Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship sob o Grant No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.) e Margaret E. Bolsa Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. também é apoiado pelo NIH/NCI sob o número de prêmio P30CA016042.

1. Marcação de proteínas em células
<ol><li>Expresse a proteína de interesse fusionada ao HaloTag na linhagem celular desejada.</li>
	<li>Expressam H2B marcados com Halo de forma estável no mesmo tipo de células que no 1.1 usando transposons ou transdução viral.</li>
</ol>2. Preparação de lamínulas
<ol><li>Antes de usar lamínulas para cultura celular, limpe as lamínulas para remover contaminantes autofluorescentes.<ol><li>Monte as tampas de 25 mm de diâmetro, #1,5 em um rack de coloração cerâmica e coloque em um recipiente de polipropileno.</li>
		<li>Mergulhe completamente as lamínulas em uma solução de 1 M de KOH e sonicate por 1 h.</li>
		<li>Enxágue três vezes com água bidestilada (ddH2O).</li>
		<li>Mergulhe completamente as lamínulas em etanol 100% e sonicate por 1 h.</li>
		<li>Mergulhe completamente as lamínulas em etanol a 20% diluído com ddH2O e guarde a 4 °C até à utilização.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação das células para microscopia
NOTA: Execute as etapas desta seção em um gabinete de biossegurança para evitar a contaminação das células.
<ol><li>Células de placa em lamínulas limpas. Realizar 2 dias antes da aquisição de imagens se a proteína marcada com Halo for expressa transitoriamente. Realizar 1 dia antes da aquisição de imagens se a proteína marcada com Halo estiver expressa de forma estável ou endógena.<ol><li>Use pinças estéreis para colocar lamínulas em uma placa de 6 poços (uma lamínula/poço por amostra de célula) e permitir que o etanol residual evapore.</li>
		<li>Placa cada poço com um número adequado de células para atingir 70% de confluência no momento da imagem. Placa um poço adicional com células expressando H2B-Halo de forma estável com a mesma confluência alvo.</li>
		<li>Siga este passo somente se expressar transitoriamente a proteína marcada com Halo de interesse. Incubar as células durante 24 h a 37 °C e 5% CO2. Em seguida, transfectar as células com o plasmídeo que codifica a proteína marcada de interesse usando reagentes de transfecção apropriados e seguindo as diretrizes do fabricante.</li>
		<li>Incubar as células durante 24 h a 37 °C e 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorir as células que expressam a proteína marcada com Halo de interesse com um ligante Halo não fotoativável (por exemplo, JFX549) e um ligante Halo fotoativável (por exemplo, PA-JF646). Células corais expressando H2B-Halo apenas com o ligante Halo fotoativável. NOTA: As concentrações dos ligantes Halo listados aqui devem ser usadas como ponto de partida; A concentração ótima dependerá do nível de expressão e da concentração local em condensado da proteína de interesse.<ol><li>Para cada amostra celular que expresse a proteína marcada com Halo de interesse, diluir 100 nM JFX549 Halo ligante35 e 20 nM PA-JF646 Halo ligante36 em 500 μL de meio celular apropriado. Para cada amostra que expresse H2B-Halo, diluir apenas 20 nM PA-JF646 Halo ligante em 500 μL de meio celular apropriado.</li>
		<li>Para cada poço, aspirar o meio existente, adicionar 2 mL de 1x PBS, em seguida, aspirar PBS (isso é referido como um "enxágue" para o restante do protocolo) e substituir por meios contendo os ligantes Halo apropriados.</li>
		<li>Incubar durante 1 h a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Enxágue com PBS quatro vezes e substitua por meios frescos que não contenham ligantes Halo.</li>
		<li>Incubar durante 15 min a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Repetir os passos 3.2.4 e 3.2.5 três vezes (quatro ciclos de incubação de lavagem no total).</li>
		<li>Use pinças estéreis para transferir a lamínula com células para uma câmara de lamínula de cultura celular compatível com o estágio do microscópio.</li>
		<li>Adicione o meio livre de fenol vermelho à câmara e prossiga para a obtenção de imagens. Incubar as amostras que não estão imediatamente a ser fotografadas a 37 °C e 5% de CO2 até que seja necessário.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imagem de molécula única
NOTA: Experimentos independentes medindo os tempos de residência do H2B e da proteína de interesse devem ser conduzidos ao longo de vários (≥3) dias para gerar resultados estatisticamente significativos. Antes de obter imagens de amostras de células no microscópio, alinhe as duas câmeras usando microesferas coradas com 0,1 μm (Tabela de Materiais) ou um padrão de calibração semelhante.
<ol><li>Prepare o microscópio.<ol><li>Ligue o microscópio e o computador que controla o microscópio.</li>
		<li>Ligue os componentes de incubação de células vivas (aquecedor e CO2) no microscópio e ajuste para 37 °C e 5% CO2. Permita que o sistema se equilibre.</li>
		<li>Coloque uma gota do óleo apropriado em uma objetiva de imersão de óleo TIRF de 100x no microscópio e carregue a amostra de célula no estágio do microscópio.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificar uma célula para imagem.<ol><li>Fotografe a amostra de células sob iluminação de campo brilhante e ajuste a posição z até que as células estejam em foco.</li>
		<li>Identificar uma célula que apresenta características morfológicas de células saudáveis.</li>
		<li>Recorte o campo de visão (FOV) para que ele capture apenas o núcleo da célula alvo.</li>
		<li>Use iluminação a laser e ajuste o ângulo TIRF até que a iluminação HILO41 com ótima relação sinal-ruído de moléculas individuais seja alcançada.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem H2B-Halo em células vivas. NOTA: As potências do laser usadas nesta seção são específicas para este experimento e incluídas como exemplo. Potências apropriadas do laser devem ser escolhidas de acordo com os critérios listados na discussão.<ol><li>Configure uma configuração de aquisição da seguinte maneira. Defina o tempo de exposição como 500 ms. Durante cada exposição de 500 ms, excite as moléculas de H2B-Halo marcadas com PA-JF646 com um feixe de 9,1 mW e 640 nm. Durante o tempo morto entre os quadros (158,01 μs no sistema de imagem usado aqui), fotoative as moléculas com um feixe de 111 μW, 405 nm.</li>
		<li>Capture 2000 quadros continuamente nessas configurações. Aumentar gradualmente a potência do feixe de 405 nm ao longo da aquisição quando o número de moléculas fotoativadas se tornar insuficiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem da proteína marcada com Halo de interesse em células vivas.<ol><li>Use um espelho dicroico de passagem longa para dividir comprimentos de onda de emissão entre duas câmeras, uma para detectar PA-JF646 e outra para detectar JFX549. Use filtros de emissão apropriados na frente das câmeras.</li>
		<li>Use a mesma configuração de aquisição descrita em 4.3.1 com a seguinte modificação. Adicione um canal JFX549 adicional para rastrear locais dos condensados de proteína marcados com Halo ao longo do tempo. A cada 10 s, adquira um quadro (500 ms, 2,1 mW, excitação de 561 nm) no canal JFX549, mantendo a aquisição do canal PA-JF646. Isso causará sangria no canal PA-JF646, que será atendido na análise de dados pós-aquisição.</li>
		<li>Capture 2000 quadros continuamente nessas configurações. Aumentar gradualmente a potência do feixe de 405 nm ao longo da aquisição quando o número de moléculas fotoativadas se tornar insuficiente.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análise de dados de imagem de molécula única
NOTA: Os parâmetros usados ao longo da seção 5 são específicos para este experimento e incluídos como exemplo. Os parâmetros apropriados devem ser escolhidos de acordo com os critérios listados na discussão.
<ol><li>Preparar dados brutos de imagem para processamento.<ol><li>Para os dados da proteína de interesse, converta cada canal do arquivo de dados de imagem bruto em um arquivo de .tif independente usando ImageJ ou software de processamento de imagem semelhante. Para os dados do H2B, converta o canal único do arquivo de dados de imagem bruta em um arquivo .tif da mesma maneira. NOTA: Dependendo do software de aquisição que está sendo usado, pode haver quadros vazios no filme de condensado, pois apenas um quadro de rastreamento de condensado é obtido a cada 10 s. Os quadros vazios devem ser preenchidos com o quadro de condensado mais recente (algum software de aquisição faz isso automaticamente). Além disso, se houver sangria significativa do canal de condensado (JFX549) para o canal de molécula única (PA-JF646) durante esses quadros de rastreamento de condensado, os quadros de molécula única correspondentes devem ser substituídos pelo quadro de molécula única mais recente.</li>
		<li>Se houver algum quadro que precise ser substituído em qualquer filme devido aos motivos acima, substitua-o pelo quadro mais recente desse filme modificando (se necessário) e executando pretracking_comb.txt, uma macro ImageJ disponível em Chong et al.1 e seguindo os prompts.</li>
	</ol></li>
	<li>Gere trajetórias de partícula única usando um software SPT, por exemplo, SLIMfast39, uma implementação GUI do algoritmo MTT38 disponível em Teves et al.42.<ol><li>Carregue o arquivo da versão 5.1.2 que contém o filme de molécula única no SLIMfast clicando em Load > Imagestack.</li>
		<li>Defina os parâmetros (taxa de erro de localização: 10-6; loops de deflação: 3) para localização clicando em OPT > Sheet: Localization.</li>
		<li>Definir os parâmetros (pico de emissão: 664 nm; lag time: 500 ms) para aquisição clicando em OPT > Sheet: Acquisition.</li>
		<li>Visualize as localizações de todas as moléculas em um único quadro para garantir que os parâmetros escolhidos sejam apropriados (TEST LOC). Se não for adequado, modifique os parâmetros nos passos 5.2.2 e 5.2.3 e repita este passo.</li>
		<li>Gere um arquivo contendo as localizações de todas as moléculas em cada quadro (LOC ALL).</li>
		<li>Carregue o arquivo da versão 5.2.5 no SLIMfast clicando em Carregar dados de partículas > > SLIMfast.</li>
		<li>Definir os parâmetros (coeficiente de difusão máximo esperado: 0,1 μm2/s; número máximo de concorrentes: 5) para geração de trajetória clicando em OPT > Sheet: Tracking.</li>
		<li>Gere um arquivo contendo as trajetórias de todas as moléculas (GEN TRAJ).</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrar as trajetórias menores que tmin, 2,5 s, usando o evalSPT39, disponível em Drosopoulos et al.43, para explicar erros de rastreamento que resultam em trajetórias artificialmente curtas.<ol><li>Carregue o arquivo da 5.2.8 no evalSPT (+ > arquivo da 5.2.8 > OK).</li>
		<li>Defina os parâmetros (min: 5 quadros; max: comprimento máximo da trajetória para o arquivo a partir de 5.2.8) para filtrar as trajetórias menores que 2,5 s.</li>
		<li>Gere um arquivo com todas as trajetórias filtradas (EXPORT DATA).</li>
	</ol></li>
	<li>Siga este passo apenas para as trajetórias da proteína de interesse. Classifique as trajetórias entre as que estão nos condensados e fora dos condensados e, em seguida, extraia o tempo médio de residência no condensado. NOTA: Todos os códigos para esta seção estão disponíveis em Chong et al.1.<ol><li>Limite todos os quadros do filme adquiridos no canal JFX549 para gerar um filme de lapso de tempo preenchido com a máscara binária de evolução temporal realçando locais de condensado executando a macro, o núcleo e o cluster do ImageJ mask_v2.txt e seguindo os prompts.</li>
		<li>Reformatar as trajetórias de molécula única geradas no item 5.3.3. usando o script MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, e ajustando os nomes de arquivo, caminhos e parâmetros conforme necessário. (Parâmetros: Exposição, 0,5 s; Resolução, 0,16 μm/pixel).</li>
		<li>Classifique trajetórias com base na fração do tempo de vida que uma determinada molécula passa em um condensado, F, usando o script MATLAB, categorization_v4.m, e ajustando os nomes de arquivos e caminhos conforme necessário.</li>
		<li>Prossiga usando apenas trajetórias em condensado.</li>
	</ol></li>
	<li>Extrair kobs,s e kpb e calcular o tempo médio de residência corrigido, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">.<ol><li>Extraia kobs,s da proteína in-condensada das trajetórias de interesse usando o script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, e ajustando nomes de arquivos, caminhos e parâmetros conforme necessário. (Parâmetros: Exposição, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 quadros).</li>
		<li>Extraia kpb das trajetórias H2B usando o script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, e ajustando nomes de arquivos, caminhos e parâmetros conforme necessário. (Parâmetros: Exposição, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 quadros).</li>
		<li>Calcular o tempo médio de residência corrigido da proteína de interesse especificamente ligada aos seus condensados, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">como , <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: Controles devem ser realizados para verificar se diferentes tempos de exposição que são longos o suficiente para borrar partículas móveis, por exemplo, 300 ms e 800 ms, ainda resultam no mesmo tempo médio de residência da proteína de interesse.</li>
	</ol></li>
</ol>

Quantificação baseada em imagens de moléculas únicas de células vivas de interações proteicas

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo aqui apresentado é projetado para sistemas como os investigados em Irgen-Gioro et al.40. Dependendo da aplicação, alguns componentes do protocolo podem ser modificados, por exemplo, o método de geração de linhagens celulares marcadas fluorescentemente, o sistema de marcação fluorescente e o estilo de lamínula usado. A marcação de uma proteína em uma célula pode ser feita usando duas estratégias, dependendo de qual é mais adequada para um determinado experimento. 1) Expre...

Um crescente corpo de trabalhos sugere que os condensados biomoleculares desempenham um papel importante na organização celular e em numerosas funções celulares, por exemplo, regulação transcricional 1,2,3,4,5, reparo de danos ao DNA 6,7,8, organização da cromatina 9,10,11,12, cromossomo X inativação 13,14,15 e sinalização intracelular 16,17,18. Além disso, a desregulação dos condensados biomoleculares está implicada em muitas doenças, incluindo cânceres 19,20,21 e doenças neurodegenerativas 22,23,24,25,26. A formação de condensado é frequentemente impulsionada por interações transitórias, seletivas e multivalentes proteína-proteína, proteína-ácido nucleico ou ácido nucleico-ácido nucleico27. Sob certas condições, essas interações podem levar à separação de fase líquido-líquido (LLPS), uma transição de densidade que enriquece localmente biomoléculas específicas em gotículas sem membrana. Tais interações multivalentes são frequentemente mediadas pelas regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) das proteínas 1,28,29. A caracterização biofísica dessas interações em nível molecular é crítica para a compreensão de inúmeras funções celulares saudáveis e aberrantes, dada a penetração de condensados através delas. Embora técnicas baseadas em microscopia confocal de fluorescência, por exemplo, recuperação de fluorescência após fotoclareamento (FRAP)30,31,32, tenham sido amplamente utilizadas para mostrar qualitativamente que as trocas moleculares entre condensados e o ambiente celular circundante são dinâmicas, quantificar a dinâmica de interação de biomoléculas específicas dentro de condensados geralmente não é possível usando microscopia confocal convencional ou molécula única microscopia sem métodos especializados de análise de dados. A técnica de rastreamento de partícula única (SPT) descrita neste protocolo é baseada em microscopia de célula única de célula viva33 e fornece uma ferramenta excepcionalmente poderosa para quantificar a dinâmica de interação entre proteínas específicas dentro de condensados. A leitura do TCP para tal medida é o tempo médio de residência de uma proteína de interesse nos condensados.
O protocolo pode ser dividido em duas partes - aquisição e análise de dados. O primeiro passo da aquisição de dados de imagem é expressar nas células uma proteína de interesse que é fusionada a um HaloTag34. Isso permite a marcação da proteína de interesse com dois fluoróforos, onde a maioria das moléculas de proteína deve ser marcada com um fluoróforo não fotoativável (por exemplo, ligante35 do Halo JFX549) e uma pequena fração delas deve ser marcada com um fluoróforo fotoativável espectralmente distinto (por exemplo, o ligante36 do Halo PA-JF646). Isso permite a aquisição simultânea de todos os locais de condensado na célula e a aquisição de filmes de molécula única da proteína de interesse ligando e desligando aos condensados. Enquanto isso, o mesmo tipo de células é modificado para expressar de forma estável H2B marcado com Halo, uma histona que é em grande parte imóvel na cromatina. As células são então coradas com o ligante PA-JF646 Halo para permitir a imagem de uma única molécula de H2B. Como será discutido em detalhes a seguir, este experimento explica a contribuição do fotoclareamento para permitir a quantificação precisa da dinâmica de interação da proteína de interesse. As células para experimentos de imagem devem então ser cultivadas em lamínulas limpas, coradas com ligantes(es) HaloTag e montadas em uma câmara de imagem de células vivas. A partir daí, a amostra é fotografada sob iluminação de folha óptica altamente inclinada e laminada (HILO) em um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) capaz de obter imagens de dois canais e detecção de molécula única. A emissão é então dividida em duas câmeras, uma rastreando posições de condensado e outra rastreando moléculas individuais. A aquisição é realizada com um longo tempo de integração (da ordem de centenas de ms) para borrar proteínas de difusão livre e capturar apenas proteínas que são menos móveis devido à ligação a estruturas estáveis na célula37.
O primeiro passo da análise dos dados é usar um algoritmo estabelecido de rastreamento de partícula única (SPT)38,39 para localizar moléculas de proteína individuais em cada quadro do filme e montar as localizações em uma trajetória para cada molécula ao longo de sua vida útil detectável. As trajetórias são então classificadas entre as que representam moléculas dentro e as que representam moléculas fora dos condensados, comparando-se as localizações das moléculas ao longo de suas trajetórias com as localizações de todos os condensados nos tempos correspondentes1.
Em seguida, uma curva de sobrevivência (1 - CDF) é gerada usando os comprimentos de todas as trajetórias no condensado. O tempo de residência médio aparente das moléculas é então extraído ajustando-se a curva de sobrevivência ao seguinte modelo exponencial de dois componentes de ligação às proteínas,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;">,
com A como a fração de moléculas não especificamente ligadas e com kobs,ns e kobs,s como as taxas de dissociação observadas das moléculas não especificamente ligadas e especificamente ligadas, respectivamente. Apenas kobs,s é considerado daqui em diante. A dinâmica de dissociação deproteínas, k true,s, e o fotoclareamento do fluoróforo, kpb, contribuem para kobs,s como
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;">;
assim, para isolar os efeitos da dissociação proteica, a taxa de dissociação específica do H2B-Halo na linhagem celular mencionada anteriormente é medida.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;">
A H2B é uma proteína que se integra de forma estável à cromatina e que experimenta dissociação mínima na escala de tempo de aquisição de uma única molécula37. Sua taxa de dissociação específica é então igual à taxa de fotobranqueamento do ligante PA-JF646 Halo, ou
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;">.
O tempo médio de residência em condensado da proteína de interesse, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, é então
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;">.
Resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40 são mostrados, onde esse protocolo foi aplicado para demonstrar que a fusão de um domínio de oligomerização ao IDR resulta em maior tempo de residência do IDR em seus condensados. Esse resultado sugere que o domínio de oligomerização adicionado estabiliza as interações homotípicas do IDR que impulsiona a LLPS. Em princípio, o mesmo método com protocolos ligeiramente modificados pode ser aplicado para caracterizar as interações homotípicas ou heterotípicas de qualquer proteína que participe da formação de quaisquer tipos de condensados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m TetraSpeck microsphere</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Diameter, #1.5 Coverslips</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>111650</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>593/40 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>676/37 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-676/37-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well TC Plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-105MP</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line: U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 
			.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Rack</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>24957</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Low Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-567-022</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Lab Alley</td>
			<td>EAP200-1GAL</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evalSPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikon Ultra CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>X-13723</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R635-25x36</td>
			<td>Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUN-F Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: 405/488/561/640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nucleus and cluster mask_v2.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6984-06</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pretracking_comb.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLIMfast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubation system</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: For live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwinCam dual emission image splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>5800</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule measurement of protein interaction dynamics within biomolecular condensates

Condensados biomoleculares formados via separação de fase líquido-líquido (LLPS) têm sido considerados críticos na organização celular e em um número crescente de funções celulares. A caracterização da LLPS em células vivas também é importante porque a condensação aberrante tem sido associada a inúmeras doenças, incluindo cânceres e doenças neurodegenerativas. A LLPS é frequentemente impulsionada por interações seletivas, transitórias e multivalentes entre proteínas intrinsecamente desordenadas. De grande interesse são as dinâmicas de interação das proteínas participantes do LLPS, que são bem resumidas por medidas de seu tempo de residência de ligação (TR), ou seja, a quantidade de tempo que passam ligadas dentro dos condensados. Aqui, apresentamos um método baseado em imagens de célula única de célula viva que nos permite medir a RT média de uma proteína específica dentro de condensados. Visualizamos simultaneamente moléculas proteicas individuais e os condensados com os quais elas se associam, usamos rastreamento de partícula única (SPT) para traçar trajetórias de molécula única e, em seguida, ajustamos as trajetórias a um modelo de ligação proteína-gotícula para extrair o TR médio da proteína. Finalmente, mostramos resultados representativos onde este método de imagem de molécula única foi aplicado para comparar as médias de RTs de uma proteína em seus condensados de LLPS quando fundida e não fundida a um domínio oligomerizante. Este protocolo é amplamente aplicável para medir a dinâmica de interação de qualquer proteína que participa de LLPS.

A growing body of work suggests that biomolecular condensates play an important role in cellular organization and numerous cellular functions, e.g., transcriptional regulation1,2,3,4,5, DNA damage repair6,7,8, chromatin organization9,10,11,12, X-chromosome inactivation13,14,15, and intracellular signaling16,17,18. In addition, the dysregulation of biomolecular condensates is implicated in many diseases, including cancers19,20,21 and neurodegenerative disorders22,23,24,25,26. Condensate formation is often driven by transient, selective, and multivalent protein-protein, protein-nucleic acid, or nucleic acid-nucleic acid interactions27. Under certain conditions, these interactions can lead to liquid-liquid phase separation (LLPS), a density transition that locally enriches specific biomolecules in membraneless droplets. Such multivalent interactions are often mediated by the intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins1,28,29. Biophysical characterization of these interactions at the molecular level is critical to our understanding of numerous healthy and aberrant cellular functions, given the pervasiveness of condensates across them. Although techniques based on confocal fluorescence microscopy, e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)30,31,32, have been widely used to qualitatively show that the molecular exchanges between condensates and the surrounding cellular environment are dynamic, quantifying the interaction dynamics of specific biomolecules within condensates is generally not possible using conventional confocal microscopy or single-molecule microscopy without specialized data analysis methods. The single-particle tracking (SPT) technique described in this protocol is based on live-cell single-molecule microscopy33 and provides a uniquely powerful tool to quantify the interaction dynamics between specific proteins within condensates. The readout of SPT for such measurement is the mean residence time of a protein of interest in the condensates.
The protocol can be broken down into two parts - data acquisition and data analysis. The first step of imaging data acquisition is to express in cells a protein of interest that is fused to a HaloTag34. This enables labeling of the protein of interest with two fluorophores, where a majority of the protein molecules are to be labeled with a non-photoactivatable fluorophore (e.g., JFX549 Halo ligand35) and a small fraction of them are to be labeled with a spectrally distinct, photoactivatable fluorophore (e.g., PA-JF646 Halo ligand36). This allows for the simultaneous acquisition of all condensate locations in the cell and the acquisition of single-molecule movies of the protein of interest binding and unbinding to the condensates. Meanwhile, the same type of cells are modified to stably express Halo-tagged H2B, a histone that is largely immobile on chromatin. The cells are then stained with the PA-JF646 Halo ligand to enable single-molecule imaging of H2B. As will be discussed in detail below, this experiment accounts for the contribution of photobleaching to enable precise quantification of the interaction dynamics of the protein of interest. Cells for imaging experiments must then be cultured on clean coverslips, stained with HaloTag ligand(s), and assembled into a live-cell imaging chamber. From there, the sample is imaged under highly inclined and laminated optical sheet (HILO) illumination on a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope capable of two-channel imaging and single-molecule detection. The emission is then split onto two cameras, one tracking condensate positions and one tracking single molecules. Acquisition is performed with a long integration time (on the order of hundreds of ms) to blur out freely-diffusing proteins and only capture proteins that are less mobile due to binding to stable structures in the cell37.
The first step of data analysis is using an established single-particle tracking (SPT) algorithm38,39 to localize individual protein molecules in each frame of the movie and assemble the localizations into a trajectory for each molecule over its detectable lifetime. The trajectories are then sorted into those representing molecules inside and those representing molecules outside the condensates by comparing the localizations of the molecules throughout their trajectories to the localizations of all the condensates at the corresponding times1.
Next, a survival curve (1 - CDF) is generated using the lengths of all the in-condensate trajectories. The apparent mean residence time of the molecules is then extracted by fitting the survival curve to the following two-component exponential model of protein binding,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" />,
with A as the fraction of molecules non-specifically bound and with kobs,ns and kobs,s as the observed dissociation rates of the non-specifically bound and specifically bound molecules, respectively. Only kobs,s is considered from here onward. The dynamics of both protein dissociation, ktrue,s, and photobleaching of the fluorophore, kpb, contribute to kobs,s as
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" />;
thus, to isolate the effects of protein dissociation, the specific dissociation rate of H2B-Halo in the cell line mentioned prior is measured.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" />
H2B is a protein that is stably integrated into chromatin and that experiences minimal dissociation in the time scale of a single-molecule movie acquisition37. Its specific dissociation rate is then equal to the photobleaching rate of the PA-JF646 Halo ligand, or
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" />.
The mean in-condensate residence time of the protein of interest, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" />, is then
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" />.
Representative results from Irgen-Gioro et al.40 are shown, where this protocol was applied to demonstrate that fusing an oligomerization domain to IDR results in longer residence times of the IDR in its condensates. This result suggests that the added oligomerization domain stabilizes the homotypic interactions of the IDR that drives LLPS. In principle, the same method with slightly modified protocols can be applied to characterize the homotypic or heterotypic interactions of any protein that participates in the formation of any types of condensates.

Autor em destaque: Avaliação da dinâmica proteína-condensado em células humanas vivas

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

1 Our lab aims to understand the interaction behaviors<v>2 of intrinsically disordered protein regions 3 and how they play roles in transcriptional regulation 4 in healthy and diseased human cells. 5 In our lab, we develop and use novel 6 single molecule microscopy techniques 7 in combination with molecular biology, 8 biochemical and proteomic approaches 9 to study biomolecular condensates. 10 This protocol enables the quantification of the dynamics 11 by which a specific protein 12 binds to a particular type of condensate 13 in live human cells, 14 and is broadly applicable 15 to measuring the interaction dynamics of any protein 16 that participates in liquid-liquid phase separation.

Aqui, apresentamos resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40, onde utilizamos este protocolo de TCP para comparar a dinâmica de interação de duas proteínas em seus respectivos condensados de LLPS auto-montados. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) contém um IDR que pode sofrer LLPS após superexpressão em células humanas. Nós hipotetizamos que a fusão de TAF15(IDR) com FTH1 (ferritin heavy chain 1), que forma um oligômero de 24 subunidades, levaria a interaçõe...

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Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

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Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

2.4K visualizações.  California Institute of Technology. 1 Nosso laboratório tem como objetivo entender os comportamentos de interação2 de regiões proteicas intrinsecamente desordenadas 3 e como elas desempenham papéis na regulação transcricional 4 em células humanas saudáveis e doentes. 5 Em nosso laboratório, desenvolvemos e usamos novas técnicas de microscopia de molécula única 7 em combinação com biologia molecular, 8 abordagens bioquímicas e proteômicas 9 para estudar condensados biomolecul...