات على البروتينات في الخلايا
<ol><li>عبر عن البروتين محل الاهتمام المنصهر في HaloTag في خط الخلية المطلوب.</li>
	<li>يعبر بثبات عن H2B الموسوم بالهالة في نفس النوع من الخلايا كما في 1.1 باستخدام الترانسبوزونات أو النقل الفيروسي.</li>
</ol>2. إعداد أغطية
<ol><li>قبل استخدام أغطية الأغطية لزراعة الخلايا ، قم بتنظيف أغطية الأغطية لإزالة الملوثات الفلورية الذاتية.<ol><li>قم بتركيب غطاء بقطر 25 مم ، # 1.5 على رف تلطيخ من السيراميك وضعه في وعاء من مادة البولي بروبيلين.</li>
		<li>اغمر أغطية الغطاء تماما في محلول 1 متر من KOH و sonicate لمدة 1 ساعة.</li>
		<li>شطف أغطية الأغطية ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج (ddH2O).</li>
		<li>اغمر تماما أغطية الإيثانول بنسبة 100٪ وصوتنة لمدة 1 ساعة.</li>
		<li>اغمر أغطية الغطاء تماما في 20٪ من الإيثانول المخفف ب ddH2O وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.</li>
	</ol></li>
</ol>3. تحضير الخلايا للفحص المجهري
ملاحظة: قم بتنفيذ خطوات من هذا القسم في خزانة السلامة الحيوية لمنع تلوث الخلايا.
<ol><li>خلايا لوحة على أغطية نظيفة. أداء 2 أيام قبل التصوير إذا كان سيتم التعبير عن البروتين الموسومة Halo بشكل عابر. أداء 1 يوم قبل التصوير إذا تم التعبير عن البروتين الموسومة Halo بثبات أو داخليا.<ol><li>استخدم ملقط معقم لوضع أغطية في لوحة ذات 6 آبار (غطاء واحد / بئر لكل عينة خلية) والسماح للإيثانول المتبقي بالتبخر.</li>
		<li>لوحة كل بئر مع عدد مناسب من الخلايا لتحقيق التقاء 70 ٪ بحلول وقت التصوير. لوحة بئر إضافية مع خلايا تعبر بثبات عن H2B-Halo مع نفس التقاء الهدف.</li>
		<li>اتبع هذه الخطوة فقط إذا كنت تعبر بشكل عابر عن البروتين الموسوم بالهالة محل الاهتمام. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا باستخدام البلازميد الذي يشفر البروتين الموسوم محل الاهتمام باستخدام كواشف النقل المناسبة واتباع إرشادات الشركة المصنعة.</li>
		<li>احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بتلطيخ الخلايا التي تعبر عن البروتين الموسوم بالهالة محل الاهتمام بكل من ليجند هالو غير قابل للتنشيط الضوئي (على سبيل المثال ، JFX549) وليجند هالة قابل للتنشيط الضوئي (على سبيل المثال ، PA-JF646). خلايا البقع التي تعبر عن H2B-Halo مع ليجند Halo القابل للتنشيط الضوئي فقط. ملاحظة: يجب استخدام تركيزات روابط الهالة المدرجة هنا كنقطة انطلاق. يعتمد التركيز الأمثل على مستوى التعبير والتركيز المحلي المكثف للبروتين محل الاهتمام.<ol><li>لكل عينة خلية تعبر عن البروتين الموسوم بالهالة محل الاهتمام ، قم بتخفيف 100 نانومتر JFX549 Halo ligand35 و 20 nM PA-JF646 Haloligand 36 في 500 ميكرولتر من وسائط الخلية المناسبة. لكل عينة تعبر عن H2B-Halo ، قم بتخفيف 20 نانومتر فقط PA-JF646 Halo ligand في 500 ميكرولتر من وسائط الخلية المناسبة.</li>
		<li>لكل بئر ، قم باستنشاق الوسائط الموجودة ، وأضف 2 مل من 1x PBS ، ثم استنشاق PBS (يشار إلى هذا باسم "شطف" لبقية البروتوكول) ، واستبدله بالوسائط التي تحتوي على روابط Halo المناسبة.</li>
		<li>احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
		<li>شطف مع برنامج تلفزيوني أربع مرات واستبدالها بوسائط جديدة لا تحتوي على روابط هالة.</li>
		<li>احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
		<li>كرر الخطوتين 3.2.4 و 3.2.5 ثلاث مرات (إجمالي أربع دورات شطف وحضانة).</li>
		<li>استخدم ملقط معقم لنقل غطاء الغطاء مع الخلايا إلى غرفة غطاء زراعة الخلايا المتوافقة مع مرحلة المجهر.</li>
		<li>أضف وسائط خالية من الفينول الأحمر إلى الغرفة وانتقل إلى التصوير. احتضان العينات التي لم يتم تصويرها على الفور عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى الحاجة.</li>
	</ol></li>
</ol>4. التصوير أحادي الجزيء
ملاحظة: يجب إجراء تجارب مستقلة تقيس أوقات الإقامة لكل من H2B والبروتين محل الاهتمام عبر عدة أيام (≥3) لتوليد نتائج ذات دلالة إحصائية. قبل تصوير عينات الخلايا على المجهر ، قم بمحاذاة الكاميرتين باستخدام كريات مجهرية ملطخة 0.1 ميكرومتر (جدول المواد) أو معيار معايرة مماثل.
<ol><li>تحضير المجهر.<ol><li>قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر الذي يتحكم في المجهر.</li>
		<li>قم بتشغيل مكونات حضانة الخلايا الحية (السخان وثاني أكسيد الكربون2) على المجهر واضبطه على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. اسمح للنظام بالتوازن.</li>
		<li>ضع قطرة من الزيت المناسب على هدف غمر زيت TIRF 100x على المجهر وقم بتحميل عينة الخلية على مرحلة المجهر.</li>
	</ol></li>
	<li>تحديد خلية لصورة.<ol><li>قم بتصوير عينة الخلية تحت إضاءة برايت فيلد واضبط موضع z حتى يتم التركيز على الخلايا.</li>
		<li>تحديد الخلية التي تظهر الخصائص المورفولوجية للخلايا السليمة.</li>
		<li>اقتصاص مجال الرؤية (FOV) بحيث يلتقط فقط نواة الخلية المستهدفة.</li>
		<li>استخدم إضاءة الليزر واضبط زاوية TIRF حتى يتم تحقيق إضاءة HILO41 مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى للجزيئات المفردة.</li>
	</ol></li>
	<li>صورة H2B-Halo في الخلايا الحية. ملاحظة: قوى الليزر المستخدمة في هذا القسم خاصة بهذه التجربة وتم تضمينها كمثال. يجب اختيار قوى الليزر المناسبة وفقا للمعايير المدرجة في المناقشة.<ol><li>قم بإعداد تكوين اكتساب على النحو التالي. اضبط وقت التعرض على 500 مللي ثانية. خلال كل تعرض 500 مللي ثانية ، قم بإثارة جزيئات PA-JF646 المسمى H2B-Halo بحزمة 9.1 ميجاوات و 640 نانومتر. خلال الوقت الميت بين الإطارات (158.01 μs على نظام التصوير المستخدم هنا) ، قم بتنشيط الجزيئات ضوئيا بحزمة 111 μW ، 405 نانومتر.</li>
		<li>التقط 2000 إطار باستمرار ضمن هذه الإعدادات. قم بزيادة قدرة الحزمة 405 نانومتر تدريجيا على مدار عملية الاستحواذ عندما يصبح عدد الجزيئات المنشطة ضوئيا غير كاف.</li>
	</ol></li>
	<li>تخيل البروتين الموسوم بالهالة الذي يهم الخلايا الحية.<ol><li>استخدم مرآة ثنائية اللون طويلة التمرير لتقسيم الأطوال الموجية للانبعاث بين كاميرتين ، واحدة للكشف عن PA-JF646 والأخرى لاكتشاف JFX549. استخدم مرشحات الانبعاثات المناسبة أمام الكاميرات.</li>
		<li>استخدم نفس تكوين الاستحواذ الموضح في 4.3.1 مع التعديل التالي. أضف قناة JFX549 إضافية لتتبع مواقع مكثفات البروتين الموسومة بالهالة بمرور الوقت. كل 10 ثوان ، احصل على إطار واحد (500 مللي ثانية ، 2.1 ميجاوات ، إثارة 561 نانومتر) في قناة JFX549 مع الحفاظ على اكتساب قناة PA-JF646. سيؤدي ذلك إلى حدوث نزيف في قناة PA-JF646 ، والتي سيتم الاهتمام بها في تحليل بيانات ما بعد الاستحواذ.</li>
		<li>التقط 2000 إطار باستمرار ضمن هذه الإعدادات. قم بزيادة قدرة الحزمة 405 نانومتر تدريجيا على مدار عملية الاستحواذ عندما يصبح عدد الجزيئات المنشطة ضوئيا غير كاف.</li>
	</ol></li>
</ol>5. تحليل بيانات التصوير أحادية الجزيء
ملاحظة: المعلمات المستخدمة في القسم 5 خاصة بهذه التجربة ومضمنة كمثال. يجب اختيار المعلمات المناسبة وفقا للمعايير المدرجة في المناقشة.
<ol><li>إعداد بيانات التصوير الخام للمعالجة.<ol><li>للحصول على بيانات البروتين محل الاهتمام ، قم بتحويل كل قناة من ملف بيانات التصوير الخام إلى ملف .tif مستقل باستخدام ImageJ أو برنامج معالجة صور مشابه. بالنسبة لبيانات H2B ، قم بتحويل القناة المفردة من ملف بيانات التصوير الخام إلى ملف .tif بنفس الطريقة. ملاحظة: اعتمادا على برنامج الاستحواذ المستخدم ، يمكن أن تكون هناك إطارات فارغة في فيلم المكثفات ، حيث يتم أخذ إطار واحد فقط لتتبع المكثفات كل 10 ثوان. يجب ملء الإطارات الفارغة بأحدث إطار مكثف (تقوم بعض برامج الاستحواذ بذلك تلقائيا). بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان هناك نزيف كبير من قناة المكثف (JFX549) إلى قناة الجزيء الواحد (PA-JF646) أثناء إطارات تتبع المكثفات هذه ، فيجب استبدال إطارات الجزيء الواحد المقابلة بأحدث إطار أحادي الجزيء.</li>
		<li>إذا كانت هناك أي إطارات تحتاج إلى استبدالها في أي من الفيلمين للأسباب المذكورة أعلاه ، فاستبدلها بأحدث إطار من هذا الفيلم عن طريق تعديل (إذا لزم الأمر) و pretracking_comb.txt تشغيل ماكرو ImageJ متوفر في Chong et al.1 ، واتباع المطالبات.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بإنشاء مسارات أحادية الجسيمات باستخدام برنامج SPT ، على سبيل المثال ، SLIMfast39 ، وهو تطبيق واجهة المستخدم الرسومية لخوارزمية MTT38 المتوفرة في Teves et al.42.<ol><li>قم بتحميل الملف من 5.1.2 الذي يحتوي على الفيلم أحادي الجزيء في SLIMfast بالنقر فوق تحميل > Imagestack.</li>
		<li>اضبط المعلمات (معدل خطأ الترجمة: 10-6 ؛ حلقات الانكماش: 3) للتعريب بالنقر فوق ورقة > OPT: الترجمة.</li>
		<li>اضبط المعلمات (ذروة الانبعاث: 664 نانومتر ؛ وقت التأخر: 500 مللي ثانية) للاكتساب بالنقر فوق OPT > ورقة: اكتساب.</li>
		<li>تصور توطين جميع الجزيئات في إطار واحد للتأكد من أن المعلمات المختارة مناسبة (TEST LOC). إذا لم يكن ذلك مناسبا ، فقم بتعديل المعلمات في الخطوتين 5.2.2 و 5.2.3 وكرر هذه الخطوة.</li>
		<li>قم بإنشاء ملف يحتوي على توطين جميع الجزيئات في كل إطار (LOC ALL).</li>
		<li>قم بتحميل الملف من 5.2.5 في SLIMfast بالنقر فوق تحميل > بيانات الجسيمات > SLIMfast.</li>
		<li>اضبط المعلمات (الحد الأقصى لمعامل الانتشار المتوقع: 0.1 ميكرومتر2 / ثانية ؛ الحد الأقصى لعدد المنافسين: 5) لتوليد المسار بالنقر فوق OPT > ورقة: التتبع.</li>
		<li>قم بإنشاء ملف يحتوي على مسارات جميع الجزيئات (GEN TRAJ).</li>
	</ol></li>
	<li>قم بتصفية المسارات الأقصر من tmin ، 2.5 s ، باستخدام evalSPT39 ، المتاح في Drosopoulos et al.43 ، لحساب أخطاء التتبع التي تؤدي إلى مسارات قصيرة بشكل مصطنع.<ol><li>قم بتحميل الملف من 5.2.8 إلى evalSPT (+ ملف > من 5.2.8 > موافق).</li>
		<li>اضبط المعلمات (الحد الأدنى: 5 إطارات ؛ الحد الأقصى: الحد الأقصى لطول المسار للملف من 5.2.8) لتصفية المسارات الأقصر من 2.5 ثانية.</li>
		<li>قم بإنشاء ملف بجميع المسارات التي تمت تصفيتها (تصدير البيانات).</li>
	</ol></li>
	<li>اتبع هذه الخطوة لمسارات البروتين محل الاهتمام فقط. قم بفرز المسارات إلى تلك الموجودة في المكثفات وخارج المكثفات ، ثم استخرج متوسط وقت الإقامة داخل المكثفات. ملاحظة: جميع رموز هذا القسم متوفرة في Chong et al.1.<ol><li>قم بضبط جميع إطارات الفيلم التي تم الحصول عليها في قناة JFX549 لإنشاء فيلم بفاصل زمني مملوء بالقناع الثنائي المتطور زمنيا الذي يبرز مواقع المكثفات عن طريق تشغيل mask_v2.txt الماكرو والنواة والكتلة ImageJ واتباع المطالبات.</li>
		<li>إعادة تنسيق مسارات الجزيء الواحد المتولدة في 5.3.3. باستخدام البرنامج النصي MATLAB ، ConvertASCII_SlowTracking_css3 m ، وضبط أسماء الملفات والمسارات والمعلمات حسب الضرورة. (المعلمات: التعرض ، 0.5 ثانية ؛ الدقة ، 0.16 ميكرومتر / بكسل).</li>
		<li>قم بفرز المسارات بناء على جزء العمر الذي يقضيه جزيء معين في مكثف ، F ، باستخدام البرنامج النصي MATLAB ، categorization_v4.m ، وضبط أسماء الملفات والمسارات حسب الضرورة.</li>
		<li>تابع باستخدام مسارات المكثفات فقط.</li>
	</ol></li>
	<li>استخرج kobs و s و kpb واحسب متوسط وقت الإقامة المصحح ، <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">.<ol><li>استخرج kobs,s من مسارات البروتين المكثف محل الاهتمام باستخدام البرنامج النصي MATLAB ، PLOT_ResidenceHist_css.m ، وضبط أسماء الملفات والمسارات والمعلمات حسب الضرورة. (المعلمات: التعرض ، 0.5 ثانية ؛ ستارت فريم فورفيت ، 5 إطارات).</li>
		<li>استخرج kpb من مسارات H2B باستخدام البرنامج النصي MATLAB ، PLOT_ResidenceHist_css.m ، وضبط أسماء الملفات والمسارات والمعلمات حسب الضرورة. (المعلمات: التعرض ، 0.5 ثانية ؛ ستارت فريم فورفيت ، 5 إطارات).</li>
		<li>احسب متوسط وقت الإقامة المصحح للبروتين محل الاهتمام المرتبط تحديدا بمكثفاته ، <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">على النحو التالي: <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;"> ملاحظة: يجب إجراء الضوابط للتحقق من أن أوقات التعرض المختلفة الطويلة بما يكفي لطمس الجسيمات المتحركة ، على سبيل المثال ، 300 مللي ثانية و 800 مللي ثانية ، لا تزال تؤدي إلى نفس متوسط وقت بقاء البروتين محل الاهتمام.</li>
	</ol></li>
</ol>

القياس الكمي القائم على التصوير أحادي الجزيء للخلية الحية لتفاعلات البروتين

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تم تصميم البروتوكول كما هو معروض هنا لأنظمة مثل تلك التي تم التحقيق فيها في Irgen-Gioro et al.40. اعتمادا على التطبيق ، يمكن تعديل بعض مكونات البروتوكول ، على سبيل المثال ، طريقة إنشاء خطوط الخلايا ذات العلامات الفلورية ، ونظام وضع العلامات الفلورية ، وأسلوب غطاء الغطاء المستخدم. يمكن ...

تشير مجموعة متزايدة من الأعمال إلى أن المكثفات الجزيئية الحيوية تلعب دورا مهما في التنظيم الخلوي والعديد من الوظائف الخلوية ، على سبيل المثال ، تنظيم النسخ1،2،3،4،5 ، إصلاح تلف الحمض النووي6،7،8 ، تنظيم الكروماتين9،10،11،12 ، كروموسوم X تعطيل13،14،15 ، والإشارات داخل الخلايا16،17،18. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم تنظيم المكثفات الجزيئية الحيوية متورط في العديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطانات19،20،21 والاضطرابات التنكسية العصبية22،23،24،25،26. غالبا ما يكون تكوين المكثفات مدفوعا ببروتين بروتين عابر وانتقائي ومتعدد التكافؤ أو حمض نووي بروتيني أو تفاعلات حمض نووي - حمض نووي27. في ظل ظروف معينة ، يمكن أن تؤدي هذه التفاعلات إلى فصل الطور السائل عن السائل (LLPS) ، وهو انتقال الكثافة الذي يثري محليا جزيئات حيوية محددة في قطرات خالية من الغشاء. غالبا ما يتم التوسط في مثل هذه التفاعلات متعددة التكافؤ من خلال المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) للبروتينات1،28،29. يعد التوصيف الفيزيائي الحيوي لهذه التفاعلات على المستوى الجزيئي أمرا بالغ الأهمية لفهمنا للعديد من الوظائف الخلوية الصحية والشاذة ، نظرا لانتشار المكثفات عبرها. على الرغم من أن التقنيات القائمة على الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر ، على سبيل المثال ، استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) 30،31،32 ، قد استخدمت على نطاق واسع لإظهار نوعيا أن التبادلات الجزيئية بين المكثفات والبيئة الخلوية المحيطة ديناميكية ، فإن تحديد ديناميكيات التفاعل لجزيئات حيوية محددة داخل المكثفات غير ممكن بشكل عام باستخدام المجهر التقليدي متحد البؤر أو جزيء واحد الفحص المجهري بدون طرق تحليل البيانات المتخصصة. تعتمد تقنية تتبع الجسيمات المفردة (SPT) الموصوفة في هذا البروتوكول على المجهر أحادي الجزيء33 للخلية الحية وتوفر أداة قوية بشكل فريد لتحديد ديناميكيات التفاعل بين بروتينات معينة داخل المكثفات. قراءة SPT لمثل هذا القياس هي متوسط وقت بقاء البروتين المهم في المكثفات.
يمكن تقسيم البروتوكول إلى قسمين - الحصول على البيانات وتحليل البيانات. تتمثل الخطوة الأولى في الحصول على بيانات التصوير في التعبير في الخلايا عن بروتين مهم يتم دمجه في HaloTag34. يتيح ذلك وضع علامات على البروتين محل الاهتمام باثنين من الفلوروفورات ، حيث يتم تمييز غالبية جزيئات البروتين بفلوروفور غير قابل للتنشيط الضوئي (على سبيل المثال ، JFX549 Halo ligand35) ويتم تمييز جزء صغير منها بفلوروفور متميز طيفيا وقابل للتنشيط الضوئي (على سبيل المثال ، PA-JF646 Halo ligand36). وهذا يسمح بالاستحواذ المتزامن على جميع مواقع المكثفات في الخلية والحصول على أفلام أحادية الجزيء من البروتين المرتبط وغير المرتبط بالمكثفات. وفي الوقت نفسه ، يتم تعديل نفس النوع من الخلايا للتعبير بثبات عن H2B الموسوم بالهالة ، وهو حجر غير متحرك إلى حد كبير على الكروماتين. ثم يتم تلطيخ الخلايا ب PA-JF646 Halo ligand لتمكين التصوير أحادي الجزيء ل H2B. كما سيتم مناقشته بالتفصيل أدناه ، فإن هذه التجربة تفسر مساهمة التبييض الضوئي لتمكين التحديد الكمي الدقيق لديناميكيات التفاعل للبروتين محل الاهتمام. يجب بعد ذلك زراعة الخلايا المستخدمة في تجارب التصوير على أغطية نظيفة ، وملطخة ب HaloTag ligand (s) ، وتجميعها في غرفة تصوير الخلايا الحية. من هناك ، يتم تصوير العينة تحت إضاءة ورقة بصرية مائلة للغاية ومصفحة (HILO) على مجهر مضان انعكاس داخلي كلي (TIRF) قادر على التصوير ثنائي القناة واكتشاف جزيء واحد. ثم يتم تقسيم الانبعاث إلى كاميرتين ، واحدة تتبع مواقع المكثفات والأخرى تتبع جزيئات واحدة. يتم إجراء الاكتساب مع وقت تكامل طويل (بترتيب مئات مللي ثانية) لطمس البروتينات المنتشرة بحرية والتقاط البروتينات الأقل قدرة على الحركة فقط بسبب الارتباط بالهياكل المستقرة في الخلية37.
تتمثل الخطوة الأولى في تحليل البيانات في استخدام خوارزمية تتبع الجسيمات المفردة (SPT)38,39 لتوطين جزيئات البروتين الفردية في كل إطار من الفيلم وتجميع عمليات التوطين في مسار لكل جزيء على مدار عمره القابل للاكتشاف. ثم يتم فرز المسارات إلى تلك التي تمثل الجزيئات الموجودة بالداخل وتلك التي تمثل الجزيئات خارج المكثفات من خلال مقارنة توطين الجزيئات عبر مساراتها بتوطين جميع المكثفات في الأوقات المقابلة1.
بعد ذلك ، يتم إنشاء منحنى البقاء (1 - CDF) باستخدام أطوال جميع مسارات المكثفات. ثم يتم استخراج متوسط وقت الإقامة الظاهري للجزيئات عن طريق ملاءمة منحنى البقاء على النموذج الأسي المكون من عنصرين التالي لارتباط البروتين ،
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;">,
مع A كجزء من الجزيئات غير المرتبطة على وجه التحديد ومع kobs و ns و kobs و s كمعدلات تفكك ملحوظة للجزيئات غير المرتبطة على وجه التحديد والجزيئات المرتبطة على وجه التحديد ، على التوالي. فقط kobs ، s يعتبر من هنا فصاعدا. تساهم ديناميكيات كل من تفكك البروتين ، ktrue ، s ، والتبييض الضوئي للفلوروفور ، kpb ، في kobs ، s ك
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;">;
وبالتالي ، لعزل آثار تفكك البروتين ، يتم قياس معدل التفكك المحدد ل H2B-Halo في خط الخلية المذكور سابقا.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;">
H2B هو بروتين مدمج بثبات في الكروماتين ويعاني من الحد الأدنى من التفكك في النطاق الزمني لاكتساب فيلم أحاديالجزيء 37. ثم يكون معدل تفككه المحدد مساويا لمعدل التبييض الضوئي ل PA-JF646 Halo ligand ، أو
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;">.
متوسط وقت الإقامة في المكثف للبروتين محل الاهتمام ، <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">هو إذن
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;">.
يتم عرض النتائج التمثيلية من Irgen-Gioro et al.40 ، حيث تم تطبيق هذا البروتوكول لإثبات أن دمج مجال oligomerization إلى IDR يؤدي إلى أوقات إقامة أطول ل IDR في مكثفاته. تشير هذه النتيجة إلى أن مجال oligomerization المضاف يعمل على استقرار التفاعلات المتجانسة ل IDR التي تحرك LLPS. من حيث المبدأ ، يمكن تطبيق نفس الطريقة مع البروتوكولات المعدلة قليلا لتوصيف التفاعلات المتجانسة أو غير المتجانسة لأي بروتين يشارك في تكوين أي نوع من المكثفات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m TetraSpeck microsphere</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Diameter, #1.5 Coverslips</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>111650</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>593/40 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>676/37 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-676/37-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well TC Plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-105MP</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line: U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 
			.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Rack</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>24957</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Low Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-567-022</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Lab Alley</td>
			<td>EAP200-1GAL</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evalSPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikon Ultra CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>X-13723</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R635-25x36</td>
			<td>Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUN-F Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: 405/488/561/640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nucleus and cluster mask_v2.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6984-06</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pretracking_comb.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLIMfast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubation system</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: For live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwinCam dual emission image splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>5800</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule measurement of protein interaction dynamics within biomolecular condensates

تعتبر المكثفات الجزيئية الحيوية المتكونة عن طريق فصل الطور السائل عن السائل (LLPS) حاسمة في التنظيم الخلوي وعدد متزايد من الوظائف الخلوية. يعد توصيف LLPS في الخلايا الحية أمرا مهما أيضا لأن التكثيف الشاذ مرتبط بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطانات والاضطرابات التنكسية العصبية. غالبا ما يكون LLPS مدفوعا بالتفاعلات الانتقائية والعابرة والمتعددة التكافؤ بين البروتينات المضطربة جوهريا. من الأمور ذات الأهمية الكبيرة ديناميات تفاعل البروتينات المشاركة في LLPS ، والتي يتم تلخيصها جيدا من خلال قياسات وقت إقامتها المرتبط (RT) ، أي مقدار الوقت الذي تقضيه داخل المكثفات. هنا ، نقدم طريقة تعتمد على تصوير الخلية الحية أحادية الجزيء تسمح لنا بقياس متوسط RT لبروتين معين داخل المكثفات. نحن نتصور في وقت واحد جزيئات البروتين الفردية والمكثفات التي ترتبط بها ، ونستخدم تتبع الجسيمات المفردة (SPT) لرسم مسارات أحادية الجزيء ، ثم نلائم المسارات مع نموذج ارتباط قطرات البروتين لاستخراج متوسط RT للبروتين. أخيرا ، نعرض نتائج تمثيلية حيث تم تطبيق طريقة التصوير أحادية الجزيء هذه لمقارنة متوسط RTs للبروتين في مكثفات LLPS عند دمجها وعدم دمجها في مجال oligomerizing. ينطبق هذا البروتوكول على نطاق واسع لقياس ديناميكيات التفاعل لأي بروتين يشارك في LLPS.

A growing body of work suggests that biomolecular condensates play an important role in cellular organization and numerous cellular functions, e.g., transcriptional regulation1,2,3,4,5, DNA damage repair6,7,8, chromatin organization9,10,11,12, X-chromosome inactivation13,14,15, and intracellular signaling16,17,18. In addition, the dysregulation of biomolecular condensates is implicated in many diseases, including cancers19,20,21 and neurodegenerative disorders22,23,24,25,26. Condensate formation is often driven by transient, selective, and multivalent protein-protein, protein-nucleic acid, or nucleic acid-nucleic acid interactions27. Under certain conditions, these interactions can lead to liquid-liquid phase separation (LLPS), a density transition that locally enriches specific biomolecules in membraneless droplets. Such multivalent interactions are often mediated by the intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins1,28,29. Biophysical characterization of these interactions at the molecular level is critical to our understanding of numerous healthy and aberrant cellular functions, given the pervasiveness of condensates across them. Although techniques based on confocal fluorescence microscopy, e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)30,31,32, have been widely used to qualitatively show that the molecular exchanges between condensates and the surrounding cellular environment are dynamic, quantifying the interaction dynamics of specific biomolecules within condensates is generally not possible using conventional confocal microscopy or single-molecule microscopy without specialized data analysis methods. The single-particle tracking (SPT) technique described in this protocol is based on live-cell single-molecule microscopy33 and provides a uniquely powerful tool to quantify the interaction dynamics between specific proteins within condensates. The readout of SPT for such measurement is the mean residence time of a protein of interest in the condensates.
The protocol can be broken down into two parts - data acquisition and data analysis. The first step of imaging data acquisition is to express in cells a protein of interest that is fused to a HaloTag34. This enables labeling of the protein of interest with two fluorophores, where a majority of the protein molecules are to be labeled with a non-photoactivatable fluorophore (e.g., JFX549 Halo ligand35) and a small fraction of them are to be labeled with a spectrally distinct, photoactivatable fluorophore (e.g., PA-JF646 Halo ligand36). This allows for the simultaneous acquisition of all condensate locations in the cell and the acquisition of single-molecule movies of the protein of interest binding and unbinding to the condensates. Meanwhile, the same type of cells are modified to stably express Halo-tagged H2B, a histone that is largely immobile on chromatin. The cells are then stained with the PA-JF646 Halo ligand to enable single-molecule imaging of H2B. As will be discussed in detail below, this experiment accounts for the contribution of photobleaching to enable precise quantification of the interaction dynamics of the protein of interest. Cells for imaging experiments must then be cultured on clean coverslips, stained with HaloTag ligand(s), and assembled into a live-cell imaging chamber. From there, the sample is imaged under highly inclined and laminated optical sheet (HILO) illumination on a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope capable of two-channel imaging and single-molecule detection. The emission is then split onto two cameras, one tracking condensate positions and one tracking single molecules. Acquisition is performed with a long integration time (on the order of hundreds of ms) to blur out freely-diffusing proteins and only capture proteins that are less mobile due to binding to stable structures in the cell37.
The first step of data analysis is using an established single-particle tracking (SPT) algorithm38,39 to localize individual protein molecules in each frame of the movie and assemble the localizations into a trajectory for each molecule over its detectable lifetime. The trajectories are then sorted into those representing molecules inside and those representing molecules outside the condensates by comparing the localizations of the molecules throughout their trajectories to the localizations of all the condensates at the corresponding times1.
Next, a survival curve (1 - CDF) is generated using the lengths of all the in-condensate trajectories. The apparent mean residence time of the molecules is then extracted by fitting the survival curve to the following two-component exponential model of protein binding,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" />,
with A as the fraction of molecules non-specifically bound and with kobs,ns and kobs,s as the observed dissociation rates of the non-specifically bound and specifically bound molecules, respectively. Only kobs,s is considered from here onward. The dynamics of both protein dissociation, ktrue,s, and photobleaching of the fluorophore, kpb, contribute to kobs,s as
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" />;
thus, to isolate the effects of protein dissociation, the specific dissociation rate of H2B-Halo in the cell line mentioned prior is measured.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" />
H2B is a protein that is stably integrated into chromatin and that experiences minimal dissociation in the time scale of a single-molecule movie acquisition37. Its specific dissociation rate is then equal to the photobleaching rate of the PA-JF646 Halo ligand, or
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" />.
The mean in-condensate residence time of the protein of interest, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" />, is then
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" />.
Representative results from Irgen-Gioro et al.40 are shown, where this protocol was applied to demonstrate that fusing an oligomerization domain to IDR results in longer residence times of the IDR in its condensates. This result suggests that the added oligomerization domain stabilizes the homotypic interactions of the IDR that drives LLPS. In principle, the same method with slightly modified protocols can be applied to characterize the homotypic or heterotypic interactions of any protein that participates in the formation of any types of condensates.

تسليط الضوء على المؤلف: تقييم ديناميكيات مكثفات البروتين في الخلايا البشرية الحية

قياس جزيء واحد لديناميكيات تفاعل البروتين داخل المكثفات الجزيئية الحيوية

1 Our lab aims to understand the interaction behaviors<v>2 of intrinsically disordered protein regions 3 and how they play roles in transcriptional regulation 4 in healthy and diseased human cells. 5 In our lab, we develop and use novel 6 single molecule microscopy techniques 7 in combination with molecular biology, 8 biochemical and proteomic approaches 9 to study biomolecular condensates. 10 This protocol enables the quantification of the dynamics 11 by which a specific protein 12 binds to a particular type of condensate 13 in live human cells, 14 and is broadly applicable 15 to measuring the interaction dynamics of any protein 16 that participates in liquid-liquid phase separation.

هنا ، نقدم نتائج تمثيلية من Irgen-Gioro et al.40 ، حيث استخدمنا بروتوكول SPT هذا لمقارنة ديناميكيات التفاعل بين بروتينين في مكثفات LLPS المجمعة ذاتيا. يحتوي TAF15 (العامل المرتبط بالبروتين المرتبط بصندوق TATA) على IDR يمكن أن يخضع ل LLPS عند الإفراط في التعبير في الخلايا البشرية. افترضنا أن دمج TAF15...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Evaluation of Protein-Condensate Dynamics in Live Human Cells at JoVE.com

لقد ثبت أن العديد من البروتينات المضطربة جوهريا تشارك في تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية الديناميكية للغاية ، وهو سلوك مهم للعديد من العمليات الخلوية. هنا ، نقدم طريقة قائمة على التصوير أحادي الجزيء لتحديد الديناميات التي تتفاعل بها البروتينات مع بعضها البعض في المكثفات الجزيئية الحيوية في الخلايا الحية.

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

single-molecule-measurement-protein-interaction-dynamics-within

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

2.5K Views.  California Institute of Technology. 1 يهدف مختبرنا إلى فهم سلوكيات التفاعل2 لمناطق البروتين المضطربة جوهريا 3 وكيف تلعب أدوارا في تنظيم النسخ 4 في الخلايا البشرية السليمة والمريضة. 5 في مختبرنا ، نقوم بتطوير واستخدام 6 تقنيات مجهرية جديدة أحادية الجزيء 7 بالاشتراك مع البيولوجيا الجزيئية ، و ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تقييم ديناميكيات مكثفات البروتين في الخلايا البشرية الحية

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Halo-Ligand Staining of Cells for Protein Condensate-Interaction Studies Using Single-Molecule Imaging

1 After creating the cell lines<v>2 expressing the HaloTag protein of interest and Halo-H2B, 3 prepare the halo ligand staining reagent 4 separately for both of them. 5 Rinse the cells with two milliliters of PBS. 6 Add halo ligand containing media 7 and incubate them at 37 degrees Celsius 8 with 5%carbon dioxide for one hour.9 After removing the staining media, 10 rinse the cells four times with PBS 11 and incubate them with fresh media devoid of halo ligands. 12 After four such rinse incubation cycles, 13 transfer the cover slip with cells 14 to a microscope stage compatible chamber 15 with sterile forceps. 16 Add phenol red-free media to the chamber before imaging.

تلطيخ الخلايا بالهالة ليجند لدراسات تفاعل مكثفات البروتين باستخدام التصوير أحادي الجزيء

Single-Molecule Imaging of Halo-Tagged Proteins to Study Protein-Condensate Interactions

1 To begin, obtain ligand stain cells<v>2 expressing halo-tagged protein of interest and halo H2B. 3 After turning on the microscope system, 4 set the live cell incubation parameters 5 and let the system equilibrate. 6 Put a drop of the oil onto 7 a 100x TIRF objective on the microscope 8 and load the cell sample onto the microscope stage.9 To identify a morphologically healthy cell, 10 adjust the Z position 11 and image the cell sample under brightfield illumination. 12 Crop the field of view to capture the target cell nucleus. 13 Using laser illumination, adjust the TIRF angle 14 to achieve hilo illumination with an optimal 15 signal to noise ratio of a single molecule.16 Then, set the exposure time to 500 milliseconds. 17 During the dead time between frames, 18 photo activate the molecules 19 with a 111 microwatt 405 nanometer beam, 20 and during each exposure, excite H2B halo molecules 21 with a 9.1 milliwatt 640 nanometer beam. 22 Initiate image capturing for 2000 frames continuously 23 and gradually increase the power of the 405 nanometer beam 24 upon reduction of photo activated molecules.25 For a halo-tagged protein of interest, 26 split emission wavelengths between two cameras 27 using a long pass dichroic mirror. 28 To the same acquisition parameters demonstrated earlier, 29 add JFX549 channel to acquire one frame every 10 seconds 30 and capture 2000 frames continuously.

تصوير أحادي الجزيء للبروتينات الموسومة بالهالة لدراسة تفاعلات البروتين والمكثفات

Analysis of Single-Molecule Imaging Data to Study Interactions of Halo-Tagged Proteins

1 To begin, perform live cell<v>2 single molecule imaging of HaloTag protein condensates. 3 Using ImageJ, convert each channel 4 from the raw imaging data file 5 into an independent TIFF file. 6 If necessary, run pre-tracking comb.text 7 and follow the prompts 8 to replace any frames with the most recent ones. 9 To load the single molecule of movie file in SlimFast, 10 click on load, followed by image stack. 11 Set the parameters for localization 12 and acquisition under respective option sheets.13 Visualize the localizations of all the molecules. 14 And using lock all, 15 generate a file containing the localizations 16 of all the molecules in every frame. 17 Next, go to load particle data 18 and select SlimFast to load the file 19 with localization and acquisition settings.20 Using option and sheet tracking, 21 adjust the parameters for trajectory generation. 22 Click on gen traj to generate a file 23 containing the trajectories of all the molecules. 24 Load the sheet tracked file into eval SPT 25 and set the parameters 26 to filter out the trajectories shorter than 2.5 seconds.27 Using export data, generate a file 28 with all the filtered trajectories. 29 Running the ImageJ macro, nucleus, 30 and cluster mask version two. text, 31 threshold all the frames of the movie acquired 32 in the JFX549 channel to generate a time lapse movie 33 populated with the time evolving binary mask 34 highlighting condensate locations.35 Using convert ASCII slow tracking CSS 3. M, 36 reformat the trajectories 37 and run categorization version 4. M 38 to sort them based on the lifetime 39 a molecule spends in a condensate.40 Next, using plot residence hist CSS. M, 41 extract the observed dissociation rate 42 of specifically bound molecules 43 and the photobleaching rate from the in condensate 44 protein of interest and the H2B trajectories. 45 Finally, calculate the corrected mean residence time 46 of the protein of interest, 47 specifically bound to its condensates.48 A frame from two-color single molecule movie 49 of TAF15 IDR-Halo-FTH1 shows signals 50 from the nucleus in both PA-JF646 and JFX549 channels. 51 Upon assembling and sorting, 52 a clear distinction was observed for the trajectories 53 of PA-JF646 detected molecules bound to the condensates. 54 The calculated mean residence times 55 after correction for photobleaching 56 were more for TAF15-Halo-FTH1 than Halo-TAF15.