Este trabajo fue apoyado por la Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Subvención No. DGE-1745301 (S.Y.), Premio Académico Pew-Stewart (Carolina del Sur), Premio Académico Searle (Carolina del Sur), Beca de Investigación de la Fundación Shurl y Kay Curci (Carolina del Sur), Beca Semilla de Innovación Merkin (Carolina del Sur), Beca de Investigación Mallinckrodt (Carolina del Sur) y la Beca de Investigación Margaret E. Subvención Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. también cuenta con el apoyo de los NIH/NCI bajo la Adjudicación Número P30CA016042.

1. Marcaje de proteínas en células
<ol><li>Exprese la proteína de interés fusionada a HaloTag en la línea celular deseada.</li>
	<li>Exprese de manera estable H2B marcado con Halo en el mismo tipo de células que en 1.1 utilizando transposones o transducción viral.</li>
</ol>2. Preparación de cubreobjetos
<ol><li>Antes de usar cubreobjetos para cultivos celulares, límpielos para eliminar los contaminantes autofluorescentes.<ol><li>Monte los cubreobjetos #1.5 de 25 mm de diámetro en una rejilla de tinción de cerámica y colóquelos en un recipiente de polipropileno.</li>
		<li>Sumerja completamente los cubreobjetos en una solución 1 M de KOH y sonique durante 1 h.</li>
		<li>Enjuague los cubreobjetos tres veces con agua bidestilada (ddH2O).</li>
		<li>Sumergir completamente los cubreobjetos en etanol al 100% y sonicar durante 1 h.</li>
		<li>Sumergir completamente los cubreobjetos en etanol al 20% diluido con ddH2O y conservar a 4 °C hasta su uso.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparación de células para microscopía
NOTA: Realice los pasos de esta sección en una cabina de bioseguridad para evitar la contaminación de las células.
<ol><li>Coloque las celdas en cubreobjetos limpios. Realice 2 días antes de la obtención de imágenes si la proteína marcada con Halo se va a expresar transitoriamente. Realizar 1 día antes de la obtención de imágenes si la proteína marcada con Halo se expresa de forma estable o endógena.<ol><li>Use pinzas estériles para colocar cubreobjetos en una placa de 6 pocillos (un cubreobjetos/pocillo por muestra de célula) y deje que el etanol residual se evapore.</li>
		<li>Coloque una placa en cada pocillo con un número adecuado de células para lograr una confluencia del 70 % en el momento de la obtención de imágenes. Coloque un pocillo adicional con células que expresen H2B-Halo de forma estable con la misma confluencia objetivo.</li>
		<li>Siga este paso solo si expresa transitoriamente la proteína marcada con Halo de interés. Incubar las células durante 24 h a 37 °C y 5% de CO2. A continuación, transfecte las células con el plásmido que codifica la proteína marcada de interés utilizando los reactivos de transfección adecuados y siguiendo las directrices del fabricante.</li>
		<li>Incubar las células durante 24 h a 37 °C y 5% de CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Tiñir las células que expresan la proteína marcada con Halo de interés con un ligando Halo no fotoactivable (p. ej., JFX549) y un ligando Halo fotoactivable (p. ej., PA-JF646). Tiñe las células que expresan H2B-Halo solo con el ligando Halo fotoactivable. NOTA: Las concentraciones de ligandos de Halo enumeradas aquí deben usarse como punto de partida; La concentración óptima dependerá del nivel de expresión y de la concentración local en condensado de la proteína de interés.<ol><li>Para cada muestra de célula que exprese la proteína marcada con Halo de interés, diluir 100 nM JFX549 Haloligando 35 y 20 nM PA-JF646 Haloligando 36 en 500 μL de medio celular apropiado. Para cada muestra que exprese H2B-Halo, diluir solo 20 nM del ligando PA-JF646 Halo en 500 μL de medio celular apropiado.</li>
		<li>Para cada pocillo, aspire el medio existente, agregue 2 ml de PBS 1x, luego aspire PBS (esto se conoce como "enjuague" para el resto del protocolo) y reemplácelo con un medio que contenga los ligandos Halo apropiados.</li>
		<li>Incubar durante 1 h a 37 °C y 5% de CO2.</li>
		<li>Enjuague con PBS cuatro veces y reemplácelo con medios nuevos que no contengan ligandos Halo.</li>
		<li>Incubar durante 15 min a 37 °C y 5% de CO2.</li>
		<li>Repita los pasos 3.2.4 y 3.2.5 tres veces (cuatro ciclos de enjuague-incubación en total).</li>
		<li>Utilice pinzas estériles para transferir el cubreobjetos con células a una cámara de cubreobjetos de cultivo celular compatible con la platina del microscopio.</li>
		<li>Agregue medios libres de rojo de fenol a la cámara y proceda a la obtención de imágenes. Incubar las muestras que no se están fotografiando inmediatamente a 37 °C y 5% de CO2 hasta que se necesiten.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imágenes de una sola molécula
NOTA: Los experimentos independientes que miden los tiempos de residencia tanto de H2B como de la proteína de interés deben realizarse a lo largo de varios días (≥3) para generar resultados estadísticamente significativos. Antes de obtener imágenes de muestras de células en el microscopio, alinee las dos cámaras utilizando microesferas teñidas de 0,1 μm (Tabla de materiales) o un estándar de calibración similar.
<ol><li>Prepara el microscopio.<ol><li>Encienda el microscopio y la computadora que controla el microscopio.</li>
		<li>Encienda los componentes de incubación de células vivas (calentador y CO2) en el microscopio y ajústelo a 37 °C y 5% de CO2. Permita que el sistema se equilibre.</li>
		<li>Coloque una gota del aceite apropiado en un objetivo de inmersión en aceite TIRF 100x en el microscopio y cargue la muestra celular en la platina del microscopio.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifique una celda para obtener una imagen.<ol><li>Obtenga una imagen de la muestra de celda bajo iluminación de campo claro y ajuste la posición z hasta que las celdas estén enfocadas.</li>
		<li>Identificar una célula que exhibe características morfológicas de células sanas.</li>
		<li>Recorte el campo de visión (FOV) para que solo capture el núcleo de la célula objetivo.</li>
		<li>Utilice la iluminación láser y ajuste el ángulo TIRF hasta que se logre la iluminación HILO41 con una relación señal-ruido óptima de moléculas individuales.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagen H2B-Halo en células vivas. NOTA: Las potencias láser utilizadas en esta sección son específicas de este experimento y se incluyen como ejemplo. Las potencias láser apropiadas deben elegirse de acuerdo con los criterios enumerados en la discusión.<ol><li>Establezca una configuración de adquisición de la siguiente manera. Establezca el tiempo de exposición en 500 ms. Durante cada exposición de 500 ms, excite las moléculas de Halo H2B marcadas con PA-JF646 con un haz de 9,1 mW y 640 nm. Durante el tiempo muerto entre fotogramas (158,01 μs en el sistema de imágenes utilizado aquí), fotoactiva las moléculas con un haz de 111 μW y 405 nm.</li>
		<li>Capture 2000 fotogramas de forma continua con estos ajustes. Aumente gradualmente la potencia del haz de 405 nm en el transcurso de la adquisición cuando el número de moléculas fotoactivadas sea insuficiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagen de la proteína marcada con Halo de interés en células vivas.<ol><li>Utilice un espejo dicroico de paso largo para dividir las longitudes de onda de emisión entre dos cámaras, una para detectar PA-JF646 y la otra para detectar JFX549. Utilice filtros de emisión apropiados frente a las cámaras.</li>
		<li>Utilice la misma configuración de adquisición descrita en 4.3.1 con la siguiente modificación. Agregue un canal JFX549 adicional para realizar un seguimiento de las ubicaciones de los condensados de proteínas marcados con Halo a lo largo del tiempo. Cada 10 s, adquiera una trama (500 ms, 2,1 mW, 561 nm de excitación) en el canal JFX549 mientras mantiene la adquisición del canal PA-JF646. Esto provocará una fuga en el canal PA-JF646, que se solucionará en el análisis de datos posterior a la adquisición.</li>
		<li>Capture 2000 fotogramas de forma continua con estos ajustes. Aumente gradualmente la potencia del haz de 405 nm en el transcurso de la adquisición cuando el número de moléculas fotoactivadas sea insuficiente.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análisis de datos de imágenes de una sola molécula
NOTA: Los parámetros utilizados en la sección 5 son específicos de este experimento y se incluyen como ejemplo. Los parámetros apropiados deben elegirse de acuerdo con los criterios enumerados en la discusión.
<ol><li>Prepare los datos de imágenes sin procesar para su procesamiento.<ol><li>Para los datos de la proteína de interés, convierta cada canal del archivo de datos de imágenes sin procesar en un archivo de .tif independiente utilizando ImageJ o un software de procesamiento de imágenes similar. Para los datos de H2B, convierta el canal único del archivo de datos de imágenes sin procesar en un archivo .tif de la misma manera. NOTA: Dependiendo del software de adquisición que se utilice, puede haber fotogramas vacíos en la película de condensado, ya que solo se toma un fotograma de seguimiento de condensado cada 10 s. Las tramas vacías deben rellenarse con la trama de condensado más reciente (algún software de adquisición lo hace automáticamente). Además, si hay un sangrado significativo desde el canal de condensado (JFX549) hacia el canal de una sola molécula (PA-JF646) durante esos marcos de seguimiento de condensado, los marcos de una sola molécula correspondientes deben reemplazarse con el marco de una sola molécula más reciente.</li>
		<li>Si hay fotogramas que deban reemplazarse en cualquiera de las películas debido a las razones anteriores, reemplácelos con el fotograma más reciente de esa película modificando (si es necesario) y ejecutando pretracking_comb.txt, una macro ImageJ disponible en Chong et al.1 y siguiendo las indicaciones.</li>
	</ol></li>
	<li>Genere trayectorias de una sola partícula utilizando un software SPT, por ejemplo, SLIMfast39, una implementación GUI del algoritmo MTT38 disponible en Teves et al.42.<ol><li>Cargue el archivo de 5.1.2 que contiene la película de una sola molécula en SLIMfast haciendo clic en Cargar > pila de imágenes.</li>
		<li>Ajuste los parámetros (tasa de error de localización: 10-6; bucles de deflación: 3) para la localización haciendo clic en OPT > Hoja: Localización.</li>
		<li>Ajuste los parámetros (pico de emisión: 664 nm; tiempo de retraso: 500 ms) para la adquisición haciendo clic en OPT > Hoja: Adquisición.</li>
		<li>Visualice las localizaciones de todas las moléculas en un solo fotograma para asegurarse de que los parámetros elegidos son los adecuados (TEST LOC). Si no es apropiado, modifique los parámetros de los pasos 5.2.2 y 5.2.3 y repita este paso.</li>
		<li>Genere un archivo que contenga las localizaciones de todas las moléculas en cada fotograma (LOC ALL).</li>
		<li>Cargue el archivo de 5.2.5 en SLIMfast haciendo clic en Cargar > datos de partículas > SLIMfast.</li>
		<li>Ajuste los parámetros (coeficiente de difusión máximo esperado: 0,1 μm2/s; número máximo de competidores: 5) para la generación de trayectorias haciendo clic en OPT > Hoja: Seguimiento.</li>
		<li>Generar un fichero que contenga las trayectorias de todas las moléculas (GEN TRAJ).</li>
	</ol></li>
	<li>Filtre las trayectorias que son más cortas que tmin, 2,5 s, utilizando evalSPT39, disponible en Drosopoulos et al.43, para tener en cuenta los errores de seguimiento que dan lugar a trayectorias artificialmente cortas.<ol><li>Cargue el archivo de 5.2.8 en evalSPT (+ > archivo de 5.2.8 > OK).</li>
		<li>Ajuste los parámetros (mín.: 5 fotogramas; max: longitud máxima de trayectoria para el archivo de 5.2.8) para filtrar las trayectorias inferiores a 2,5 s.</li>
		<li>Genere un archivo con todas las trayectorias filtradas (EXPORTAR DATOS).</li>
	</ol></li>
	<li>Siga este paso solo para las trayectorias de la proteína de interés. Clasifique las trayectorias en las de los condensados y las de los condensados, y luego extraiga el tiempo medio de residencia en el condensado. NOTA: Todos los códigos de esta sección están disponibles en Chong et al.1.<ol><li>Umbralice todos los fotogramas de la película adquiridos en el canal JFX549 para generar una película time-lapse rellenada con la máscara binaria de evolución temporal que resalta las ubicaciones de condensación ejecutando la macro, el núcleo y el clúster de ImageJ mask_v2.txt y siguiendo las indicaciones.</li>
		<li>Reformatear las trayectorias de una sola molécula generadas en 5.3.3. utilizando el script de MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, y ajustando los nombres de archivo, las rutas y los parámetros según sea necesario. ( Parámetros: Exposición, 0,5 s; Resolución, 0,16 μm/píxel).</li>
		<li>Ordene las trayectorias en función de la fracción de vida útil que una molécula determinada pasa en un condensado, F, utilizando el script de MATLAB, categorization_v4.m, y ajustando los nombres de archivo y las rutas según sea necesario.</li>
		<li>Proceda utilizando solo trayectorias en condensado.</li>
	</ol></li>
	<li>Extraiga kobs,s y kpb y calcule el tiempo medio de residencia corregido, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">.<ol><li>Extraiga kobs,s de las trayectorias de la proteína de interés en condensado utilizando el script de MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, y ajustando los nombres de archivo, las rutas y los parámetros según sea necesario. ( Parámetros: Exposición, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 fotogramas).</li>
		<li>Extraiga kpb de las trayectorias H2B utilizando el script de MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, y ajustando los nombres de archivo, las rutas y los parámetros según sea necesario. ( Parámetros: Exposición, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 fotogramas).</li>
		<li>Calcule el tiempo medio de residencia corregido de la proteína de interés unida específicamente a sus condensados, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, como <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: Se deben realizar controles para verificar que los diferentes tiempos de exposición que son lo suficientemente largos como para difuminar las partículas móviles, por ejemplo, 300 ms y 800 ms, siguen dando como resultado el mismo tiempo medio de residencia de la proteína de interés.</li>
	</ol></li>
</ol>

Cuantificación de interacciones de proteínas basada en imágenes de molécula única de células vivas

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo que aquí se presenta está diseñado para sistemas como los investigados en Irgen-Gioro et al.40. Dependiendo de la aplicación, se pueden modificar algunos componentes del protocolo, por ejemplo, el método para generar líneas celulares marcadas con fluorescencia, el sistema de etiquetado fluorescente y el estilo de cubreobjetos utilizado. El marcaje con halo de una proteína en una célula se puede realizar utilizando dos estrategias, dependiendo de cuál sea más adecuada para un...

Un creciente cuerpo de trabajo sugiere que los condensados biomoleculares juegan un papel importante en la organización celular y numerosas funciones celulares, por ejemplo, la regulación transcripcional 1,2,3,4,5, la reparación del daño del ADN 6,7,8, la organización de la cromatina 9,10,11,12, el cromosoma X inactivación 13,14,15 y señalización intracelular 16,17,18. Además, la desregulación de los condensados biomoleculares está implicada en muchas enfermedades, incluyendo cánceres 19,20,21 y trastornos neurodegenerativos 22,23,24,25,26. La formación de condensado a menudo es impulsada por interacciones transitorias, selectivas y multivalentes proteína-proteína, proteína-ácido nucleico o ácido nucleico-ácido nucleico27. Bajo ciertas condiciones, estas interacciones pueden conducir a la separación de fase líquido-líquido (LLPS), una transición de densidad que enriquece localmente biomoléculas específicas en gotas sin membrana. Tales interacciones multivalentes a menudo están mediadas por las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) de las proteínas 1,28,29. La caracterización biofísica de estas interacciones a nivel molecular es fundamental para nuestra comprensión de numerosas funciones celulares sanas y aberrantes, dada la omnipresencia de condensados a través de ellas. Aunque las técnicas basadas en la microscopía de fluorescencia confocal, por ejemplo, la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)30,31,32, se han utilizado ampliamente para demostrar cualitativamente que los intercambios moleculares entre los condensados y el entorno celular circundante son dinámicos, la cuantificación de la dinámica de interacción de biomoléculas específicas dentro de los condensados generalmente no es posible utilizando la microscopía confocal convencional o de una sola molécula Microscopía sin métodos especializados de análisis de datos. La técnica de seguimiento de una sola partícula (SPT) descrita en este protocolo se basa en la microscopía de molécula única de célula viva33 y proporciona una herramienta excepcionalmente poderosa para cuantificar la dinámica de interacción entre proteínas específicas dentro de condensados. La lectura de SPT para dicha medición es el tiempo medio de residencia de una proteína de interés en los condensados.
El protocolo se puede dividir en dos partes: adquisición de datos y análisis de datos. El primer paso de la adquisición de datos de imagen es expresar en las células una proteína de interés que se fusiona con un HaloTag34. Esto permite el marcaje de la proteína de interés con dos fluoróforos, donde la mayoría de las moléculas de proteína deben marcarse con un fluoróforo no fotoactivable (por ejemplo, el ligando35 de Halo JFX549) y una pequeña fracción de ellas se marcará con un fluoróforo fotoactivable espectralmente distinto (por ejemplo, el ligando36 de Halo PA-JF646). Esto permite la adquisición simultánea de todas las ubicaciones de condensado en la celda y la adquisición de películas de una sola molécula de la proteína de interés que se unen y desunen a los condensados. Mientras tanto, el mismo tipo de células se modifican para expresar de manera estable H2B marcada con Halo, una histona que es en gran parte inmóvil en la cromatina. A continuación, las células se tiñen con el ligando PA-JF646 Halo para permitir la obtención de imágenes de H2B de una sola molécula. Como se discutirá en detalle a continuación, este experimento tiene en cuenta la contribución del fotoblanqueo para permitir una cuantificación precisa de la dinámica de interacción de la proteína de interés. A continuación, las células para experimentos de obtención de imágenes deben cultivarse en cubreobjetos limpios, teñirse con ligandos HaloTag y ensamblarse en una cámara de obtención de imágenes de células vivas. A partir de ahí, se obtienen imágenes de la muestra bajo iluminación de lámina óptica laminada y altamente inclinada (HILO) en un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) capaz de obtener imágenes de dos canales y detección de una sola molécula. A continuación, la emisión se divide en dos cámaras, una que rastrea las posiciones del condensado y otra que rastrea moléculas individuales. La adquisición se realiza con un largo tiempo de integración (del orden de cientos de ms) para difuminar las proteínas que se difunden libremente y capturar solo las proteínas que son menos móviles debido a la unión a estructuras estables en la célula37.
El primer paso del análisis de datos es utilizar un algoritmo establecido de seguimiento de una sola partícula (SPT)38,39 para localizar moléculas de proteína individuales en cada fotograma de la película y ensamblar las localizaciones en una trayectoria para cada molécula a lo largo de su vida útil detectable. A continuación, las trayectorias se clasifican en las que representan moléculas dentro y las que representan moléculas fuera de los condensados comparando las localizaciones de las moléculas a lo largo de sus trayectorias con las localizaciones de todos los condensados en los tiempos correspondientes1.
A continuación, se genera una curva de supervivencia (1 - CDF) utilizando las longitudes de todas las trayectorias en condensado. A continuación, se extrae el tiempo medio de residencia aparente de las moléculas ajustando la curva de supervivencia al siguiente modelo exponencial de unión a proteínas de dos componentes,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;">,
con A como la fracción de moléculas no unidas específicamente y con kobs,ns y kobs,s como las tasas de disociación observadas de las moléculas no unidas específicamente y específicamente unidas, respectivamente. A partir de aquí en adelante, solo se considera kobs,s. La dinámica tanto de la disociación deproteínas, k true,s, como del fotoblanqueo del fluoróforo, kpb, contribuyen a k obs,s como
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;">;
así, para aislar los efectos de la disociación de proteínas, se mide la tasa de disociación específica de H2B-Halo en la línea celular mencionada anteriormente.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;">
H2B es una proteína que se integra de forma estable en la cromatina y que experimenta una disociación mínima en la escala de tiempo de la adquisición de una película de una sola molécula37. Su tasa de disociación específica es entonces igual a la tasa de fotoblanqueo del ligando PA-JF646 Halo, o
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;">.
El tiempo medio de residencia en condensado de la proteína de interés, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, es entonces
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;">.
Se muestran resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40 , donde se aplicó este protocolo para demostrar que la fusión de un dominio de oligomerización con IDR da como resultado tiempos de residencia más largos de la IDR en sus condensados. Este resultado sugiere que el dominio de oligomerización añadido estabiliza las interacciones homotípicas de la IDR que impulsa la LLPS. En principio, se puede aplicar el mismo método con protocolos ligeramente modificados para caracterizar las interacciones homotípicas o heterotípicas de cualquier proteína que participe en la formación de cualquier tipo de condensados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m TetraSpeck microsphere</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Diameter, #1.5 Coverslips</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>111650</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>593/40 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>676/37 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-676/37-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well TC Plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-105MP</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line: U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 
			.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Rack</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>24957</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Low Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-567-022</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Lab Alley</td>
			<td>EAP200-1GAL</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evalSPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikon Ultra CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>X-13723</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R635-25x36</td>
			<td>Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUN-F Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: 405/488/561/640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nucleus and cluster mask_v2.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6984-06</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pretracking_comb.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLIMfast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubation system</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: For live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwinCam dual emission image splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>5800</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule measurement of protein interaction dynamics within biomolecular condensates

Los condensados biomoleculares formados a través de la separación de fases líquido-líquido (LLPS) se han considerado críticos en la organización celular y en un número creciente de funciones celulares. La caracterización de la LLPS en células vivas también es importante porque la condensación aberrante se ha relacionado con numerosas enfermedades, incluidos cánceres y trastornos neurodegenerativos. La LLPS a menudo es impulsada por interacciones selectivas, transitorias y multivalentes entre proteínas intrínsecamente desordenadas. De gran interés son las dinámicas de interacción de las proteínas que participan en LLPS, que se resumen bien mediante mediciones de su tiempo de residencia de unión (RT), es decir, la cantidad de tiempo que pasan unidas dentro de los condensados. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de células vivas de una sola molécula que nos permite medir el RT medio de una proteína específica dentro de condensados. Visualizamos simultáneamente las moléculas de proteína individuales y los condensados con los que se asocian, utilizamos el seguimiento de una sola partícula (SPT) para trazar trayectorias de una sola molécula y, a continuación, ajustamos las trayectorias a un modelo de unión proteína-gota para extraer la RT media de la proteína. Finalmente, mostramos resultados representativos donde se aplicó este método de imagen de una sola molécula para comparar los RT medios de una proteína en sus condensados de LLPS cuando se fusiona y no se fusiona con un dominio oligomerizante. Este protocolo es ampliamente aplicable a la medición de la dinámica de interacción de cualquier proteína que participe en LLPS.

A growing body of work suggests that biomolecular condensates play an important role in cellular organization and numerous cellular functions, e.g., transcriptional regulation1,2,3,4,5, DNA damage repair6,7,8, chromatin organization9,10,11,12, X-chromosome inactivation13,14,15, and intracellular signaling16,17,18. In addition, the dysregulation of biomolecular condensates is implicated in many diseases, including cancers19,20,21 and neurodegenerative disorders22,23,24,25,26. Condensate formation is often driven by transient, selective, and multivalent protein-protein, protein-nucleic acid, or nucleic acid-nucleic acid interactions27. Under certain conditions, these interactions can lead to liquid-liquid phase separation (LLPS), a density transition that locally enriches specific biomolecules in membraneless droplets. Such multivalent interactions are often mediated by the intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins1,28,29. Biophysical characterization of these interactions at the molecular level is critical to our understanding of numerous healthy and aberrant cellular functions, given the pervasiveness of condensates across them. Although techniques based on confocal fluorescence microscopy, e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)30,31,32, have been widely used to qualitatively show that the molecular exchanges between condensates and the surrounding cellular environment are dynamic, quantifying the interaction dynamics of specific biomolecules within condensates is generally not possible using conventional confocal microscopy or single-molecule microscopy without specialized data analysis methods. The single-particle tracking (SPT) technique described in this protocol is based on live-cell single-molecule microscopy33 and provides a uniquely powerful tool to quantify the interaction dynamics between specific proteins within condensates. The readout of SPT for such measurement is the mean residence time of a protein of interest in the condensates.
The protocol can be broken down into two parts - data acquisition and data analysis. The first step of imaging data acquisition is to express in cells a protein of interest that is fused to a HaloTag34. This enables labeling of the protein of interest with two fluorophores, where a majority of the protein molecules are to be labeled with a non-photoactivatable fluorophore (e.g., JFX549 Halo ligand35) and a small fraction of them are to be labeled with a spectrally distinct, photoactivatable fluorophore (e.g., PA-JF646 Halo ligand36). This allows for the simultaneous acquisition of all condensate locations in the cell and the acquisition of single-molecule movies of the protein of interest binding and unbinding to the condensates. Meanwhile, the same type of cells are modified to stably express Halo-tagged H2B, a histone that is largely immobile on chromatin. The cells are then stained with the PA-JF646 Halo ligand to enable single-molecule imaging of H2B. As will be discussed in detail below, this experiment accounts for the contribution of photobleaching to enable precise quantification of the interaction dynamics of the protein of interest. Cells for imaging experiments must then be cultured on clean coverslips, stained with HaloTag ligand(s), and assembled into a live-cell imaging chamber. From there, the sample is imaged under highly inclined and laminated optical sheet (HILO) illumination on a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope capable of two-channel imaging and single-molecule detection. The emission is then split onto two cameras, one tracking condensate positions and one tracking single molecules. Acquisition is performed with a long integration time (on the order of hundreds of ms) to blur out freely-diffusing proteins and only capture proteins that are less mobile due to binding to stable structures in the cell37.
The first step of data analysis is using an established single-particle tracking (SPT) algorithm38,39 to localize individual protein molecules in each frame of the movie and assemble the localizations into a trajectory for each molecule over its detectable lifetime. The trajectories are then sorted into those representing molecules inside and those representing molecules outside the condensates by comparing the localizations of the molecules throughout their trajectories to the localizations of all the condensates at the corresponding times1.
Next, a survival curve (1 - CDF) is generated using the lengths of all the in-condensate trajectories. The apparent mean residence time of the molecules is then extracted by fitting the survival curve to the following two-component exponential model of protein binding,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" />,
with A as the fraction of molecules non-specifically bound and with kobs,ns and kobs,s as the observed dissociation rates of the non-specifically bound and specifically bound molecules, respectively. Only kobs,s is considered from here onward. The dynamics of both protein dissociation, ktrue,s, and photobleaching of the fluorophore, kpb, contribute to kobs,s as
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" />;
thus, to isolate the effects of protein dissociation, the specific dissociation rate of H2B-Halo in the cell line mentioned prior is measured.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" />
H2B is a protein that is stably integrated into chromatin and that experiences minimal dissociation in the time scale of a single-molecule movie acquisition37. Its specific dissociation rate is then equal to the photobleaching rate of the PA-JF646 Halo ligand, or
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" />.
The mean in-condensate residence time of the protein of interest, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" />, is then
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" />.
Representative results from Irgen-Gioro et al.40 are shown, where this protocol was applied to demonstrate that fusing an oligomerization domain to IDR results in longer residence times of the IDR in its condensates. This result suggests that the added oligomerization domain stabilizes the homotypic interactions of the IDR that drives LLPS. In principle, the same method with slightly modified protocols can be applied to characterize the homotypic or heterotypic interactions of any protein that participates in the formation of any types of condensates.

Autor destacado: Evaluación de la dinámica proteína-condensado en células humanas vivas

Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

1 Our lab aims to understand the interaction behaviors<v>2 of intrinsically disordered protein regions 3 and how they play roles in transcriptional regulation 4 in healthy and diseased human cells. 5 In our lab, we develop and use novel 6 single molecule microscopy techniques 7 in combination with molecular biology, 8 biochemical and proteomic approaches 9 to study biomolecular condensates. 10 This protocol enables the quantification of the dynamics 11 by which a specific protein 12 binds to a particular type of condensate 13 in live human cells, 14 and is broadly applicable 15 to measuring the interaction dynamics of any protein 16 that participates in liquid-liquid phase separation.

Aquí, presentamos resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40, donde utilizamos este protocolo SPT para comparar la dinámica de interacción de dos proteínas en sus respectivos condensados de LLPS autoensamblados. TAF15 (factor 15 asociado a la proteína de unión a la caja TATA) contiene una IDR que puede sufrir LLPS tras la sobreexpresión en células humanas. Planteamos la hipótesis de que la fusión de TAF15 (IDR) con FTH1 (cadena pesada de ferritina 1), que forma un oligómero de 2...

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Se ha demostrado que muchas proteínas intrínsecamente desordenadas participan en la formación de condensados biomoleculares altamente dinámicos, un comportamiento importante para numerosos procesos celulares. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de una sola molécula para cuantificar la dinámica por la cual las proteínas interactúan entre sí en condensados biomoleculares en células vivas.

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

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Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

2.4K vistas.  California Institute of Technology. 1 Nuestro laboratorio tiene como objetivo comprender los comportamientos de interacción2 de las regiones de proteínas intrínsecamente desordenadas 3 y cómo desempeñan un papel en la regulación transcripcional 4 en células humanas sanas y enfermas. 5 En nuestro laboratorio, desarrollamos y utilizamos nuevas técnicas de microscopía de molécula única 7 en combinación con biología molecular, 8 enfoques bioquímicos y proteómicos 9 para estudiar c...