Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship nell'ambito della sovvenzione n. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.) e Margaret E. Sovvenzione Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. è anche supportato dal NIH/NCI con il numero di premio P30CA016042.

1. Marcatura delle proteine nelle cellule
<ol><li>Esprimere la proteina di interesse fusa con HaloTag nella linea cellulare desiderata.</li>
	<li>Esprime stabilmente H2B con tag alogeno nello stesso tipo di cellule di cui alla versione 1.1 utilizzando trasposoni o trasduzione virale.</li>
</ol>2. Preparazione dei vetrini coprioggetti
<ol><li>Prima di utilizzare i vetrini coprioggetti per la coltura cellulare, pulire i vetrini coprioggetti per rimuovere i contaminanti autofluorescenti.<ol><li>Montare vetrini coprioggetti #1,5 di diametro 25 mm su un rack per colorazione in ceramica e inserirli in un contenitore in polipropilene.</li>
		<li>Immergere completamente i vetrini coprioggetti in una soluzione 1 M di KOH e sonicare per 1 ora.</li>
		<li>Sciacquare tre volte i vetrini coprioggetti con acqua bidistillata (ddH2O).</li>
		<li>Immergere completamente i vetrini coprioggetti in etanolo al 100% e sonicare per 1 ora.</li>
		<li>Immergere completamente i vetrini coprioggetti in etanolo al 20% diluito con ddH2O e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparazione delle cellule per la microscopia
NOTA: Eseguire i passaggi di questa sezione in una cabina di biosicurezza per evitare la contaminazione delle cellule.
<ol><li>Piastre su vetrini coprioggetti puliti. Eseguire 2 giorni prima dell'imaging se la proteina Halo-tagged deve essere espressa in modo transitorio. Eseguire 1 giorno prima dell'imaging se la proteina Halo-taggata è espressa in modo stabile o endogeno.<ol><li>Utilizzare una pinza sterile per posizionare i vetrini coprioggetti in una piastra a 6 pozzetti (un vetrino coprioggetti/pozzetto per campione di cellula) e lasciare evaporare l'etanolo residuo.</li>
		<li>Placcare ogni pozzetto con un numero appropriato di cellule per ottenere il 70% di confluenza al momento dell'imaging. Placcare un ulteriore pozzetto con cellule che esprimono stabilmente H2B-Halo con la stessa confluenza target.</li>
		<li>Seguire questo passaggio solo se si esprime transitoriamente la proteina Halo-tagged di interesse. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2 . Quindi, trasfettare le cellule con il plasmide che codifica la proteina marcata di interesse utilizzando reagenti di trasfezione appropriati e seguendo le linee guida del produttore.</li>
		<li>Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2 .</li>
	</ol></li>
	<li>Colorare le cellule che esprimono la proteina Halo-taggata di interesse sia con un ligando Halo non fotoattivabile (ad esempio, JFX549) che con un ligando Halo fotoattivabile (ad esempio, PA-JF646). Colora le cellule che esprimono H2B-Halo con solo il ligando Halo fotoattivabile. NOTA: Le concentrazioni dei ligandi dell'alone qui elencate devono essere utilizzate come punto di partenza; La concentrazione ottimale dipenderà dal livello di espressione e dalla concentrazione locale in condensato della proteina di interesse.<ol><li>Per ogni campione di cellule che esprime la proteina Halo-tagged di interesse, diluire 100 nM JFX549 Halo ligando35 e 20 nM PA-JF646 Halo ligando36 in 500 μL di terreno cellulare appropriato. Per ogni campione che esprime H2B-Halo, diluire solo 20 nM PA-JF646 Halo ligando in 500 μL di terreno cellulare appropriato.</li>
		<li>Per ogni pozzetto, aspirare i terreni esistenti, aggiungere 2 mL di PBS 1x, quindi aspirare PBS (questo è indicato come "risciacquo" per il resto del protocollo) e sostituire con terreni contenenti i ligandi Halo appropriati.</li>
		<li>Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2 .</li>
		<li>Risciacquare con PBS quattro volte e sostituirlo con un terreno fresco privo di ligandi Halo.</li>
		<li>Incubare per 15 minuti a 37 °C e 5% di CO2 .</li>
		<li>Ripetere i passaggi 3.2.4 e 3.2.5 tre volte (quattro cicli di risciacquo-incubazione in totale).</li>
		<li>Utilizzare una pinza sterile per trasferire il vetrino coprioggetto con le cellule in una camera di vetrino coprioggetto per coltura cellulare compatibile con il tavolino del microscopio.</li>
		<li>Aggiungere alla camera un terreno privo di rosso fenolo e procedere all'imaging. Incubare i campioni non immediatamente sottoposti a imaging a 37 °C e al 5% di CO2 fino al momento del bisogno.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imaging di una singola molecola
NOTA: Esperimenti indipendenti che misurano i tempi di permanenza sia dell'H2B che della proteina di interesse devono essere condotti per più giorni (≥3) per generare risultati statisticamente significativi. Prima di eseguire l'imaging dei campioni di cellule al microscopio, allineare le due telecamere utilizzando microsfere colorate da 0,1 μm (Tabella dei materiali) o uno standard di calibrazione simile.
<ol><li>Preparare il microscopio.<ol><li>Accendere il microscopio e il computer che controlla il microscopio.</li>
		<li>Accendere i componenti di incubazione delle cellule vive (riscaldatore e CO2 ) sul microscopio e impostarlo a 37 °C e 5% di CO2 . Lasciare che il sistema si equilibri.</li>
		<li>Mettere una goccia dell'olio appropriato su un obiettivo a immersione in olio TIRF 100x sul microscopio e caricare il campione di cellule sul tavolino del microscopio.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificare una cellula da visualizzare.<ol><li>Visualizzare il campione di cellule in campo chiaro e regolare la posizione z fino a quando le cellule non sono a fuoco.</li>
		<li>Identificare una cellula che presenta le caratteristiche morfologiche delle cellule sane.</li>
		<li>Ritaglia il campo visivo (FOV) in modo che catturi solo il nucleo della cellula bersaglio.</li>
		<li>Utilizzare l'illuminazione laser e regolare l'angolo TIRF fino a ottenere l'illuminazione HILO41 con un rapporto segnale/rumore ottimale delle singole molecole.</li>
	</ol></li>
	<li>Immagine H2B-Halo in cellule vive. NOTA: Le potenze laser utilizzate in questa sezione sono specifiche per questo esperimento e incluse come esempio. Le potenze laser appropriate devono essere scelte in base ai criteri elencati nella discussione.<ol><li>Impostare una configurazione di acquisizione come indicato di seguito. Impostare il tempo di esposizione su 500 ms. Durante ogni esposizione di 500 ms, eccitare le molecole di H2B-Halo marcate PA-JF646 con un fascio di 9,1 mW, 640 nm. Durante il tempo morto tra i fotogrammi (158,01 μs sul sistema di imaging qui utilizzato), fotoattivare le molecole con un fascio di 111 μW, 405 nm.</li>
		<li>Cattura 2000 fotogrammi in modo continuo con queste impostazioni. Aumentare gradualmente la potenza del fascio di 405 nm nel corso dell'acquisizione quando il numero di molecole fotoattivate diventa insufficiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Immagina la proteina Halo-taggata di interesse nelle cellule vive.<ol><li>Utilizzare uno specchio dicroico passa-lungo per dividere le lunghezze d'onda di emissione tra due telecamere, una per rilevare PA-JF646 e l'altra per rilevare JFX549. Utilizzare filtri di emissione appropriati davanti alle telecamere.</li>
		<li>Utilizzare la stessa configurazione di acquisizione descritta in 4.3.1 con la seguente modifica. Aggiungi un ulteriore canale JFX549 per tenere traccia delle posizioni dei condensati proteici con Halo-tagged, nel tempo. Ogni 10 s, acquisire un fotogramma (500 ms, 2,1 mW, 561 nm di eccitazione) nel canale JFX549 mantenendo l'acquisizione del canale PA-JF646. Ciò causerà un'emorragia nel canale PA-JF646, che verrà gestita nell'analisi dei dati post-acquisizione.</li>
		<li>Cattura 2000 fotogrammi in modo continuo con queste impostazioni. Aumentare gradualmente la potenza del fascio di 405 nm nel corso dell'acquisizione quando il numero di molecole fotoattivate diventa insufficiente.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analisi dei dati di imaging di singole molecole
NOTA: i parametri utilizzati nella sezione 5 sono specifici per questo esperimento e inclusi come esempio. I parametri appropriati dovrebbero essere scelti in base ai criteri elencati nella discussione.
<ol><li>Preparare i dati di imaging grezzi per l'elaborazione.<ol><li>Per i dati della proteina di interesse, convertire ciascun canale dal file di dati di imaging grezzo in un file di .tif indipendente utilizzando ImageJ o un software di elaborazione delle immagini simile. Per i dati di H2B, convertire il singolo canale dal file di dati di imaging grezzo in un file .tif allo stesso modo. NOTA: A seconda del software di acquisizione utilizzato, possono essere presenti fotogrammi vuoti nel filmato della condensa, poiché viene acquisito un solo fotogramma di tracciamento della condensa ogni 10 s. I frame vuoti devono essere popolati con il frame di condensa più recente (alcuni software di acquisizione lo fanno automaticamente). Inoltre, se c'è un significativo bleedthrough dal canale del condensato (JFX549) al canale della singola molecola (PA-JF646) durante quei frame di tracciamento del condensato, i corrispondenti frame a singola molecola devono essere sostituiti con il frame a singola molecola più recente.</li>
		<li>Se ci sono fotogrammi che devono essere sostituiti in uno dei filmati per i motivi di cui sopra, sostituirli con il fotogramma più recente di quel filmato modificando (se necessario) ed eseguendo pretracking_comb.txt, una macro ImageJ disponibile in Chong et al.1, e seguendo le istruzioni.</li>
	</ol></li>
	<li>Generare traiettorie a singola particella utilizzando un software SPT, ad esempio SLIMfast39, un'implementazione GUI dell'algoritmo MTT38 disponibile in Teves et al.42.<ol><li>Caricare il file dalla versione 5.1.2 contenente il filmato a singola molecola in SLIMfast cliccando su Carica > Imagestack.</li>
		<li>Impostare i parametri (tasso di errore di localizzazione: 10-6; cicli di deflazione: 3) per la localizzazione facendo clic su OPT > Foglio: Localizzazione.</li>
		<li>Impostare i parametri (emissione di picco: 664 nm; tempo di ritardo: 500 ms) per l'acquisizione facendo clic su OPT > Foglio: Acquisizione.</li>
		<li>Visualizzare le localizzazioni di tutte le molecole in un unico fotogramma per garantire che i parametri scelti siano appropriati (TEST LOC). Se non è appropriato, modificare i parametri nei passaggi 5.2.2 e 5.2.3 e ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Genera un file contenente le localizzazioni di tutte le molecole in ogni frame (LOC ALL).</li>
		<li>Caricare il file dalla versione 5.2.5 in SLIMfast facendo clic su Carica > dati particellari > SLIMfast.</li>
		<li>Impostare i parametri (coefficiente di diffusione massimo previsto: 0,1 μm2/s; numero massimo di concorrenti: 5) per la generazione della traiettoria cliccando su OPT > Foglio: Inseguimento.</li>
		<li>Generare un file contenente le traiettorie di tutte le molecole (GEN TRAJ).</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrare le traiettorie che sono più corte di tmin, 2,5 s, usando evalSPT39, disponibile in Drosopoulos et al.43, per tenere conto degli errori di tracciamento che si traducono in traiettorie artificialmente corte.<ol><li>Caricare il file dalla versione 5.2.8 in evalSPT (+ > file dalla versione 5.2.8 > OK).</li>
		<li>Impostare i parametri (min: 5 fotogrammi; max: lunghezza massima della traiettoria per il file da 5.2.8) per filtrare le traiettorie più corte di 2.5 s.</li>
		<li>Generare un file con tutte le traiettorie filtrate (EXPORT DATA).</li>
	</ol></li>
	<li>Segui questo passaggio solo per le traiettorie della proteina di interesse. Ordinare le traiettorie in quelle nelle condense e nelle condense, quindi estrarre il tempo medio di permanenza nella condensa. NOTA: Tutti i codici per questa sezione sono disponibili in Chong et al.1.<ol><li>Limita tutti i fotogrammi del filmato acquisiti nel canale JFX549 per generare un filmato time-lapse popolato con la maschera binaria che si evolve nel tempo evidenziando le posizioni della condensa eseguendo la macro, il nucleo e il cluster ImageJ mask_v2.txt e seguendo le istruzioni.</li>
		<li>Riformattare le traiettorie a singola molecola generate in 5.3.3. utilizzando lo script MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, e regolando i nomi dei file, i percorsi e i parametri in base alle esigenze. (Parametri: Esposizione, 0,5 s; Risoluzione, 0,16 μm/pixel).</li>
		<li>Ordina le traiettorie in base alla frazione della vita che una data molecola trascorre in un condensato, F, utilizzando lo script MATLAB, categorization_v4.m, e regolando i nomi dei file e i percorsi in base alle esigenze.</li>
		<li>Procedere utilizzando solo traiettorie in condensa.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrarre kobs,s e kpb e calcolare il tempo medio di permanenza corretto, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">.<ol><li>Estrai kobs,s dalle traiettorie della proteina di interesse in-condensate utilizzando lo script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, e regolando i nomi dei file, i percorsi e i parametri in base alle esigenze. (Parametri: Esposizione, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 fotogrammi).</li>
		<li>Estrai kpb dalle traiettorie H2B utilizzando lo script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, e regolando i nomi dei file, i percorsi e i parametri in base alle esigenze. (Parametri: Esposizione, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 fotogrammi).</li>
		<li>Calcolare il tempo medio corretto di permanenza della proteina di interesse specificamente legata ai suoi condensati, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">come <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: I controlli devono essere eseguiti per verificare che tempi di esposizione diversi che sono abbastanza lunghi da offuscare le particelle mobili, ad esempio 300 ms e 800 ms, si traducano ancora nello stesso tempo medio di permanenza della proteina di interesse.</li>
	</ol></li>
</ol>

Quantificazione delle interazioni proteiche basata sull'imaging di singole molecole su cellule vive

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui presentato è progettato per sistemi come quelli studiati in Irgen-Gioro et al.40. A seconda dell'applicazione, alcuni componenti del protocollo possono essere modificati, ad esempio il metodo per generare linee cellulari marcate con fluorescenza, il sistema di marcatura fluorescente e lo stile di vetrino coprioggetto utilizzato. L'halo-tagging di una proteina in una cellula può essere fatto usando due strategie, a seconda di quale sia più adatta per un determinato esperimento....

Un numero crescente di lavori suggerisce che i condensati biomolecolari svolgono un ruolo importante nell'organizzazione cellulare e in numerose funzioni cellulari, ad esempio la regolazione trascrizionale 1,2,3,4,5, la riparazione del danno al DNA 6,7,8, l'organizzazione della cromatina 9,10,11,12, il cromosoma X inattivazione 13,14,15 e segnalazione intracellulare 16,17,18. Inoltre, la disregolazione dei condensati biomolecolari è implicata in molte malattie, tra cui i tumori 19,20,21 e le malattie neurodegenerative 22,23,24,25,26. La formazione di condensa è spesso guidata da interazioni transienti, selettive e multivalenti proteina-proteina, proteina-acido nucleico o acido nucleico-acido nucleico27. In determinate condizioni, queste interazioni possono portare alla separazione di fase liquido-liquido (LLPS), una transizione di densità che arricchisce localmente biomolecole specifiche in goccioline prive di membrana. Tali interazioni multivalenti sono spesso mediate dalle regioni intrinsecamente disordinate (IDR) delle proteine 1,28,29. La caratterizzazione biofisica di queste interazioni a livello molecolare è fondamentale per la nostra comprensione di numerose funzioni cellulari sane e aberranti, data la pervasività dei condensati attraverso di esse. Sebbene le tecniche basate sulla microscopia a fluorescenza confocale, ad esempio il recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP)30,31,32, siano state ampiamente utilizzate per dimostrare qualitativamente che gli scambi molecolari tra i condensati e l'ambiente cellulare circostante sono dinamici, quantificare le dinamiche di interazione di specifiche biomolecole all'interno dei condensati non è generalmente possibile utilizzando la microscopia confocale convenzionale o la microscopia a singola molecola microscopia senza metodi specializzati di analisi dei dati. La tecnica di tracciamento di singole particelle (SPT) descritta in questo protocollo si basa sulla microscopia a singola molecola di cellule vive33 e fornisce uno strumento straordinariamente potente per quantificare le dinamiche di interazione tra proteine specifiche all'interno dei condensati. La lettura dell'SPT per tale misurazione è il tempo medio di permanenza di una proteina di interesse nei condensati.
Il protocollo può essere suddiviso in due parti: acquisizione e analisi dei dati. Il primo passo dell'acquisizione dei dati di imaging è quello di esprimere nelle cellule una proteina di interesse che viene fusa con un HaloTag34. Ciò consente di marcare la proteina di interesse con due fluorofori, dove la maggior parte delle molecole proteiche devono essere marcate con un fluoroforo non fotoattivabile (ad esempio, JFX549 Halo ligando35) e una piccola frazione di esse deve essere marcata con un fluoroforo spettralmente distinto e fotoattivabile (ad esempio, PA-JF646 Halo ligando36). Ciò consente l'acquisizione simultanea di tutte le posizioni dei condensati nella cellula e l'acquisizione di film a singola molecola della proteina di interesse che si lega e si dislega ai condensati. Nel frattempo, lo stesso tipo di cellule viene modificato per esprimere stabilmente H2B con Halo-tagged, un istone che è in gran parte immobile sulla cromatina. Le cellule vengono quindi colorate con il ligando PA-JF646 Halo per consentire l'imaging di una singola molecola di H2B. Come verrà discusso in dettaglio in seguito, questo esperimento tiene conto del contributo del fotosbiancamento per consentire una quantificazione precisa delle dinamiche di interazione della proteina di interesse. Le cellule per gli esperimenti di imaging devono quindi essere coltivate su vetrini coprioggetti puliti, colorate con ligandi HaloTag e assemblate in una camera di imaging per cellule vive. Da lì, il campione viene ripreso sotto l'illuminazione di un foglio ottico altamente inclinato e laminato (HILO) su un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) in grado di eseguire l'imaging a due canali e il rilevamento di una singola molecola. L'emissione viene quindi suddivisa su due telecamere, una che traccia le posizioni del condensato e una che traccia le singole molecole. L'acquisizione viene eseguita con un lungo tempo di integrazione (dell'ordine di centinaia di ms) per offuscare le proteine che diffondono liberamente e catturare solo le proteine che sono meno mobili a causa del legame con strutture stabili nella cellula37.
Il primo passo dell'analisi dei dati consiste nell'utilizzare un algoritmo di tracciamento a singola particella (SPT)38,39 per localizzare le singole molecole proteiche in ogni fotogramma del filmato e assemblare le localizzazioni in una traiettoria per ciascuna molecola nel corso della sua vita rilevabile. Le traiettorie vengono quindi ordinate in quelle che rappresentano le molecole all'interno e quelle che rappresentano le molecole all'esterno dei condensati confrontando le localizzazioni delle molecole lungo le loro traiettorie con le localizzazioni di tutti i condensati nei tempi corrispondenti1.
Successivamente, viene generata una curva di sopravvivenza (1 - CDF) utilizzando le lunghezze di tutte le traiettorie in condensa. Il tempo medio apparente di permanenza delle molecole viene quindi estratto adattando la curva di sopravvivenza al seguente modello esponenziale a due componenti di legame proteico,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;">,
con A come frazione di molecole non specificamente legate e con kobs,ns e kobs,s come i tassi di dissociazione osservati delle molecole non specificamente legate e specificamente legate, rispettivamente. Da qui in poi vengono considerati solo kobs,s . La dinamica sia della dissociazione proteica, ktrue,s, che del fotosbiancamento del fluoroforo, kpb, contribuisce a kobs,s come
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;">;
quindi, per isolare gli effetti della dissociazione proteica, viene misurato il tasso di dissociazione specifico di H2B-Halo nella linea cellulare menzionata in precedenza.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;">
L'H2B è una proteina che è stabilmente integrata nella cromatina e che sperimenta una dissociazione minima nella scala temporale dell'acquisizione di un film a singola molecola37. Il suo tasso di dissociazione specifica è quindi uguale al tasso di fotosbiancamento del ligando PA-JF646 Halo, o
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;">.
Il tempo medio di permanenza nel condensato della proteina di interesse, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, è quindi
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;">.
Vengono mostrati i risultati rappresentativi di Irgen-Gioro et al.40 , dove questo protocollo è stato applicato per dimostrare che la fusione di un dominio di oligomerizzazione con l'IDR si traduce in tempi di permanenza più lunghi dell'IDR nei suoi condensati. Questo risultato suggerisce che il dominio di oligomerizzazione aggiunto stabilizza le interazioni omotipiche dell'IDR che guida le LLPS. In linea di principio, lo stesso metodo con protocolli leggermente modificati può essere applicato per caratterizzare le interazioni omotipiche o eterotipiche di qualsiasi proteina che partecipi alla formazione di qualsiasi tipo di condensato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m TetraSpeck microsphere</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Diameter, #1.5 Coverslips</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>111650</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>593/40 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>676/37 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-676/37-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well TC Plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-105MP</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line: U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 
			.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Rack</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>24957</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Low Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-567-022</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Lab Alley</td>
			<td>EAP200-1GAL</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evalSPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikon Ultra CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>X-13723</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R635-25x36</td>
			<td>Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUN-F Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: 405/488/561/640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nucleus and cluster mask_v2.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6984-06</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pretracking_comb.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLIMfast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubation system</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: For live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwinCam dual emission image splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>5800</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule measurement of protein interaction dynamics within biomolecular condensates

I condensati biomolecolari formati tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS) sono stati considerati critici nell'organizzazione cellulare e in un numero crescente di funzioni cellulari. La caratterizzazione delle LLPS nelle cellule vive è importante anche perché la condensazione aberrante è stata collegata a numerose malattie, tra cui tumori e disturbi neurodegenerativi. La LLPS è spesso guidata da interazioni selettive, transitorie e multivalenti tra proteine intrinsecamente disordinate. Di grande interesse sono le dinamiche di interazione delle proteine che partecipano alle LLPS, che sono ben riassunte dalle misurazioni del loro tempo di residenza di legame (RT), cioè la quantità di tempo che trascorrono legate all'interno dei condensati. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging di singole molecole di cellule vive che ci consente di misurare la RT media di una specifica proteina all'interno dei condensati. Visualizziamo simultaneamente le singole molecole proteiche e i condensati a cui si associano, utilizziamo il tracciamento di singole particelle (SPT) per tracciare le traiettorie delle singole molecole e quindi adattiamo le traiettorie a un modello di legame proteina-gocciolina per estrarre l'RT medio della proteina. Infine, mostriamo risultati rappresentativi in cui questo metodo di imaging a singola molecola è stato applicato per confrontare gli RT medi di una proteina nei suoi condensati LLPS quando fusa e non fusa in un dominio oligomerizzante. Questo protocollo è ampiamente applicabile alla misurazione delle dinamiche di interazione di qualsiasi proteina che partecipa alle LLPS.

A growing body of work suggests that biomolecular condensates play an important role in cellular organization and numerous cellular functions, e.g., transcriptional regulation1,2,3,4,5, DNA damage repair6,7,8, chromatin organization9,10,11,12, X-chromosome inactivation13,14,15, and intracellular signaling16,17,18. In addition, the dysregulation of biomolecular condensates is implicated in many diseases, including cancers19,20,21 and neurodegenerative disorders22,23,24,25,26. Condensate formation is often driven by transient, selective, and multivalent protein-protein, protein-nucleic acid, or nucleic acid-nucleic acid interactions27. Under certain conditions, these interactions can lead to liquid-liquid phase separation (LLPS), a density transition that locally enriches specific biomolecules in membraneless droplets. Such multivalent interactions are often mediated by the intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins1,28,29. Biophysical characterization of these interactions at the molecular level is critical to our understanding of numerous healthy and aberrant cellular functions, given the pervasiveness of condensates across them. Although techniques based on confocal fluorescence microscopy, e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)30,31,32, have been widely used to qualitatively show that the molecular exchanges between condensates and the surrounding cellular environment are dynamic, quantifying the interaction dynamics of specific biomolecules within condensates is generally not possible using conventional confocal microscopy or single-molecule microscopy without specialized data analysis methods. The single-particle tracking (SPT) technique described in this protocol is based on live-cell single-molecule microscopy33 and provides a uniquely powerful tool to quantify the interaction dynamics between specific proteins within condensates. The readout of SPT for such measurement is the mean residence time of a protein of interest in the condensates.
The protocol can be broken down into two parts - data acquisition and data analysis. The first step of imaging data acquisition is to express in cells a protein of interest that is fused to a HaloTag34. This enables labeling of the protein of interest with two fluorophores, where a majority of the protein molecules are to be labeled with a non-photoactivatable fluorophore (e.g., JFX549 Halo ligand35) and a small fraction of them are to be labeled with a spectrally distinct, photoactivatable fluorophore (e.g., PA-JF646 Halo ligand36). This allows for the simultaneous acquisition of all condensate locations in the cell and the acquisition of single-molecule movies of the protein of interest binding and unbinding to the condensates. Meanwhile, the same type of cells are modified to stably express Halo-tagged H2B, a histone that is largely immobile on chromatin. The cells are then stained with the PA-JF646 Halo ligand to enable single-molecule imaging of H2B. As will be discussed in detail below, this experiment accounts for the contribution of photobleaching to enable precise quantification of the interaction dynamics of the protein of interest. Cells for imaging experiments must then be cultured on clean coverslips, stained with HaloTag ligand(s), and assembled into a live-cell imaging chamber. From there, the sample is imaged under highly inclined and laminated optical sheet (HILO) illumination on a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope capable of two-channel imaging and single-molecule detection. The emission is then split onto two cameras, one tracking condensate positions and one tracking single molecules. Acquisition is performed with a long integration time (on the order of hundreds of ms) to blur out freely-diffusing proteins and only capture proteins that are less mobile due to binding to stable structures in the cell37.
The first step of data analysis is using an established single-particle tracking (SPT) algorithm38,39 to localize individual protein molecules in each frame of the movie and assemble the localizations into a trajectory for each molecule over its detectable lifetime. The trajectories are then sorted into those representing molecules inside and those representing molecules outside the condensates by comparing the localizations of the molecules throughout their trajectories to the localizations of all the condensates at the corresponding times1.
Next, a survival curve (1 - CDF) is generated using the lengths of all the in-condensate trajectories. The apparent mean residence time of the molecules is then extracted by fitting the survival curve to the following two-component exponential model of protein binding,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" />,
with A as the fraction of molecules non-specifically bound and with kobs,ns and kobs,s as the observed dissociation rates of the non-specifically bound and specifically bound molecules, respectively. Only kobs,s is considered from here onward. The dynamics of both protein dissociation, ktrue,s, and photobleaching of the fluorophore, kpb, contribute to kobs,s as
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" />;
thus, to isolate the effects of protein dissociation, the specific dissociation rate of H2B-Halo in the cell line mentioned prior is measured.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" />
H2B is a protein that is stably integrated into chromatin and that experiences minimal dissociation in the time scale of a single-molecule movie acquisition37. Its specific dissociation rate is then equal to the photobleaching rate of the PA-JF646 Halo ligand, or
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" />.
The mean in-condensate residence time of the protein of interest, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" />, is then
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" />.
Representative results from Irgen-Gioro et al.40 are shown, where this protocol was applied to demonstrate that fusing an oligomerization domain to IDR results in longer residence times of the IDR in its condensates. This result suggests that the added oligomerization domain stabilizes the homotypic interactions of the IDR that drives LLPS. In principle, the same method with slightly modified protocols can be applied to characterize the homotypic or heterotypic interactions of any protein that participates in the formation of any types of condensates.

Autore in primo piano: Valutazione della dinamica proteina-condensato in cellule umane vive

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Qui, presentiamo i risultati rappresentativi di Irgen-Gioro et al.40, dove abbiamo utilizzato questo protocollo SPT per confrontare le dinamiche di interazione di due proteine nei rispettivi condensati LLPS auto-assemblati. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) contiene un IDR che può essere sottoposto a LLPS in seguito a sovraespressione nelle cellule umane. Abbiamo ipotizzato che la fusione di TAF15 (IDR) con FTH1 (catena pesante di ferritina 1), che forma un oligomero a 24 subu...

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È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

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Research

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Biology

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

2.7K Views.  California Institute of Technology. 1 Il nostro laboratorio si propone di comprendere i comportamenti di interazione2 delle regioni proteiche intrinsecamente disordinate 3 e come esse svolgono un ruolo nella regolazione trascrizionale 4 in cellule umane sane e malate. 5 Nel nostro laboratorio, sviluppiamo e utilizziamo nuove tecniche di microscopia a singola molecola 7 in combinazione con la biologia molecolare, 8 approcci biochimici e proteomici 9 per studiare condensati biomolecolari. 10 Q...

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Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.