Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu tarafından Hibe No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Ödülü (S.C.), Searle Scholar Ödülü (S.C.), Shurl ve Kay Curci Vakfı Araştırma Bursu (S.C.), Merkin İnovasyon Tohum Hibesi (S.C.), Mallinckrodt Araştırma Bursu (S.C.) ve Margaret E. Erken Tıbbi Araştırma Vakfı 2024 Hibesi (SC). SC ayrıca NIH/NCI tarafından P30CA016042 Numaralı Ödül altında desteklenmektedir.

1. Hücrelerdeki proteinlerin etiketlenmesi
<ol><li>İstenilen hücre hattında HaloTag ile kaynaşmış ilgilenilen proteini ifade edin.</li>
	<li>Halo etiketli H2B'yi, transpozonlar veya viral transdüksiyon kullanarak 1.1'deki ile aynı tip hücrelerde kararlı bir şekilde eksprese edin.</li>
</ol>2. Lamellerin hazırlanması
<ol><li>Hücre kültürü için lamelleri kullanmadan önce, otofloresan kirleticileri gidermek için lamelleri temizleyin.<ol><li>25 mm çapında, #1.5 lameller seramik bir boyama rafına monte edin ve bir polipropilen kaba yerleştirin.</li>
		<li>Lamelleri 1 M'lik bir KOH çözeltisine tamamen daldırın ve 1 saat boyunca sonikleştirin.</li>
		<li>Lamelleri çift damıtılmış su (ddH2O) ile üç kez durulayın.</li>
		<li>Lamelleri tamamen% 100 etanole daldırın ve 1 saat boyunca sonikat yapın.</li>
		<li>Lamelleri ddH2O ile seyreltilmiş %20 etanole tamamen daldırın ve kullanana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mikroskopi için hücrelerin hazırlanması
NOT: Hücrelerin kirlenmesini önlemek için bu bölümdeki adımları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
<ol><li>Temizlenmiş lameller üzerindeki plaka hücreleri. Halo etiketli proteinin geçici olarak eksprese edilmesi gerekiyorsa görüntülemeden 2 gün önce gerçekleştirin. Halo etiketli proteinin stabil veya endojen olarak eksprese edilip edilmediğini görüntülemeden 1 gün önce gerçekleştirin.<ol><li>Lamelleri 6 oyuklu bir plakaya (hücre numunesi başına bir lamel/kuyucuk) yerleştirmek için steril forseps kullanın ve artık etanolün buharlaşmasına izin verin.</li>
		<li>Görüntüleme sırasında% 70 birleşme elde etmek için her bir kuyucuğu uygun sayıda hücre ile kaplayın. Aynı hedef birleşme ile H2B-Halo'yu stabil bir şekilde eksprese eden hücrelerle ek bir kuyu kaplayın.</li>
		<li>Bu adımı, yalnızca ilgilenilen Halo etiketli proteini geçici olarak ifade ediyorsanız izleyin. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin. Daha sonra, uygun transfeksiyon reaktiflerini kullanarak ve üreticinin yönergelerini izleyerek, ilgilenilen etiketli proteini kodlayan plazmid ile hücreleri transfekte edin.</li>
		<li>Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>İlgilenilen Halo etiketli proteini eksprese eden hücreleri, hem fotoaktif olmayan bir Halo ligandı (örneğin, JFX549) hem de fotoaktif hale getirilebilir bir Halo ligandı (örneğin, PA-JF646) ile boyayın. Sadece fotoaktive olabilen Halo ligandı ile H2B-Halo eksprese eden hücreleri boyayın. NOT: Burada listelenen Halo ligandlarının konsantrasyonları bir başlangıç noktası olarak kullanılmalıdır; Optimal konsantrasyon, ilgilenilen proteinin ekspresyon seviyesine ve kondensat içi lokal konsantrasyonuna bağlı olacaktır.<ol><li>İlgilenilen Halo etiketli proteini eksprese eden her hücre örneği için, 100 μL uygun hücre ortamında 100 nM JFX549 Halo ligand35 ve 20 nM PA-JF646 Halo ligand36'yı seyreltin. H2B-Halo eksprese eden her numune için, 500 μL uygun hücre ortamında sadece 20 nM PA-JF646 Halo ligandını seyreltin.</li>
		<li>Her kuyucuk için mevcut ortamı aspire edin, 2 mL 1x PBS ekleyin, ardından PBS'yi aspire edin (bu, protokolün geri kalanı için "durulama" olarak adlandırılır) ve uygun Halo ligandlarını içeren ortamla değiştirin.</li>
		<li>37 °C ve% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>PBS ile dört kez durulayın ve Halo ligandları içermeyen taze ortamla değiştirin.</li>
		<li>37 °C ve% 5 CO2'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>3.2.4 ve 3.2.5 adımlarını üç kez tekrarlayın (toplam dört durulama-inkübasyon döngüsü).</li>
		<li>Hücrelerle birlikte lameli mikroskop aşamasıyla uyumlu bir hücre kültürü lamel odasına aktarmak için steril forseps kullanın.</li>
		<li>Hazneye fenol kırmızısı içermeyen ortam ekleyin ve görüntülemeye devam edin. İhtiyaç duyulana kadar 37 °C ve% 5 CO2 'de hemen görüntülenmeyen numuneleri inkübe edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Tek moleküllü görüntüleme
NOT: Hem H2B'nin hem de ilgilenilen proteinin kalma sürelerini ölçen bağımsız deneyler, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için birden fazla (≥3) gün boyunca yapılmalıdır. Hücre örneklerini mikroskopta görüntülemeden önce, iki kamerayı 0,1 μm lekeli mikro küreler (Malzeme Tablosu) veya benzer bir kalibrasyon standardı kullanarak hizalayın.
<ol><li>Mikroskobu hazırlayın.<ol><li>Mikroskobu ve mikroskobu kontrol eden bilgisayarı açın.</li>
		<li>Mikroskopta canlı hücre inkübasyon bileşenlerini (ısıtıcı ve CO2) açın ve 37 ° C ve% 5 CO2 'ye ayarlayın. Sistemin dengelenmesine izin verin.</li>
		<li>Mikroskop üzerinde 100x TIRF yağa daldırma objektifine uygun yağdan bir damla damlatın ve hücre örneğini mikroskop aşamasına yükleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntülenecek bir hücreyi tanımlayın.<ol><li>Hücre örneğini parlak alan aydınlatması altında görüntüleyin ve hücreler odaklanana kadar z konumunu ayarlayın.</li>
		<li>Sağlıklı hücrelerin morfoloji özelliklerini sergileyen bir hücreyi tanımlayın.</li>
		<li>Görüş alanını (FOV) yalnızca hedef hücre çekirdeğini yakalayacak şekilde kırpın.</li>
		<li>Lazer aydınlatmayı kullanın ve tek moleküllerin optimum sinyal-gürültü oranına sahip HILO aydınlatması41 elde edilene kadar TIRF açısını ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Canlı hücrelerde H2B-Halo görüntüsü. NOT: Bu bölümde kullanılan lazer güçleri bu deneye özeldir ve örnek olarak dahil edilmiştir. Tartışmada listelenen kriterlere göre uygun lazer güçleri seçilmelidir.<ol><li>Aşağıdaki gibi bir alım yapılandırması ayarlayın. Pozlama süresini 500 ms olarak ayarlayın. Her 500 ms maruziyet sırasında, PA-JF646 etiketli H2B-Halo moleküllerini 9.1 mW, 640 nm ışınla uyarın. Çerçeveler arasındaki ölü zamanda (burada kullanılan görüntüleme sisteminde 158.01 μs), molekülleri 111 μW, 405 nm ışınla fotoaktive eder.</li>
		<li>Bu ayarlar altında sürekli olarak 2000 kare yakalayın. Fotoaktif moleküllerin sayısı yetersiz hale geldiğinde, edinme boyunca 405 nm ışının gücünü kademeli olarak artırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Canlı hücrelerde ilgilenilen Halo etiketli proteini görüntüleyin.<ol><li>Emisyon dalga boylarını iki kamera arasında bölmek için uzun geçişli bir dikroik ayna kullanın, biri PA-JF646'yı ve diğeri JFX549'u algılamak için. Kameraların önünde uygun emisyon filtreleri kullanın.</li>
		<li>Aşağıdaki değişiklikle 4.3.1'de açıklanan aynı alma yapılandırmasını kullanın. Halo etiketli protein kondensatlarının zaman içindeki konumlarını izlemek için ek bir JFX549 kanalı ekleyin. Her 10 saniyede bir, PA-JF646 kanalının alımını korurken JFX549 kanalında bir kare (500 ms, 2,1 mW, 561 nm uyarma) elde edin. Bu, satın alma sonrası veri analizinde halledilecek olan PA-JF646 kanalına sızıntıya neden olacaktır.</li>
		<li>Bu ayarlar altında sürekli olarak 2000 kare yakalayın. Fotoaktif moleküllerin sayısı yetersiz hale geldiğinde, edinme boyunca 405 nm ışının gücünü kademeli olarak artırın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi
NOT: Bölüm 5 boyunca kullanılan parametreler bu deneye özeldir ve örnek olarak dahil edilmiştir. Tartışmada listelenen kriterlere göre uygun parametreler seçilmelidir.
<ol><li>Ham görüntüleme verilerini işlenmek üzere hazırlayın.<ol><li>İlgilenilen proteinin verileri için, ham görüntüleme veri dosyasındaki her kanalı ImageJ veya benzeri bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bağımsız bir .tif dosyasına dönüştürün. H2B verileri için, ham görüntüleme veri dosyasındaki tek kanalı aynı şekilde bir .tif dosyasına dönüştürün. NOT: Kullanılan toplama yazılımına bağlı olarak, her 10 saniyede bir yalnızca bir yoğuşma izleme karesi alındığından, yoğuşma filminde boş kareler olabilir. Boş çerçeveler en son yoğuşma çerçevesi ile doldurulmalıdır (bazı toplama yazılımları bunu otomatik olarak yapar). Ek olarak, bu yoğuşma izleme çerçeveleri sırasında yoğuşma (JFX549) kanalından tek moleküllü (PA-JF646) kanala önemli bir sızıntı varsa, karşılık gelen tek moleküllü çerçeveler en son tek moleküllü çerçeve ile değiştirilmelidir.</li>
		<li>Yukarıdaki nedenlerden dolayı her iki filmde de değiştirilmesi gereken kareler varsa, Chong ve ark.1'de bulunan bir ImageJ makrosu olan pretracking_comb.txt'yi değiştirerek (gerekirse) ve çalıştırarak ve istemleri izleyerek bunları o filmden en son kareyle değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir SPT yazılımı kullanarak tek parçacıklı yörüngeler oluşturun, örneğin, SLIMfast39, Teves ve ark.42'de bulunan MTT algoritmasının38 bir GUI uygulaması.<ol><li>Tek moleküllü filmi içeren dosyayı 5.1.2'den SLIMfast'> Yükle'ye tıklayarak yükleyin.</li>
		<li>Parametreleri ayarlayın (yerelleştirme hata oranı: 10-6; deflasyon döngüleri: 3) OPT > Sayfa: Yerelleştirme'ye tıklayarak yerelleştirme için.</li>
		<li>Parametreleri ayarlayın (tepe emisyonu: 664 nm; gecikme süresi: 500 ms) OPT > Sayfa: Edinme'ye tıklayarak edinme için.</li>
		<li>Seçilen parametrelerin uygun olduğundan emin olmak için tüm moleküllerin lokalizasyonlarını tek bir çerçevede görselleştirin (TEST LOC). Uygun değilse, 5.2.2 ve 5.2.3 adımlarındaki parametreleri değiştirin ve bu adımı tekrarlayın.</li>
		<li>Her karedeki tüm moleküllerin lokalizasyonlarını içeren bir dosya oluşturun (LOC ALL).</li>
		<li>SLIMfast'> Parçacık Verilerini Yükle'ye tıklayarak dosyayı 5.2.5'ten SLIMfast'> yükleyin.</li>
		<li>Parametreleri ayarlayın (beklenen maksimum difüzyon katsayısı: 0,1 μm2/s; maksimum yarışmacı sayısı: 5) OPT > Sayfası: İzleme'ye tıklayarak yörünge oluşturma için.</li>
		<li>Tüm moleküllerin yörüngelerini içeren bir dosya oluşturun (GEN TRAJ).</li>
	</ol></li>
	<li>Yapay olarak kısa yörüngelerle sonuçlanan izleme hatalarını hesaba katmak için Drosopoulos ve ark.43'te bulunan evalSPT39'u kullanarak tmin, 2,5 s'den daha kısa yörüngeleri filtreleyin.<ol><li>Dosyayı 5.2.8'den evalSPT'ye yükleyin (+ 5.2.8'den > OK'den > dosya).</li>
		<li>Parametreleri ayarlayın (min: 5 kare; Maks: 5.2.8'den itibaren dosya için maksimum yörünge uzunluğu) 2.5 s'den kısa yörüngeleri filtrelemek için.</li>
		<li>Filtrelenmiş tüm yörüngeleri içeren bir dosya oluşturun (VERİLERİ DIŞA AKTAR).</li>
	</ol></li>
	<li>Bu adımı yalnızca ilgilenilen proteinin yörüngeleri için izleyin. Yörüngeleri kondensatlarda ve kondensatlarda olanlara göre sıralayın, ardından ortalama kondens içinde kalma süresini çıkarın. NOT: Bu bölümdeki tüm kodlar Chong ve ark.1'de mevcuttur.<ol><li>ImageJ makrosunu, çekirdeğini ve küme mask_v2.txt çalıştırarak ve istemleri izleyerek yoğunlaşma konumlarını vurgulayan zaman atlamalı bir film oluşturmak için JFX549 kanalında alınan filmin tüm karelerini eşikleyin.</li>
		<li>5.3.3'te oluşturulan tek moleküllü yörüngeleri yeniden biçimlendirin. MATLAB komut dosyasını, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m'yi kullanarak ve dosya adlarını, yolları ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak. (Parametreler: Pozlama, 0,5 sn; Çözünürlük, 0,16 μm/piksel).</li>
		<li>Yörüngeleri, belirli bir molekülün bir kondensatta (F) geçirdiği ömrün kesirine göre, MATLAB komut dosyasını (categorization_v4.m) kullanarak ve dosya adlarını ve yolları gerektiği gibi ayarlayarak sıralayın.</li>
		<li>Yalnızca yoğuşma yörüngelerini kullanarak devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>kobs,s ve kpb'yi çıkarın ve düzeltilmiş ortalama kalış süresini hesaplayın, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">.<ol><li>MATLAB komut dosyasını, PLOT_ResidenceHist_css.m'yi kullanarak ve dosya adlarını, yolları ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak ilgilenilen yörüngelerin kondensat proteininden kobs,s'yi çıkarın. (Parametreler: Pozlama, 0,5 sn; StartFrameForFit, 5 kare).</li>
		<li>MATLAB komut dosyasını, PLOT_ResidenceHist_css.m'yi kullanarak ve dosya adlarını, yolları ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak H2B yörüngelerinden kpb'yi çıkarın. (Parametreler: Pozlama, 0,5 sn; StartFrameForFit, 5 kare).</li>
		<li>İlgilenilen proteinin özellikle kondensatlarına bağlı düzeltilmiş ortalama kalış süresini hesaplayın, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;"> NOT: 300 ms ve 800 ms gibi hareketli parçacıkları bulanıklaştırmak için yeterince uzun olan farklı maruz kalma sürelerinin, ilgilenilen proteinin aynı ortalama kalma süresiyle sonuçlandığını doğrulamak için kontroller yapılmalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>

Protein Etkileşimlerinin Canlı Hücre Tek Moleküllü Görüntüleme Tabanlı Miktar Tayini

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Burada sunulan protokol, Irgen-Gioro ve ark.40'ta araştırılanlar gibi sistemler için tasarlanmıştır. Uygulamaya bağlı olarak, protokolün bazı bileşenleri değiştirilebilir, örneğin, floresan etiketli hücre hatları oluşturma yöntemi, floresan etiketleme sistemi ve kullanılan lamel stili. Bir hücredeki bir proteinin halo etiketlemesi, belirli bir deney için hangisinin daha uygun olduğuna bağlı olarak iki strateji kullanılarak yapılabilir. 1) Eksojen ekspresyon: ilgilenilen...

Giderek artan sayıda çalışma, biyomoleküler kondensatların hücresel organizasyonda ve çok sayıda hücresel fonksiyonda önemli bir rol oynadığını göstermektedir, örneğin, transkripsiyonel düzenleme 1,2,3,4,5, DNA hasar onarımı 6,7,8, kromatin organizasyonu 9,10,11,12, X-kromozomu inaktivasyon 13,14,15 ve hücre içi sinyal 16,17,18. Ek olarak, biyomoleküler kondensatların düzensizliği, kanserler 19,20,21 ve nörodejeneratif bozukluklar 22,23,24,25,26 dahil olmak üzere birçok hastalıkta rol oynar. Kondens oluşumu genellikle geçici, seçici ve çok değerlikli protein-protein, protein-nükleik asit veya nükleik asit-nükleik asit etkileşimleri tarafından yönlendirilir27. Belirli koşullar altında, bu etkileşimler, zarsız damlacıklardaki spesifik biyomolekülleri yerel olarak zenginleştiren bir yoğunluk geçişi olan sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) yol açabilir. Bu tür çok değerlikli etkileşimlere genellikle proteinlerin içsel olarak düzensiz bölgeleri (IDR'ler)aracılık eder 1,28,29. Bu etkileşimlerin moleküler düzeyde biyofiziksel karakterizasyonu, kondensatların bunlar arasındaki yaygınlığı göz önüne alındığında, çok sayıda sağlıklı ve anormal hücresel fonksiyonu anlamamız için kritik öneme sahiptir. Konfokal floresan mikroskobuna dayalı teknikler, örneğin fotoağartma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP)30,31,32, kondensatlar ve çevredeki hücresel ortam arasındaki moleküler değişimlerin dinamik olduğunu kalitatif olarak göstermek için yaygın olarak kullanılmış olsa da, kondensatlar içindeki spesifik biyomoleküllerin etkileşim dinamiklerini ölçmek genellikle geleneksel konfokal mikroskopi veya tek molekül kullanılarak mümkün değildir özel veri analizi yöntemleri olmadan mikroskopi. Bu protokolde açıklanan tek parçacık izleme (SPT) tekniği, canlı hücreli tek moleküllü mikroskopiye33 dayanır ve kondensatlar içindeki spesifik proteinler arasındaki etkileşim dinamiklerini ölçmek için benzersiz derecede güçlü bir araç sağlar. Bu tür bir ölçüm için SPT'nin okunması, ilgilenilen bir proteinin kondensatlarda ortalama kalma süresidir.
Protokol iki bölüme ayrılabilir - veri toplama ve veri analizi. Görüntüleme verilerinin toplanmasının ilk adımı, hücrelerde bir HaloTag34 ile kaynaşmış bir proteini ifade etmektir. Bu, ilgilenilen proteinin, protein moleküllerinin çoğunluğunun fotoaktif olmayan bir florofor (örneğin, JFX549 Halo ligand35) ile etiketleneceği ve bunların küçük bir kısmının spektral olarak farklı, fotoaktif bir florofor ile etiketleneceği iki florofor ile etiketlenmesini sağlar (örneğin, PA-JF646 Halo ligand36). Bu, hücredeki tüm kondensat konumlarının aynı anda elde edilmesine ve kondensatlara bağlanan ve bağlanmayan ilgilenilen proteinin tek moleküllü filmlerinin elde edilmesine izin verir. Bu arada, aynı tip hücreler, kromatin üzerinde büyük ölçüde hareketsiz olan bir histon olan Halo etiketli H2B'yi kararlı bir şekilde eksprese etmek için modifiye edilir. Hücreler daha sonra H2B'nin tek moleküllü görüntülenmesini sağlamak için PA-JF646 Halo ligandı ile boyanır. Aşağıda ayrıntılı olarak tartışılacağı gibi, bu deney, ilgilenilen proteinin etkileşim dinamiklerinin kesin olarak ölçülmesini sağlamak için foto ağartmanın katkısını açıklar. Görüntüleme deneyleri için hücreler daha sonra temiz lameller üzerinde kültürlenmeli, HaloTag ligand(lar)ı ile boyanmalı ve canlı hücre görüntüleme odasına monte edilmelidir. Oradan, numune, iki kanallı görüntüleme ve tek molekül algılama yeteneğine sahip bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu üzerinde oldukça eğimli ve lamine optik levha (HILO) aydınlatması altında görüntülenir. Emisyon daha sonra iki kameraya bölünür, biri kondensat konumlarını izler ve diğeri tek molekülleri izler. Edinim, serbestçe yayılan proteinleri bulanıklaştırmak ve yalnızca hücredeki kararlı yapılara bağlanma nedeniyle daha az hareketli olan proteinleri yakalamak için uzun bir entegrasyon süresiyle (yüzlerce ms mertebesinde) gerçekleştirilir37.
Veri analizinin ilk adımı, filmin her karesinde tek tek protein moleküllerini lokalize etmek ve lokalizasyonları tespit edilebilir ömrü boyunca her molekül için bir yörüngede birleştirmek için yerleşik bir tek parçacık izleme (SPT) algoritması38,39 kullanmaktır. Yörüngeler daha sonra, moleküllerin yörüngeleri boyunca lokalizasyonlarını, karşılık gelen zamanlarda tüm kondensatların lokalizasyonlarıyla karşılaştırarak, kondensatların içindeki molekülleri temsil edenler ve kondensatların dışındaki molekülleri temsil edenler olarak sıralanır1.
Daha sonra, tüm yoğuşma yörüngelerinin uzunlukları kullanılarak bir hayatta kalma eğrisi (1 - CDF) oluşturulur. Moleküllerin görünen ortalama kalış süresi daha sonra hayatta kalma eğrisinin aşağıdaki iki bileşenli üstel protein bağlanma modeline uydurulmasıyla çıkarılır,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;">,
spesifik olarak bağlı olmayan moleküllerin fraksiyonu olarak A ile ve sırasıyla spesifik olarak bağlı olmayan ve spesifik olarak bağlı moleküllerin gözlenen ayrışma oranları olarak kobs,ns ve kobs,s ile. Buradan sonra sadece kobs,s dikkate alınır. Hem protein ayrışmasının dinamikleri, ktrue,s, hem de floroforun fotoağartılması, kpb, kobs,s
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;">;
bu nedenle, protein ayrışmasının etkilerini izole etmek için, daha önce bahsedilen hücre hattındaki H2B-Halo'nun spesifik ayrışma hızı ölçülür.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;">
H2B, kromatine kararlı bir şekilde entegre edilmiş ve tek moleküllü bir film ediniminin zaman ölçeğinde minimum ayrışma yaşayan bir proteindir37. Spesifik ayrışma hızı daha sonra PA-JF646 Halo ligandının fotoağartma hızına eşittir veya
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;">.
İlgilenilen proteinin ortalama kondensat içinde kalma süresi, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, o zaman
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;">.
Irgen-Gioro ve ark.40'tan elde edilen temsili sonuçlar, bir oligomerizasyon alanının IDR'ye kaynaştırılmasının IDR'nin kondensatlarında daha uzun kalma sürelerine yol açtığını göstermek için bu protokolün uygulandığı gösterilmiştir. Bu sonuç, eklenen oligomerizasyon alanının, LLPS'yi yönlendiren IDR'nin homotipik etkileşimlerini stabilize ettiğini göstermektedir. Prensip olarak, herhangi bir kondensat oluşumuna katılan herhangi bir proteinin homotipik veya heterotipik etkileşimlerini karakterize etmek için hafifçe değiştirilmiş protokollerle aynı yöntem uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m TetraSpeck microsphere</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Diameter, #1.5 Coverslips</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>111650</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>593/40 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>676/37 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-676/37-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well TC Plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-105MP</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line: U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 
			.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Rack</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>24957</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Low Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-567-022</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Lab Alley</td>
			<td>EAP200-1GAL</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evalSPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikon Ultra CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>X-13723</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R635-25x36</td>
			<td>Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUN-F Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: 405/488/561/640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nucleus and cluster mask_v2.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6984-06</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pretracking_comb.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLIMfast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubation system</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: For live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwinCam dual emission image splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>5800</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule measurement of protein interaction dynamics within biomolecular condensates

Sıvı-sıvı faz ayrımı (LLPS) yoluyla oluşan biyomoleküler kondensatlar, hücresel organizasyonda ve artan sayıda hücresel fonksiyonda kritik olarak kabul edilmiştir. Canlı hücrelerde LLPS'yi karakterize etmek de önemlidir, çünkü anormal yoğunlaşma, kanserler ve nörodejeneratif bozukluklar dahil olmak üzere çok sayıda hastalıkla ilişkilendirilmiştir. LLPS genellikle içsel olarak düzensiz proteinler arasındaki seçici, geçici ve çok değerlikli etkileşimler tarafından yönlendirilir. LLPS'ye katılan proteinlerin etkileşim dinamikleri büyük ilgi çekicidir ve bunlar, bağlanma kalma sürelerinin (RT), yani kondensatlar içinde bağlı olarak geçirdikleri sürenin ölçümleriyle iyi bir şekilde özetlenmiştir. Burada, kondensatlar içindeki belirli bir proteinin ortalama RT'sini ölçmemizi sağlayan canlı hücreli tek moleküllü görüntülemeye dayalı bir yöntem sunuyoruz. Tek tek protein moleküllerini ve ilişkili oldukları kondensatları aynı anda görselleştiriyoruz, tek moleküllü yörüngeleri çizmek için tek parçacık izleme (SPT) kullanıyoruz ve ardından proteinin ortalama RT'sini çıkarmak için yörüngeleri bir protein damlacık bağlama modeline uyarlıyoruz. Son olarak, bu tek moleküllü görüntüleme yönteminin, bir oligomerleştirici alana kaynaştığında ve kaynaşmadığında LLPS kondensatlarındaki bir proteinin ortalama RT'lerini karşılaştırmak için uygulandığı temsili sonuçları gösteriyoruz. Bu protokol, LLPS'ye katılan herhangi bir proteinin etkileşim dinamiklerini ölçmek için geniş çapta uygulanabilir.

A growing body of work suggests that biomolecular condensates play an important role in cellular organization and numerous cellular functions, e.g., transcriptional regulation1,2,3,4,5, DNA damage repair6,7,8, chromatin organization9,10,11,12, X-chromosome inactivation13,14,15, and intracellular signaling16,17,18. In addition, the dysregulation of biomolecular condensates is implicated in many diseases, including cancers19,20,21 and neurodegenerative disorders22,23,24,25,26. Condensate formation is often driven by transient, selective, and multivalent protein-protein, protein-nucleic acid, or nucleic acid-nucleic acid interactions27. Under certain conditions, these interactions can lead to liquid-liquid phase separation (LLPS), a density transition that locally enriches specific biomolecules in membraneless droplets. Such multivalent interactions are often mediated by the intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins1,28,29. Biophysical characterization of these interactions at the molecular level is critical to our understanding of numerous healthy and aberrant cellular functions, given the pervasiveness of condensates across them. Although techniques based on confocal fluorescence microscopy, e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)30,31,32, have been widely used to qualitatively show that the molecular exchanges between condensates and the surrounding cellular environment are dynamic, quantifying the interaction dynamics of specific biomolecules within condensates is generally not possible using conventional confocal microscopy or single-molecule microscopy without specialized data analysis methods. The single-particle tracking (SPT) technique described in this protocol is based on live-cell single-molecule microscopy33 and provides a uniquely powerful tool to quantify the interaction dynamics between specific proteins within condensates. The readout of SPT for such measurement is the mean residence time of a protein of interest in the condensates.
The protocol can be broken down into two parts - data acquisition and data analysis. The first step of imaging data acquisition is to express in cells a protein of interest that is fused to a HaloTag34. This enables labeling of the protein of interest with two fluorophores, where a majority of the protein molecules are to be labeled with a non-photoactivatable fluorophore (e.g., JFX549 Halo ligand35) and a small fraction of them are to be labeled with a spectrally distinct, photoactivatable fluorophore (e.g., PA-JF646 Halo ligand36). This allows for the simultaneous acquisition of all condensate locations in the cell and the acquisition of single-molecule movies of the protein of interest binding and unbinding to the condensates. Meanwhile, the same type of cells are modified to stably express Halo-tagged H2B, a histone that is largely immobile on chromatin. The cells are then stained with the PA-JF646 Halo ligand to enable single-molecule imaging of H2B. As will be discussed in detail below, this experiment accounts for the contribution of photobleaching to enable precise quantification of the interaction dynamics of the protein of interest. Cells for imaging experiments must then be cultured on clean coverslips, stained with HaloTag ligand(s), and assembled into a live-cell imaging chamber. From there, the sample is imaged under highly inclined and laminated optical sheet (HILO) illumination on a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope capable of two-channel imaging and single-molecule detection. The emission is then split onto two cameras, one tracking condensate positions and one tracking single molecules. Acquisition is performed with a long integration time (on the order of hundreds of ms) to blur out freely-diffusing proteins and only capture proteins that are less mobile due to binding to stable structures in the cell37.
The first step of data analysis is using an established single-particle tracking (SPT) algorithm38,39 to localize individual protein molecules in each frame of the movie and assemble the localizations into a trajectory for each molecule over its detectable lifetime. The trajectories are then sorted into those representing molecules inside and those representing molecules outside the condensates by comparing the localizations of the molecules throughout their trajectories to the localizations of all the condensates at the corresponding times1.
Next, a survival curve (1 - CDF) is generated using the lengths of all the in-condensate trajectories. The apparent mean residence time of the molecules is then extracted by fitting the survival curve to the following two-component exponential model of protein binding,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" />,
with A as the fraction of molecules non-specifically bound and with kobs,ns and kobs,s as the observed dissociation rates of the non-specifically bound and specifically bound molecules, respectively. Only kobs,s is considered from here onward. The dynamics of both protein dissociation, ktrue,s, and photobleaching of the fluorophore, kpb, contribute to kobs,s as
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" />;
thus, to isolate the effects of protein dissociation, the specific dissociation rate of H2B-Halo in the cell line mentioned prior is measured.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" />
H2B is a protein that is stably integrated into chromatin and that experiences minimal dissociation in the time scale of a single-molecule movie acquisition37. Its specific dissociation rate is then equal to the photobleaching rate of the PA-JF646 Halo ligand, or
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" />.
The mean in-condensate residence time of the protein of interest, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" />, is then
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" />.
Representative results from Irgen-Gioro et al.40 are shown, where this protocol was applied to demonstrate that fusing an oligomerization domain to IDR results in longer residence times of the IDR in its condensates. This result suggests that the added oligomerization domain stabilizes the homotypic interactions of the IDR that drives LLPS. In principle, the same method with slightly modified protocols can be applied to characterize the homotypic or heterotypic interactions of any protein that participates in the formation of any types of condensates.

Yazar Spotlight: Canlı İnsan Hücrelerinde Protein-Kondensat Dinamiklerinin Değerlendirilmesi

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

1 Our lab aims to understand the interaction behaviors<v>2 of intrinsically disordered protein regions 3 and how they play roles in transcriptional regulation 4 in healthy and diseased human cells. 5 In our lab, we develop and use novel 6 single molecule microscopy techniques 7 in combination with molecular biology, 8 biochemical and proteomic approaches 9 to study biomolecular condensates. 10 This protocol enables the quantification of the dynamics 11 by which a specific protein 12 binds to a particular type of condensate 13 in live human cells, 14 and is broadly applicable 15 to measuring the interaction dynamics of any protein 16 that participates in liquid-liquid phase separation.

Burada, iki proteinin kendi kendine bir araya gelen LLPS kondensatlarındaki etkileşim dinamiklerini karşılaştırmak için bu SPT protokolünü kullandığımız Irgen-Gioro ve ark.40'tan temsili sonuçlar sunuyoruz. TAF15 (TATA-kutu bağlayıcı protein ilişkili faktör 15), insan hücrelerinde aşırı ekspresyon üzerine LLPS'ye maruz kalabilen bir IDR içerir. 24 alt birimli bir oligomer oluşturan TAF15 (IDR) ile FTH1 (ferritin ağır zincir 1) arasında kaynaştırmanın, LLPS'yi yönle...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Evaluation of Protein-Condensate Dynamics in Live Human Cells at JoVE.com

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

single-molecule-measurement-protein-interaction-dynamics-within

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

2.6K Görüntüleme.  California Institute of Technology. 1 Laboratuvarımız, sağlıklı ve hastalıklı insan hücrelerinde içsel olarak düzensiz protein bölgelerinin 3 etkileşim davranışlarını 2 ve bunların transkripsiyonel düzenlemede 4 nasıl rol oynadıklarını anlamayı amaçlamaktadır. 5 Laboratuvarımızda, biyomoleküler kondensatları incelemek için moleküler biyoloji, 8 biyokimyasal ve proteomik yaklaşımlar 9 ile birlikte yeni 6 tek moleküllü mikroskopi teknikleri 7 geliştiriyor ve...

Video: Yazar Spotlight: Canlı İnsan Hücrelerinde Protein-Kondensat Dinamiklerinin Değerlendirilmesi

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Biyoloji

Halo-Ligand Staining of Cells for Protein Condensate-Interaction Studies Using Single-Molecule Imaging

1 After creating the cell lines<v>2 expressing the HaloTag protein of interest and Halo-H2B, 3 prepare the halo ligand staining reagent 4 separately for both of them. 5 Rinse the cells with two milliliters of PBS. 6 Add halo ligand containing media 7 and incubate them at 37 degrees Celsius 8 with 5%carbon dioxide for one hour.9 After removing the staining media, 10 rinse the cells four times with PBS 11 and incubate them with fresh media devoid of halo ligands. 12 After four such rinse incubation cycles, 13 transfer the cover slip with cells 14 to a microscope stage compatible chamber 15 with sterile forceps. 16 Add phenol red-free media to the chamber before imaging.

Tek Moleküllü Görüntüleme Kullanılarak Protein Kondensat-Etkileşim Çalışmaları için Hücrelerin Halo-Ligand Boyanması

Single-Molecule Imaging of Halo-Tagged Proteins to Study Protein-Condensate Interactions

1 To begin, obtain ligand stain cells<v>2 expressing halo-tagged protein of interest and halo H2B. 3 After turning on the microscope system, 4 set the live cell incubation parameters 5 and let the system equilibrate. 6 Put a drop of the oil onto 7 a 100x TIRF objective on the microscope 8 and load the cell sample onto the microscope stage.9 To identify a morphologically healthy cell, 10 adjust the Z position 11 and image the cell sample under brightfield illumination. 12 Crop the field of view to capture the target cell nucleus. 13 Using laser illumination, adjust the TIRF angle 14 to achieve hilo illumination with an optimal 15 signal to noise ratio of a single molecule.16 Then, set the exposure time to 500 milliseconds. 17 During the dead time between frames, 18 photo activate the molecules 19 with a 111 microwatt 405 nanometer beam, 20 and during each exposure, excite H2B halo molecules 21 with a 9.1 milliwatt 640 nanometer beam. 22 Initiate image capturing for 2000 frames continuously 23 and gradually increase the power of the 405 nanometer beam 24 upon reduction of photo activated molecules.25 For a halo-tagged protein of interest, 26 split emission wavelengths between two cameras 27 using a long pass dichroic mirror. 28 To the same acquisition parameters demonstrated earlier, 29 add JFX549 channel to acquire one frame every 10 seconds 30 and capture 2000 frames continuously.

Protein-kondensat etkileşimlerini incelemek için halo etiketli proteinlerin tek moleküllü görüntülenmesi

Analysis of Single-Molecule Imaging Data to Study Interactions of Halo-Tagged Proteins

1 To begin, perform live cell<v>2 single molecule imaging of HaloTag protein condensates. 3 Using ImageJ, convert each channel 4 from the raw imaging data file 5 into an independent TIFF file. 6 If necessary, run pre-tracking comb.text 7 and follow the prompts 8 to replace any frames with the most recent ones. 9 To load the single molecule of movie file in SlimFast, 10 click on load, followed by image stack. 11 Set the parameters for localization 12 and acquisition under respective option sheets.13 Visualize the localizations of all the molecules. 14 And using lock all, 15 generate a file containing the localizations 16 of all the molecules in every frame. 17 Next, go to load particle data 18 and select SlimFast to load the file 19 with localization and acquisition settings.20 Using option and sheet tracking, 21 adjust the parameters for trajectory generation. 22 Click on gen traj to generate a file 23 containing the trajectories of all the molecules. 24 Load the sheet tracked file into eval SPT 25 and set the parameters 26 to filter out the trajectories shorter than 2.5 seconds.27 Using export data, generate a file 28 with all the filtered trajectories. 29 Running the ImageJ macro, nucleus, 30 and cluster mask version two. text, 31 threshold all the frames of the movie acquired 32 in the JFX549 channel to generate a time lapse movie 33 populated with the time evolving binary mask 34 highlighting condensate locations.35 Using convert ASCII slow tracking CSS 3. M, 36 reformat the trajectories 37 and run categorization version 4. M 38 to sort them based on the lifetime 39 a molecule spends in a condensate.40 Next, using plot residence hist CSS. M, 41 extract the observed dissociation rate 42 of specifically bound molecules 43 and the photobleaching rate from the in condensate 44 protein of interest and the H2B trajectories. 45 Finally, calculate the corrected mean residence time 46 of the protein of interest, 47 specifically bound to its condensates.48 A frame from two-color single molecule movie 49 of TAF15 IDR-Halo-FTH1 shows signals 50 from the nucleus in both PA-JF646 and JFX549 channels. 51 Upon assembling and sorting, 52 a clear distinction was observed for the trajectories 53 of PA-JF646 detected molecules bound to the condensates. 54 The calculated mean residence times 55 after correction for photobleaching 56 were more for TAF15-Halo-FTH1 than Halo-TAF15.