עבודה זו קיבלה את התמיכה הכספית של פרויקט USDA-ARS CRIS 6044-42000-011-00D ופרויקט CRIS 6044-21000-005-000-D. אנו מודים לדן טוד על הכנת מתלה החזקת המיני-עמוד. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה נועד אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או תמיכה של משרד החקלאות האמריקאי.

הערכת מיני בוטנים פראיים לעמידות להצטברות אפלטוקסין

<ol>
	<li>Janila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+breeding+for+introgression+of+fatty+acid+desaturase+mutant+alleles+(ahFAD2A+and+ahFAD2B)+enhances+oil+quality+in+high+and+low+oil+containing+peanut+genotypes.">Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2A and ahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes.</a> Plant Sci. 242, 203-213 (2016).</li><li>Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-linear+relationships+between+aflatoxin+B1+levels+and+the+biological+response+of+monkey+kidney+vero+cells.">Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells.</a> Toxins (Basel). 5 (8), 1447-1461 (2013).</li><li>American Association for Cancer Research: AACR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+chemicals+and+industrial+processes+associated+with+cancer+in+humans+based+on+human+and+animal+data:+IARC+Monographs+Volumes+1+to+20.">An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20.</a> Cancer Res. 40 (1), 1-12 (1980).</li><li>Turner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+epidemiology+of+chronic+aflatoxin+driven+impaired+child+growth.">The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth.</a> Scientifica. , 21 (2013).</li><li>Williams, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aflatoxicosis+in+developing+countries:+a+review+of+toxicology,+exposure,+potential+health+consequences,+and+interventions.">Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions.</a> Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).</li><li>van Egmond, H. P., Jonker, M. A., Abbas, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+regulations+on+aflatoxins.">Worldwide regulations on aflatoxins.</a> Aflatoxinandfood safety. , 77-93 (2005).</li><li>European Commission. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commission+Regulation+(EC)+1525/98.">Commission Regulation (EC) 1525/98.</a> Off. J. Eur. Comm. L. 201, 43-46 (1998).</li><li>Bressano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introgression+of+peanut+smut+resistance+from+landraces+to+elite+peanut+cultivars+(Arachis+hypogaea+L).">Introgression of peanut smut resistance from landraces to elite peanut cultivars (Arachis hypogaea L).</a> PLoS ONE. 14 (2), e0211920 (2019).</li><li>de Blas, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+smut+resistance+in+wild+Arachis+species+and+its+introgression+into+peanut+elite+lines.">Identification of smut resistance in wild Arachis species and its introgression into peanut elite lines.</a> Crop Sci. 59 (4), 1657-1665 (2019).</li><li>Mallikarjuna, N., Pande, S., Jadhav, D. R., Sastri, D. C., Rao, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introgression+of+disease+resistance+genes+from+Arachis+kempff-mercadoi+into+cultivated+groundnut.">Introgression of disease resistance genes from Arachis kempff-mercadoi into cultivated groundnut.</a> Plant Breeding. 123 (6), 573-576 (2004).</li><li>Moretzsohn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+peanut+(Arachis+hypogaea+L.)+and+its+wild+relatives+based+on+the+analysis+of+hypervariable+regions+of+the+genome.">Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome.</a> BMC Plant Biol. 4, 1-10 (2004).</li><li>Arias, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+to+screen+wild+peanut+species+for+aflatoxin+accumulation+and+genetic+fingerprinting.">New tools to screen wild peanut species for aflatoxin accumulation and genetic fingerprinting.</a> BMC Plant Biol. 18 (1), 170 (2018).</li><li>Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelationship+of+kernel+water+activity,+soil+temperature,+maturity,+and+phytoalexin+production+in+preharvest+aflatoxin+contamination+of+drought-stressed+peanuts.">Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts.</a> Mycopathologia. 105 (2), 117-128 (1989).</li><li>Paxton, J. D., Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+accumulation+of+legume+phytoalexins.">Biosynthesis and accumulation of legume phytoalexins.</a> Mycotoxins and phytoalexins. , 485-499 (1991).</li><li>Cole, R. J., Dorner, J. W., Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peanut+phytoalexins.">Peanut phytoalexins.</a> Mycotoxins and phytoalexins. , 501-509 (1991).</li><li>Subba Rao, P. V., Strange, R. N., Daniel, M., Purkayastha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry,+biology,+and+role+of+groundnut+phytoalexins+in+resistance+to+fungal+attack.">Chemistry, biology, and role of groundnut phytoalexins in resistance to fungal attack.</a> Handbook of phytoalexin metabolism and action. , 199-227 (1995).</li><li>Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelationship+of+phytoalexin+production+and+disease+resistance+in+selected+peanut+genotypes.">Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes.</a> J. Agric. Food. Chem. 55 (6), 2195-2200 (2007).</li><li>Paxton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytoalexins:+a+working+redefinition.">Phytoalexins: a working redefinition.</a> J. Phytopathol. 101, 106-109 (1981).</li><li>Mansfield, J. W., Bailey, J. A., Mansfield, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+phytoalexins+in+disease+resistance.">The role of phytoalexins in disease resistance.</a> Phytoalexins. , 153-288 (1982).</li><li>Strange, R. N., Ayers, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance:+the+role+of+the+hypersensitive+response+and+phytoalexins.">Resistance: the role of the hypersensitive response and phytoalexins.</a> Plant response to foliar pathogens. , 39-56 (1992).</li><li>Sobolev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+peanut+(Arachis+hypogaea)+phytoalexins+and+selected+natural+and+synthetic+stilbenoids.">Biological activity of peanut (Arachis hypogaea) phytoalexins and selected natural and synthetic stilbenoids.</a> J. Agric. Food Chem. 59 (5), 1673-1682 (2011).</li><li>Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+production+of+phytoalexins+by+peanut+(Arachis+hypogaea)+kernels+in+response+to+invasion+by+Aspergillus+Species.">Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus Species.</a> J. Agric. Food Chem. 56 (6), 1949-1954 (2008).</li><li>Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+stilbenoids+from+peanut+(Arachis+hypogaea)+seeds+challenged+by+an+Aspergillus+caelatus+strain.">New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain.</a> J. Agric. Food Chem. 57 (1), 62-68 (2009).</li><li>Trucksess, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+column+coupled+with+solution+fluorometry+or+liquid+chromatography+postcolumn+derivatization+for+determination+of+aflatoxins+in+corn,+peanuts,+and+peanut+butter:+collaborative+study.">Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study.</a> J. AOAC Int. 74 (1), 81-88 (1991).</li><li>Dorner, J. W., Blankenship, P. D., Cole, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+two+immunochemical+assays+in+the+analysis+of+peanuts+for+aflatoxin+at+37+field+laboratories.">Performance of two immunochemical assays in the analysis of peanuts for aflatoxin at 37 field laboratories.</a> J. AOAC Int. 76 (3), 637-643 (1993).</li><li>Stroka, J., Anklam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+column+cleanup+with+liquid+chromatography+using+post-column+bromination+for+determination+of+aflatoxins+in+peanut+butter,+pistachio+paste,+fig+paste,+and+paprika+powder:+collaborative+study.">Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder: collaborative study.</a> J. AOAC Int. 83 (2), 320-340 (2000).</li><li>Pal, A., Acharya, D., Saha, D., Roy, D., Dhar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sample+cleanup+during+immunoassay:+a+simple+method+for+rapid+detection+of+aflatoxin+B1+in+food+samples.">In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxin B1 in food samples.</a> J. Food Prot. 68 (10), 2169-2177 (2005).</li><li>Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid,+and+inexpensive+cleanup+method+for+quantitation+of+aflatoxins+in+important+agricultural+products+by+HPLC.">Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC.</a> J. Agric. Food Chem. 55 (6), 2136-2141 (2007).</li><li>Sobolev, V. S., Dorner, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleanup+procedure+for+determination+of+aflatoxins+in+major+agricultural+commodities+by+liquid+chromatography.">Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography.</a> J. AOAC Int. 85 (3), 642-645 (2002).</li><li>Levi, C. P., Borker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+green+coffee+for+potential+aflatoxin+contamination.">Survey of green coffee for potential aflatoxin contamination.</a> J. AOAC. 51 (3), 600-602 (1968).</li><li>Levi, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+study+on+a+method+for+detection+of+aflatoxins+B1+in+green+coffee+beans.">Collaborative study on a method for detection of aflatoxins B1 in green coffee beans.</a> J. AOAC. 52 (6), 1300-1303 (1969).</li><li>Scott, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note+on+analysis+of+aflatoxins+in+green+coffee.">Note on analysis of aflatoxins in green coffee.</a> J. AOAC. 51, 609 (1968).</li><li>Bicking, M. K. L., Kniseley, R. N., Svec, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled-column+system+for+quantitating+low+levels+of+aflatoxins.">Coupled-column system for quantitating low levels of aflatoxins.</a> J. AOAC. 66 (4), 905-908 (1983).</li><li>Kamimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+cleanup+method+for+analysis+of+aflatoxins+and+comparison+with+various+methods.">Simple, rapid cleanup method for analysis of aflatoxins and comparison with various methods.</a> J. AOAC. 68 (3), 458-461 (1985).</li><li>Hoogenboom, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+testing+of+extracts+from+aflatoxin-contaminated+peanut+meal,+following+chemical+decontamination.">Genotoxicity testing of extracts from aflatoxin-contaminated peanut meal, following chemical decontamination.</a> Food Addit. Contam. 18 (4), 329-341 (2001).</li><li>Castro, L., Vargas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+aflatoxins+B1,+B2,+G1+and+G2+in+maize+using+Florisil+clean+up+with+thin+layer+chromatography+and+visual+and+densitometric+Quantitation.">Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using Florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric Quantitation.</a> Cienc. Tecnol. Ailment. Campinas. 21, 115-122 (2001).</li><li>Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+Control+of+Aflatoxins+in+Peanut:+Method+to+Analyze+Mycotoxin+Production+and+Transgene+Expression+in+the+Peanut/Aspergillus+Pathosystem.">RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem.</a> J. Vis. Exp. (106), e53398 (2015).</li><li>Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+among+aflatoxin+test+results+on+runner+peanuts+harvested+from+small+field+plots.">Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots.</a> Peanut Sci. 31 (1), 59-63 (2004).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בהתבסס על ניסיוננו הקודם28, פיתחנו הליך כימי פשוט, זול, ידידותי לסביבה, המתאים לחקר אוספי חיידקי ארכיס בר כדי לזהות מינים עמידים לאספרגילוס ולקבוע ולאפיין מקורות חדשים של עמידות גנטית לפטרייה אופורטוניסטית זו. שיטה זו מבוססת על טיהור תמצית זרעים בטכניקת מיצוי פאזה מוצקה (SPE) וכימות אפלטוקסין על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC) ומאופיינת בהתאוששות, דיוק ודיוק גבוהים מספיק. שיטת "פלוריסיל" המוצעת היא שינוי של הליך ניקוי המיני-עמוד היחיד המבוסס על התכונה הייחודית של פלוריזיל (ג'ל מגנזיום סיליקה) לשמירה חזקה וסלקטיבית על אפלטוקסינים28. כמו בשיטה המקורית, דגימות זרעים חולצו עם תערובת MeOH-H2O אך ביחס שונה של 90:10 (v/v) בהשוואה ל-80:20 (v/v) שפורסם. שינוי זה הגדיל את קצב הזרימה של ממסים דרך עמודת הניקוי עד פי 2.5 עם אותו קצב התאוששות אפלטוקסין. תערובת מתנול-מים זו ביחס 90:10 (v/v) סיפקה כמעט 100% התאוששות של תקני אפלטוקסינים B1, B2, G1 ו-G2 שנוספו למיצוי ממס ברמות ספייק שוות ערך לריכוזי אפלטוקסין של 5-50 ננוגרם ב-1 גרם של מצע, וכן סיפקה התאוששות גבוהה מספיק מדגימות זרעי בוטנים שקוצצו (טבלה 1).
הוכח כי ניתן לדלל אפלטוקסינים מספיגת פלוריזיל רק עם כמויות גדולות של אצטון30, אצטון-מתנול 31,32, ותערובות אצטון-מים 33,34,35,36. במהלך המחקר הנוכחי, גילינו כי אצטוניטריל חומצי מתנהג באופן דומה לאצטון ביכולתו לנטרל אפלטוקסינים מפלוריסיל. למיטב ידיעתנו, תכונה זו של אצטוניטריל לא דווחה בספרות. גילוי תכונה זו מאפשר הזרקת תמצית מטוהרת ישירות למערכת UPLC תוך השמטת שלב אידוי הממס, אשר מקצר באופן משמעותי את זמן ההכנה. גם כאשר אצטוניטריל עורבב עם אצטון (אצטון-אצטוניטריל-מים-88% חומצה פורמית (65:31:3.5:0.5, v/v)), הוא סיפק הסרה חלקה, מלאה ומהירה של מים מהממסים המטוהרים והפחית באופן משמעותי את זמן אידוי הממס. נוכחותו של אצטוניטריל אפשרה שימוש בתערובת ממס יחידה, מתנול-מים (90:10, v/v) כדי להסיר ביעילות זיהומים מעמוד פלורסיל בהשוואה לשיטה שפורסמה, שבה נדרשו שני ממיסי כביסה נוספים, מתנול ותערובת כלורופורם-מתנול. 28
בממוצע, ההתאוששות הסטנדרטית של אפלטוקסין B1 הייתה ~98% בעת שימוש ב -1.2 מ"ל עבור אלוציה של אפלטוקסינים. כמות של 50 מ"ג פלוריזיל נבחרה כך 1.2 מ"ל של ממס elution מילא את המיניטור לחלק העליון של החבית, באותו זמן, סיפק התאוששות משביעת רצון (טבלה 1). גישה זו מזרזת את הליך הניקוי מכיוון שיש למלא את חבית העמודות פעם אחת בלבד. בשלבים המוקדמים של פרויקט זה, לא היה ברור אם מקטע פלורסיל מסחרי בעל גודל חלקיקים גדול יחסית, 100-200 רשת, יתאים לעמוד קטן המכיל שכבה של 3 מ"מ בלבד של חומר סופג. לכן, חקרנו שברים שונים של Florisil שהתקבלו ממוצר מסחרי של 100-200 רשת באמצעות מסננות בדיקה סטנדרטיות בארה"ב 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 ו->400 רשת. כל השברים הללו סיפקו תוצאות ניתנות לשחזור, כמעט תואמות עם התאוששות משביעת רצון. למרות ששברים קטנים יותר בגודל חלקיקים הדגימו פסי אפלטוקסין צרים יותר בטור תחת אור UV, שברים אלה לא היו עדיפים בשום היבט על המוצר המסחרי 100-200 Mesh. בנוסף, שבר הרשת של 100-200 הדגים את זמני ההדחה הקצרים ביותר (8-12 דקות) עבור ההליך כולו.
העברת ממס UPLC הדרגתי אפשרה הפרדה משביעת רצון של אפלטוקסינים, כמו גם הסרה מלאה של זיהומים לא קוטביים מהעמודה (איור 5G). גישה זו הובילה לתפעול עמודות ללא רבב ולתוצאות ניתנות לשחזור של ניתוחים של מאות דגימות. זהותם של אפלטוקסינים שנלקחו מעמוד פלורסיל אושרה כפי שתואר קודם לכן. 28 עמודת UPLC אנליטית בקוטר 3 מ"מ ששימשה כאן הדגימה סלקטיביות גבוהה יותר והפרדה אמינה יותר של אפלטוקסינים B1, B2, G1 ו-G2 בריכוזים גבוהים יותר בהשוואה לעמודת הקוטר 2.1 מ"מ של אותה כימיה. יתר על כן, תוחלת החיים של עמוד 3 מ"מ (מעל 1,200 זריקות) הייתה גבוהה משמעותית מזו של עמוד 2.1 מ"מ (עד 800 זריקות). למרות שעמוד 3 מ"מ דרש קצב גבוה יותר של השלב הנייד (40% יותר), חיסרון זה עלה על היתרונות הנ"ל של העמודה.
המיני-עמוד פלורסיל היה יעיל לטיהור תמציות של זרעי בוטנים מזוהמים מאוד במטבוליטים של אספרגילוס (איור 5G); זרעים כאלה הכילו גם רמות גבוהות של פיטולקסין סטילבנואידים שיוצרו על ידי זרעים בתגובה לפלישה הפטרייתית. כל הזיהומים הללו עשויים לעלות על ריכוז אפלטוקסין בזרעים עד פי 10פי 6 22, מה שהופך זרעים אלה לאובייקטים מאתגרים לניתוח אפלטוקסין. איור 5G מראה את היעדר שיאים מפריעים בכרומטוגרמה בזמני שימור אפלטוקסין, מה שהפך את הזיהוי והכימות של אפלטוקסין ללא פשרות בכל הרמות שנבדקו (טבלה 1). כפי שניתן לראות בטבלה 1, הדיוק והדיוק של השיטה היו גבוהים מספיק בטווח הנבדק של 1.0-50.0 ננוגרם/גרם, שהוא גם הטווח הקריטי ביותר לזיהוי אפלטוקסין. ההתאוששות ברמות שונות עבור גנוטיפים שונים של בוטנים פראיים הייתה אחידה וסטיות התקן עבור חמישה מיצויים שונים היו נמוכות במהותן.
השיטה נבדקה גם על בוטנים, כותנה, תירס וזרעי אורז מזוהמים באופן טבעי מאפס לרמות גבוהות במיוחד - מעל 10,000 ננוגרם/גרם של אפלטוקסינים בסך הכל. ההתאוששות של אפלטוקסינים B1, B2, G1 ו-G2 מתירס, זרעי כותנה ואורז ברמה של 5 ננוגרם/גרם נעה בין 76.1% ל-93.7%, 77.1% ל-86.6% ו-90.5% ל-96.2%, בהתאמה. ההתאוששות הגבוהה ביותר של אפלטוקסינים מאורז לוותה ב"טוהר" של הלואנט, כלומר, כמעט היעדר זיהומים. יתר על כן, אורז ייצג את החפץ היחיד הקטן ביותר שנבדק, בממוצע, 19 מ"ג / זרע.
זמן ההכנה הכולל של זרע בוטנים בודד (כולל הפגזה, שקילה, מיצוי, צנטריפוגה וטיהור) באמצעות עמוד פלורסיל לא עלה על 20 דקות. עלות המיני-עמוד של פלוריזיל נמוכה פי >10 מזו של עמודי ניקוי מסחריים. חיסכון נוסף נובע משימוש בכמויות נמוכות יותר של חומרי ספיגה, ממסים וגז חנקן בהשוואה לנוהל28 שפורסם. המיני-עמוד אינו דורש מכשירי שאיבה או ואקום כדי לפעול, ויש לו חיי מדף בלתי מוגבלים.
חקר חיידקי צמחים לעמידות לאפלטוקסינים קשה במיוחד מכיוון שהצטברות מיקוטוקסין אינה עוקבת אחר התפלגות נורמלית37,38; יש צורך במספר רב של ניתוחי אפלטוקסין בזרעים בודדים כדי להתגבר על תופעה זו. בנוסף לתכולת אפלטוקסין, מידע על הרכב פיטואלכסין כמותי הוא בעל ערך רב לאור גוף מידע גדול שניתן לקבל מזרע בודד (איור 1A) ולעקוב אחריו לצמח מסוים (איור 1E). השיטה שימשה בהצלחה לסינון מאות צירים, כולל זני קרקע, קווי רבייה מתקדמים וזני בוטנים מובחרים. השיטה מוצעת לשימוש בתוכניות מחקר קדם-רבייה ורבייה של בוטנים ועשויה לסייע באפיון גנים של בוטנים לעמידות פטרייתית.

בוטנים (Arachis hypogaea L.) הוא אחד מגידולי המזון העיקריים בעולם. הוא מעובד ביותר מ -100 מדינות עם הייצור הכולל עולה על 45 מיליון טון1. סחורות חקלאיות, כגון בוטנים, תירס וזרעי כותנה פולשות לעתים קרובות על ידי מינים של אספרגילוס, פטריות שנולדו באדמה ומייצרות אפלטוקסינים2. סחורות אלה רגישות במיוחד לזיהום אפלטוקסין לפני הקציר כאשר תנאי הסביבה מאופיינים בטמפרטורות גבוהות ובצורת. אפלטוקסינים הם בין המסרטנים החזקים ביותר הידועים3. הם מזהמים רבע מהסחורות החקלאיות בעולם4 וגורמים לכמחצית מאוכלוסיית העולם להיחשף באופן כרוני לאפלטוקסינים5. בשל הקרצינוגניות הגבוהה והרעילות שלהם, נוכחות אפלטוקסין במזון מוסדרת בגבולות הנמוכים ביותר המקובלים כמעט ברוב מדינות העולם6.
האיחוד האירופי (EU) חוקק רמה מקסימלית של 2 ננוגרם/גרם עבור אפלטוקסין B1 ו-4 ננוגרם/גרם עבור סך כל האפלטוקסינים (B1, B2, G1 ו-G2) במוצרים למאכל אדם7. מגבלות נמוכות כאלה מפעילות לחץ משמעותי על החקלאות ועל תעשיית המזון המעבדת סחורות מזוהמות באפלטוקסינים. ניטור אפלטוקסין ועיבוד מחדש של בוטנים מזוהמים עשויים להיחשב כאסטרטגיה פסיבית ויקרה למניעת כניסה של אפלטוקסינים לשרשרת המזון. זו הסיבה שכל המגזרים העיקריים של תעשיית הבוטנים חווים הפסדי רווח עצומים עקב זיהום אפלטוקסין של זני בוטנים הנוכחיים שלעתים קרובות מפגינים עמידות מוגבלת למחלות פטרייתיות. גישה פרוספקטיבית לפתרון בעיית אפלטוקסין היא להשיג זני בוטנים עמידים לפטריות באמצעות אינטרוגרסיה גנטית, כלומר, העברת מידע גנטי ממיני בוטנים עמידים לזנים מובחרים. בשנים האחרונות 8,9, מיני בוטנים פראיים קיבלו התייחסות משמעותית כמקורות לעמידות למחלות גנטיות מכיוון שהבסיס הגנטי הצר של בוטנים מתורבתים אינו יכול עוד לספק את רמת תכונות העמידות הנדרשת לצמח הבוטנים10,11. הפנמה מוצלחת של מיני בוטנים פראיים דורשת ניתוח של אלפי זרעים בודדים קטנים ונדירים (איור 1A) 12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig1.jpg"> איור 1: תרשים זרימה של ניתוח זרעים בודדים. (A) גודל השוואתי של זני בוטנים שונים מסוג שוק לעומת Arachis spp. (1) וירג'יניה; (2) רץ; (3) ספרדית; (4) Arachis spp. (B) Wild Arachis spp. (צלחת A, זרע 4) חתוך לשלושה חלקים, (5) חצי זרע עם ציר עוברי; חלק זה של הזרע משמש לגידול צמח (E). (C) חלקים (6) ו-(7) נקדחים עם מקדח ו-(D) מחוסנים בנבגי פטריות. לאחר דגירה במשך 72 שעות ב 30 ° C, אחד מחלקי הזרע, (6) או (7) משמש לניתוח aflatoxin ו phytoalexin, ואחר משמש עבור ריצוף RNA/transcriptome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
עמידות בוטנים לפתוגנים פטרייתיים קשורה קשר הדוק עם phytoalexins 13,14,15,16,17. פיטואלכסינים בוטנים מיוצגים על ידי סטילבנואידים מיקרוביאליים המסונתזים ביולוגית ומצטברים ברקמות הצמח לאחר חשיפה לגירויים אקסוגניים, במיוחד לפלישה פטרייתית 16,17,18. הצטברות מהירה של ריכוזים מספיקים של פיטואלקסינים באתר הפלישה הפטרייתית מעכבת את צמיחת הפטריות והיא קריטית להגנת הצומח 19,20,21. הפתוגן מפסיק לגדול כאשר פיטואלכסינים מצטברים לריכוזים מעכבים16,22. תפקידם של סטילבנואידים כתרכובות הגנה נגד פטריות אפלטוקסיגניות בבוטנים הוערך לפני יותר מ-30 שנה בניסויי שדה13. ניסויים אלה תמכו בבירור בהשערה כי סטילבנואידים בוטנים הם גורם התנגדות מכריע בזיהום אפלטוקסין לפני הקציר. ראיות כאלה מבוססות על העובדות שסטילבנים מיוצרים באופן טבעי בבוטנים שניזוקו בשדה; סטילבנים מפגינים פעילות ביולוגית ניכרת נגד פטריות אפלטוקסיגניות; וזיהום אפלטוקסין בזרעים זוהה רק כאשר בוטנים איבדו את היכולת לסינתזה של פיטואלכסין עקב התייבשות זרעים כתוצאה מיובש. סדרה נוספת של ניסויי שדה אישרו את הקשר בין ייצור פיטואלקסין ועמידות גנוטיפ בוטנים למחלות בוטנים חשובות מבחינה חקלאית17.
הבנה טובה יותר של המנגנון הטבעי המבוסס על פיטואלכסין של עמידות בוטנים לפלישה פטרייתית היא אסטרטגיה מבטיחה לשליטה בזיהום אפלטוקסין15,17.לכן, בנוסף לניתוחי אפלטוקסין, חשוב לנתח כמותית את אותם זרעים עבור phytoalexins. למרות שמנגנון עמידות זה אינו נחקר ומובן במלואו, הוא חיוני לגידול ושינוי גנטי של צמחי בוטנים עבור זנים חדשים עמידים לפטריות23. למרות קיומם של הליכים אנליטיים שונים לקביעת אפלטוקסין בסחורות שונות, עדיין יש צורך בשיטות פשוטות למחקר ספציפי, במיוחד כאשר שיטות מסורתיות אינן מספקות דרישות אנליטיות וחסכוניות. שיטות הניקוי המודרניות ביותר המשמשות את תעשיית הבוטנים, החקלאות והמעבדות הפרטיות הן מכשירים מבוססי נוגדנים24 ו-immunoassay 25,26,27. הם סלקטיביים ורגישים, אך יקרים משמעותית ממיני-טורים עמוסים בחומרים סופחים נפוצים. בנוסף, אף אחת מהשיטות הללו לא תוכננה לניתוח של דגימות מעטות במשקל מיליגרם. בהתבסס על המחקר הקודם שלנו על השימוש האנליטי בג'ל מגנזיום סיליקה (Florisil)28, שינינו הליך זה כך שיתאים לצרכים של תוכניות טרום רבייה ורבייה מתמשכות ופוטנציאליות.
מטרת עבודה זו הייתה לפתח שיטה לא הרסנית, בעלת תפוקה בינונית וידידותית לסביבה לקביעה כמותית של אפלטוקסינים ופיטוקסינים בזרעי בוטנים בודדים. שיטה כזו פותחה. היתרונות שלה על פני שיטות שפורסמו הם רגישות גבוהה יותר, היכולת לנתח aflatoxins ו phytoalexins בתמצית זרע יחיד, חוסר הצורך לשקול דגימות, ועלות נמוכה יותר הודות כמויות קטנות יותר של מתכלים. תרשים הזרימה של השיטה המשולבת מוצג באיור 1. הניתוחים הגנטיים והשלבים האחרים מוזכרים בטקסט זה ומודגמים באיור כדי להראות את חשיבות השיטה המוצעת וכיצד היא משולבת בהליך כולו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone, Optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A996-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard pre-column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186003975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity BEH C18 3 x 100mm column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity BEH C18 2.1 x 100mm column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxins B1, B2, G1, and G2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9441-1VL</td>
			<td>Dissolve the contents of the commercial vial in 5 mL of methanol to obtain 5 &#181;g/mL for aflatoxins B1 and G1 and 1.5 &#181;g/mL for B2 and G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxin B1 (1mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6636-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxin B2 (1mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9887-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxin G1 (1mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0138-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxin G2 (1mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0263-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxin M1 (10 &#181;g)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CRM46319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated (2kg)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD214510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina oxide basic (60-325 mesh)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A941-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium</td>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Ruptor 24&#160;</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-042E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (1000mL)</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>10001L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (250mL)</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>1000250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (400mL)</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>1000400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (600mL)</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>1000600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade, scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (LSE Compact)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Model: 6755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, micro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Model: 6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic beads (2.8 mm)</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic beads (6.5 mm)</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromeleon 7 series Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit</td>
			<td>Kyocera</td>
			<td>07896</td>
			<td>1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit</td>
			<td>Kyocera</td>
			<td>07357</td>
			<td>2.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit</td>
			<td>Kyocera</td>
			<td>07985</td>
			<td>2.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2805M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporator, nitrogen</td>
			<td>organimation</td>
			<td>11106</td>
			<td>6-position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel, Microsoft</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (#4)</td>
			<td>Cytiva Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper cutter, stainless steel (ID 11.5mm)</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, glass fibre</td>
			<td>Cytiva Whatman</td>
			<td>934-AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (2800mL)</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>44202XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Florisil (100-200 mesh)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F101-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Integra Lifescience (Miltex)</td>
			<td>PM-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (88%, ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A118P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80oC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TSX70086D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Funnel (15 x 80mm)</td>
			<td>DWK Life Sciences (Kimax)</td>
			<td>2902060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelzan (medium)</td>
			<td>Caisson Labs&#160;</td>
			<td>G024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rod (custom)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handle, scalpel&#160;</td>
			<td>Feather</td>
			<td>#7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-4</td>
			<td>30%, Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket, round with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>136VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>8.2&#34; x 4.39&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34256</td>
			<td>16.4&#34; x 14.43&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>Cenmed</td>
			<td>B113660SBXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini column rack (custom)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer, touch (maxi mix II)</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>37600 (model 231)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves&#160;</td>
			<td>Microflex</td>
			<td>XC310M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, compressed (ultra high purity)</td>
			<td>Jones Welding</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel</td>
			<td>Georgia-Pacific</td>
			<td>20023 (D400)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-636-AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH/ATC electrode</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhCR Photochemical Reactor</td>
			<td>Waters (Vicam)</td>
			<td>600001222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, pasteur</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>9&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (1 mL) (Reference 2)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4924000088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (10 &#956;L) (Reference)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022470051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips: 10 &#956;L, 200 &#956;L, 1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (200 &#181;L)(Ergofit)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-146-679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates, petri (100x15mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (500g)</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;&#160;</td>
			<td>BD213400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reinforced bead tube (2 mL)</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reinforced bead tube (7 mL)</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repipettor, Dispensette III (10mL)</td>
			<td>Brandtech</td>
			<td>4701141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5010-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoop (custom)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screwcap jar (250 mL)&#160;</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>1395250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel, spherical (200-400 mesh)&#160;</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>97727-U</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE extract clean 1.5-mL polypropylene column&#160;</td>
			<td>American Chromotography Supplies</td>
			<td>SP-5122382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE extract clean PP frits (for 1.5 mL minicolumn)</td>
			<td>American Chromotography Supplies</td>
			<td>SP-3119414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer, UV-visible</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-385-351 (Genesys 50)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>982516X</td>
			<td>16x125mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube (Disposable)(16x125mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube (Disposable)(150x250mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Vanquish DAD detector (UPLC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VF-D11-A-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Vanquish Fluourescense detector (UPLC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VF-D51-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Vanquish quaternary pump F (UPLC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VF-P20-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VF-A10-A-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 (polysorbate 20) (enzyme grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial caps (4mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C4015-75A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial caps (autosampler)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C4010-60A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials &#38; caps (16 mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B7800-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials, glass (4mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C4015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials, polypropylene (autosampler) (400mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C4010-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Optima&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-destructive spe-uplc-based quantification of aflatoxins and stilbenoid phytoalexins in single peanut (arachis spp.) seeds

אפלטוקסינים הם מטבוליטים משניים מסרטנים מאוד של כמה מינים פטרייתיים, במיוחד Aspergillus flavus. אפלטוקסינים מזהמים לעתים קרובות סחורות חקלאיות בעלות חשיבות כלכלית, כולל בוטנים, ומהווים סיכון גבוה לבריאות האדם ובעלי החיים. בשל הבסיס הגנטי הצר, זני בוטנים מפגינים עמידות מוגבלת לפתוגנים פטרייתיים. לכן, מינים רבים של בוטנים פראיים עם סובלנות אספרגילוס קיבלו התייחסות משמעותית על ידי מדענים כמקורות עמידות למחלות.
חקר חיידקי צמחים לעמידות לאפלטוקסינים קשה מכיוון שהצטברות אפלטוקסין אינה עוקבת אחר התפלגות נורמלית, המכתיבה את הצורך בניתוח של אלפי זרעי בוטנים בודדים. זרעי בוטנים מיובשים במידה מספקת (Arachis spp.), כאשר הם נגועים בזני אספרגילוס , מסוגלים לייצר סטילבנים פעילים ביולוגית (סטילבנואידים) הנחשבים לפיטואלקסינים הגנתיים. סטילבנים בוטנים מעכבים התפתחות פטרייתית וייצור אפלטוקסין. לכן, חיוני לנתח את אותם זרעים עבור סטילבנואידים בוטנים כדי להסביר את אופי ההתנגדות / רגישות זרעים לפלישת אספרגילוס . אף אחת מהשיטות שפורסמו אינה מציעה ניתוח של זרעים בודדים עבור אפלטוקסינים ו / או פיטואלקסין סטילבן.
ניסינו למלא את הביקוש לשיטה כזו, ידידותית לסביבה, משתמשת בחומרים מתכלים זולים, רגישה וסלקטיבית. בנוסף, השיטה אינה הרסנית מכיוון שהיא משתמשת רק במחצית הזרע ומשאירה את החצי השני המכיל את הציר העוברי שלם. טכניקה כזו מאפשרת נביטה וצמיחה של צמח הבוטנים לבגרות מלאה מאותו זרע המשמש לניתוח אפלטוקסין וסטילבנואידים. החלק המשולב של שיטה זו, האתגר הידני של הזרעים עם אספרגילוס, הוא צעד מגביל הדורש יותר זמן ועבודה בהשוואה לשלבים אחרים בשיטה. השיטה שימשה לחקר חיידקי ארכיס פראיים כדי לזהות מינים עמידים לאספרגילוס ולקבוע ולאפיין מקורות חדשים של עמידות גנטית לפתוגן פטרייתי זה.

Peanut (Arachis hypogaea L.) is one of the major food crops in the world. It is cultivated in more than 100 countries with total production exceeding 45 million tons1. Agricultural commodities, such as peanut, corn, and cottonseed are often invaded by species of Aspergillus, soil-born fungi that produce aflatoxins2. These commodities are particularly susceptible to preharvest aflatoxin contamination when environmental conditions are characterized by high temperatures and drought. Aflatoxins are among the most potent carcinogens known3. They contaminate a quarter of the agricultural commodities in the world4 making about half of the world&#39;s population chronically exposed to aflatoxins5. Due to their high carcinogenicity and toxicity, aflatoxin presence in food is regulated at the lowest practically acceptable limits in most countries of the world6.
The European Union (EU) has legislated a maximum level of 2 ng/g for aflatoxin B1 and 4 ng/g for total aflatoxins (B1, B2, G1, and G2) in products for human consumption7. Such low limits put substantial pressure on agriculture and the food industry that processes commodities contaminated with aflatoxins. Aflatoxin monitoring and reprocessing of contaminated peanuts may be considered a passive and costly strategy to prevent aflatoxins from entering the food chain. That is why all major segments&#160;of the peanut industry experience tremendous profit losses due to the aflatoxin contamination of current peanut cultivars that often demonstrate limited resistance to fungal diseases. A prospective approach to resolve the aflatoxin problem is to obtain fungus-resistant peanut cultivars through gene introgression, that is, the transfer of genetic information from resistant wild peanut species to elite cultivars. In recent years8,9, wild peanut species have received substantial consideration as sources of genetic disease resistance because the narrow genetic base of cultivated peanuts can no longer provide the needed level of resistance traits to the peanut plant10,11. Successful introgression from wild peanut species requires the analyses of thousands of single small and scarce&#160;seeds (Figure 1A) 12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig1.jpg" /> 
Figure 1: Single-seed analysis flowchart. (A) Comparative size of different market-type peanut cultivars vs. wild Arachis spp. (1) Virginia; (2) runner; (3) Spanish; (4) wild Arachis spp. (B) Wild Arachis spp. (plate A, seed 4) cut into three sections, (5) half seed with embryonic axis; this portion of the seed is used to grow a plant (E). (C) Parts (6) and (7) are drilled with a drill bit and (D) inoculated with fungal spores. After incubation for 72h at 30 &#176;C, one of the seed parts, (6) or (7) is used for aflatoxin and phytoalexin analyses, and another is used for RNA/transcriptome sequencing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Peanut resistance to fungal pathogens is strongly associated with phytoalexins13,14,15,16,17. Peanut phytoalexins are represented by antimicrobial stilbenoids that are biosynthesized and accumulated in plant tissues after exposure to exogenous stimuli, particularly, to fungal invasion16,17,18. Rapid accumulation of sufficient concentrations of phytoalexins at the site of fungal invasion is inhibitory to fungal growth and is critical for plant defense19,20,21. Pathogen stops growing when phytoalexins accumulate to inhibitory concentrations16,22. The role of stilbenoids as defensive compounds against aflatoxigenic fungi in peanut was evaluated over 30 years ago in field experiments13. Those experiments clearly supported the hypothesis that peanut stilbenoids are a crucial resistance factor in preharvest aflatoxin contamination. Such evidence is based on the facts that stilbenes are naturally produced in field-damaged peanuts; stilbenes demonstrate appreciable biological activity against aflatoxigenic fungi; and aflatoxin contamination in seeds was detected only when peanuts lost the capacity for phytoalexin synthesis due to drought-induced seed dehydration. Another set of field experiments confirmed the association between phytoalexin production and peanut genotype resistance to agriculturally important peanut diseases17.
A better understanding of the natural phytoalexin-based mechanism of peanut resistance to fungal invasion is a promising strategy for the control of aflatoxin contamination15,17. Therefore, in addition to the aflatoxin analyses, it is important to quantitatively analyze the same seeds for phytoalexins. Although this mechanism for resistance is not fully researched and understood, yet it is crucial for breeding and genetically modifying peanut plants for new fungal-resistant cultivars23. Despite the existence of various analytical procedures for aflatoxin determination in different commodities, there is still a need for simple methods for specific research, particularly when traditional methods do not satisfy analytical and cost-effective requirements. Most modern cleanup methods used by the peanut industry, agriculture, and private laboratories are antibody-based24 and immunoassay25,26,27devices. They are selective and sensitive but substantially more expensive than minicolumns packed with common adsorbents. In addition, none of those methods were designed for the analyses of few-milligram-weight samples. Based on our previous research on the analytical use of magnesium silica gel (Florisil)-packed minicolumns28, we modified this procedure to suit the needs of ongoing and prospective pre-breeding and breeding programs.
The purpose of this work was to develop a non-destructive, medium throughput, environment-friendly method for the quantitative determination of aflatoxins and phytoalexins in single peanut seeds. Such a method has been developed. Its advantages over published methods are higher sensitivity, the ability to analyze aflatoxins and phytoalexins in a single-seed extract, lack of the need to weigh samples, and lower cost thanks to smaller volumes of consumables. The flow chart of the integrated method is shown in Figure 1. The genetic analyses and other steps are mentioned in this text and demonstrated in the figure to show the importance of the suggested method and how it is integrated with the entire procedure.

Author Spotlight: Quantification of aflatoxins and phytoalexins in peanut seeds to identify genetic resistance against Aspergillus

כימות מבוסס SPEP-UPLC לא הרסני של אפלטוקסינים ופיטואלכסינים סטילבנואידים בבוטנים בודדים (Arachis spp.) זרעים

The scope of the research was to develop a method of quantification of aflatoxins and defensive phytoalexins in thousands of peanut seeds for the exploration of wild Arachis germplasm, to identify species resistant to aspergillus, and to determine and characterize novel sources of genetic resistance to this fungal pathogen. Our research group has found that the most promising approach to identify peanut germplasm that does not accumulate aflatoxin is to perform a holistic analysis of each individual seed, including its transcriptomics, genomics, phytoalexins, and mycotoxin profiles. We have developed protocols for wild and cultivated peanut seed analysis, which means using 1/4 of a single seed for chemical profiling, Developing high-throughput methods for effective seed challenging, extraction, and accurate quantification of phytoalexins in peanut seed samples.We have discovered numerous peanut phytoalexins and developed efficient and inexpensive methods for aflatoxin analysis, as well as for screening peanut germplasm with reduced or no aflatoxin accumulation. The methods include genotyping and determination of seed viability.

השיטה שפותחה לכימות אפלטוקסין בזרעים היא הליבה של כל הליך ההערכה של מיני בוטנים בר לעמידות להצטברות אפלטוקסין. מיני-עמודים ומסננים ארוזים בהתאמה אישית מספקים חיסכון משמעותי ומפשטים את ההליך הכולל בשל היעדר כמויות גדולות של ממסים, מסננים מסחריים יקרים ומיותרים של 0.22 או 0.45 מיקרומטר, והתקני שאיבה. השיטה לניתוח אפלטוקסין מספקת התאוששות, דיוק ודיוק גבוהים בטווח הנבדק של 1.0-50.0 ננוגרם/גרם של אפלטוקסינים מזרעים טחונים כפי שניתן לראות בטבלה 1. דגימות מזוהמות מאוד דוללו לערך הנבדק הלינארי. איור 5C מראה הפרדה בסיסית של ארבעה אפלטוקסינים עיקריים, B1, B2, G1 ו-G2 בתוך זמן פליטה של 5 דקות, וזה מקובל מאחר שהאתגר הפטרייתי של זרעי בוטנים הוא השלב המגביל של ההליך ולא ניתוחי UPLC.
השיטה המוצעת רגישה מספיק עם מגבלת כימות של 2 pg עבור אפלטוקסין B1 (איור 5D). הטוהר הגבוה של התמציות מאפשר כימות חד-משמעי של אפלטוקסינים כפי שניתן לראות ב-UPLC (איור 5E) של תמצית מטוהרת של זרעים שנקטפו משדה עם מין ארכיס פראי. שיטה29 שפורסמה קודם לכן אינה מסוגלת להשיג טוהר משביע רצון עבור זרעי בוטנים מאותגרי פטריות (איור 5F) בהשוואה לשיטה המוצעת (איור 5G). מאיור 5F ברור שלא ניתן לזהות ולכמת באופן מהימן אפלטוקסינים B2, G1 ו-G2 בשל נוכחותם של ריכוזים גבוהים של זיהומים מפריעים, שרבים מהם, המדוללים לאחר אפלטוקסינים, הם פיטואלקסינים סטילבנואידים ומטבוליטים פטרייתיים. לעומת זאת, איור 5G מדגים את היעילות הגבוהה של עמודת ג'ל מגנזיום סיליקה בהסרת זיהומים ממקטע אפלטוקסין. כרומטוגרמה כחולה מציגה זיהומים מפריעים שנשטפים מהעמוד עם 1 מ"ל של תערובת מתנול-מים (90:10); כרומטוגרמה שחורה מראה פסגות לא מוסתרות של אפלטוקסינים M1 ו- B1. כרומטוגרמה זו מייצגת תמצית של זרע בר מאותגר. רמת אפלטוקסין B1 היא 48 ננוגרם/גרם.
כימות של פיטואלקסינים בוטנים הוא תוספת חשובה לאנליזות של אפלטוקסינים באותו זרע, אשר עשוי להיות זרע טבעי משדה או זרע מאותגר פטריות. איור 5H מראה כרומטוגרמה טיפוסית של סטילבנואידים הגנתי בוטנים מזרע מאותגר. הפרדת התרכובות מושגת באמצעות אותה עמודה אנליטית המשמשת לניתוחי אפלטוקסין. העמודה והתנאים הכרומטוגרפיים שנבחרו מספקים הפרדה משביעת רצון של הפסגות ומאפשרים כימות אמין של הסטילבנואידים. הערכת הקשר בין אפלטוקסין-פיטואלכסין בזרעים מאותגרים נמצאת מחוץ לתחום מצגת זו והשיטה מוצעת כאן ככלי מחקר פוטנציאלי, הנמצא בשימוש במעבדת המחברים מזה מספר שנים והוכח כשימושי.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig6.jpg"> איור 6: מבנים של אפלטוקסינים עיקריים ופיטוקסינים בוטנים שמקורם בסטילבן. (A) מבנים של אפלטוקסינים עיקריים: 1, B1; 2, ב2; 3, ז1; 4, ז2. (B) מבנים של פיטואלכסין בוטנים עיקריים שמקורם בסטילבן: 6, רסברטרול; 7, ארכידין-1; 8, ארכידין-2; 9, ארכידין-3; 10, IPD (3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbene); 11, SB-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">רמת ספייקא (נג/ז)</td>
			<td colspan="4">אפלטוקסינים</td>
		</tr><tr><td>ב1</td>
			<td>ב2</td>
			<td>ז1</td>
			<td>ז2</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>85.87 (0.97)</td>
			<td>82.33 (0.67)</td>
			<td>86.63 (2.89)</td>
			<td>84.01 (0.86)</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>91.43 (2.76)</td>
			<td>87.32 (0.47)</td>
			<td>88.08 (2.08)</td>
			<td>87.73 (0.77)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>81.21 (3.16)</td>
			<td>85.33 (1.98)</td>
			<td>81.76 (4.66)</td>
			<td>88.46 (3.24)</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: שחזור אפלטוקסינים מזרעי בוטנים באמצעות עמודת פלורסיל ו-1.2 מ"ל של תערובת האבוטוקסין שבר אלוטיון. [ממוצע (SD), %; n = 5]. דגימות טחונות נטולות אפלטוקסין (50 גרם) של זן בוטנים 06 גרם של ג'ורג'יה הוקפצו באופן שווה בעזרת מזרק מיקרו עם תמיסת מלאי אפלטוקסין ברמה של 50, 5 או 1 ננוגרם/גרם, והושארו בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות. רמות ספייק ניתנות עבור אפלטוקסינים B1 ו- G1; עבור aflatoxins B2 ו- G2 יש להשתמש במקדם הכפל של 0.33.

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Quantification of Aflatoxins and Phytoalexins in Peanut Seeds to Identify Genetic Resistance Against Aspergillus  at JoVE.com

אנו מדגימים שיטת תפוקה בינונית לכימות של אפלטוקסינים ופיטואלכסינים סטילבנואידים בזרעי בוטנים בודדים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים מעולים. שיטה זו פותחה במיוחד לניתוח של מיני ארכיס בר המאותגרים על ידי מיני אספרגילוס אפלטוקסיגניים.

Aflatoxins are highly carcinogenic secondary metabolites of some fungal species, particularly Aspergillus flavus. Aflatoxins often contaminate ...

מטרת המחקר הייתה לפתח שיטה לכימות של אפלטוקסינים ופיטוקסינים הגנתיים באלפי זרעי בוטנים לחקר חיידקי ארכיס בר, לזהות מינים עמידים לאספרגילוס, ולקבוע ולאפיין מקורות חדשים של עמידות גנטית לפתוגן פטרייתי זה. קבוצת המחקר שלנו מצאה כי הגישה המבטיחה ביותר לזיהוי חיידקי בוטנים שאינם צוברים אפלטוקסין היא לבצע ניתוח הוליסטי של כל זרע בודד, כולל פרופילי השעתוק שלו, גנומיקה, פיטוקסינים ומיקוטוקסינים. פיתחנו פרוטוקולים לניתוח זרעי בוטנים פראיים ומתורבתים, כלומר שימוש ב-1/4 מזרע בודד לאפיון כימי, פיתוח שיטות בעלות תפוקה גבוהה לאתגר זרעים יעיל, מיצוי וכימות מדויק של פיטואלקסינים בדגימות זרעי בוטנים.גילינו פיטואלכסין בוטנים רבים ופיתחנו שיטות יעילות וזולות לניתוח אפלטוקסין, כמו גם להקרנת חיידקי בוטנים עם הצטברות אפלטוקסין מופחתת או ללא הצטברות. השיטות כוללות גנוטיפ וקביעת כדאיות זרעים.

non-destructive-spe-uplc-based-quantification-aflatoxins-stilbenoid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds

591 Views.  U.S. Department of Agriculture. מטרת המחקר הייתה לפתח שיטה לכימות של אפלטוקסינים ופיטוקסינים הגנתיים באלפי זרעי בוטנים לחקר חיידקי ארכיס בר, לזהות מינים עמידים לאספרגילוס, ולקבוע ולאפיין מקורות חדשים של עמידות גנטית לפתוגן פטרייתי זה. קבוצת המחקר שלנו מצאה כי הגישה המבטיחה ביותר לזיהוי חיידקי בוטנים שא...

Video: Author Spotlight: Quantification of aflatoxins and phytoalexins in peanut seeds to identify genetic resistance against Aspergillus 

Aflatoxins are highly carcinogenic secondary metabolites of some fungal species, particularly Aspergillus flavus. Aflatoxins often contaminate economically important agricultural commodities, including peanuts, posing a high risk to human and animal health. Due to the narrow genetic base, peanut cultivars demonstrate limited resistance to fungal pathogens. Therefore, numerous wild peanut species with tolerance to Aspergillus have received substantial consideration by scientists as sources of disease resistance.
Exploring plant germplasm for resistance to aflatoxins is difficult since aflatoxin accumulation does not follow a normal distribution, which dictates the need for the analyses of thousands of single peanut seeds. Sufficiently hydrated peanut (Arachis spp.) seeds, when infected by Aspergillus species, are capable of producing biologically active stilbenes&#160;(stilbenoids) that are considered defensive phytoalexins. Peanut stilbenes inhibit fungal development and aflatoxin production. Therefore, it is crucial to analyze the same seeds for peanut stilbenoids to explain the nature of seed resistance/susceptibility to the Aspergillus invasion. None of the published methods offer single-seed analyses for aflatoxins and/or stilbene phytoalexins.
We attempted to fulfill the demand for such a method that is environment-friendly, uses inexpensive consumables, and is sensitive and selective. In addition, the method is non-destructive since it uses only half of the seed and leaves the other half containing the embryonic axis intact. Such a technique allows germination and growth of the peanut plant to full maturity from the same seed used for the aflatoxin and stilbenoid analysis. The integrated part of this method, the manual challenging of the seeds with Aspergillus, is a limiting step that requires more time and labor compared to other steps in the method. The method has been used for the exploration of wild Arachis germplasm to identify species resistant to Aspergillus and to determine and characterize novel sources of genetic resistance to this fungal pathogen.

We demonstrate a medium-throughput method for quantification of aflatoxins and stilbenoid phytoalexins in single peanut seeds using ultra performance liquid chromatography. This method was specifically developed for the analyses of wild Arachis species challenged by the aflatoxigenic Aspergillus species.

Preparing Aflatoxigenic Aspergillus flavus Spores and Inoculating Peanut Seeds for Challenging Studies

After growing aflatoxigenic Aspergillus flavus NRRL 3357 on a potato dextrose auger slant for six days at 30 degrees Celsius, elute the fungal spores from the test tube with 10 milliliters of water containing Tween 20. Vortex the test tube for 20 seconds. Filter the fungal spore suspension through glass wool placed in a funnel, and use the vortexed filtrate for dilution.Dilute a 100 microliter aliquot of the filtered suspension with 9.9 milliliters of water. After vortexing, count the spores with a hemocytometer. Using the onscreen formula, calculate the volume of water needed to dilute one volume of the original suspension from the slant to 1000 spores per microliter.Add one volume of the original suspension to the calculated amount of water. Next, gently crack the peanut pods and remove the hulls. Place the seeds in a sterile beaker.Add 0.05%hydrogen peroxide solution until the beaker is 70%full, allowing seeds to imbibe water for three hours. Decant the hydrogen peroxide solution from the seeds and add approximately three times the amount of 80%ethanol water mixture to cover the seeds. Incubate for one minute.Then rinse the seeds twice with equal volumes of sterile distilled water. Add the fivefold volume of 3%hydrogen peroxide solution to the beaker and allow it to stand for five minutes. After decanting the hydrogen peroxide solution, rinse the seeds twice with equal volumes of sterile water.Place a 90 millimeter diameter filter paper into the lid and moisten the paper with one milliliter of sterile water. Place the lid on the dish. Place the seeds on a sterile paper towel.Using forceps, remove the seed's skin. Place the de-skinned seeds promptly in the Petri dish to avoid dehydration. Cut about one third of the seed containing the embryonic axis.Split the seed into cotyledons, and using a sharp drill bit, drill approximately 1.5 to two millimeter deep into the middle of the outer side of each cotyledon. Place four to six drilled pieces of the seeds on a 1.5%auger dish. Using a 10 microliter pipette, add two microliters of the spore suspension into the drilled cavity of each half cotyledon piece.After covering the dish with a lid, incubate at 30 degrees Celsius without light for 72 hours.

הכנת נבגי אספרגילוס פלבוס אפלטוקסיגניים וחיסון זרעי בוטנים למחקרים מאתגרים

Sampling, Preparation, and Quantification of Aflatoxins and Phytoalexins in Peanut Seeds Following Aflatoxigenic Aspergillus flavus Spore Inoculations

After incubation of peanut seeds, following Aspergillus flavus spore inoculation, use forceps to remove the seed pieces from the agar. Place the seed pieces into labeled seven milliliter bead vials containing 13 zirconium ceramic beads. For the extraction of phytoalexins and aflatoxins, depending on the seed size, add two or four milliliters of a methanol water mixture to the bead vial and pulverize at 5.5 meters per second for 45 seconds.Then centrifuge at 1, 860 x g for three minutes, and collect the supernatant in a fresh vial. For aflatoxins analysis, using a glass rod, cut at a 90 degree angle, insert a polyethylene porous frit into a 1.5 milliliter polypropylene column. With a custom made scoop, add 50 milligrams of magnesium silica gel into the column.Cap the column with an identical frit and push it down with a glass rod. Add 0.5 milliliters of supernatant into the custom packed mini column and allow the extract to drain by gravity into a four milliliter glass vial. Add one milliliter of methanol water mixture into the column to wash out impurities by gravity into the same vial.After discarding the combined eluates from the vial, add 1.2 milliliters of acetone acetyl nitrile water, 88%formic acid mixture into the column to elute the aflatoxin fraction into a clean glass vial. Evaporates solvent from the vial in a stream of nitrogen in a heating block at 45 degrees Celsius. After evaporation, cap the vial and cool it in crushed dice for one minute.Place the custom made Pasteur pipette filters in disposable test tubes and put them on ice to minimize evaporation upon filtration. Dissolve the dry residue in precisely measure 0.25 to 1.0 milliliter of methanol water mixture. After vortexing, transfer an aliquot of 0.2 milliliters into the filter.Use nitrogen gas to expedite the filtration into a 400 microliter autosampler vial. Place the vial in the UPLC autosampler and set the injection volume to 0.1 to 3.0 microliters. For phytoalexin, transfer 200 microliters of supernatant from the seven milliliter centrifuge vial into a Pasteur pipette filter.After filtration, place a matching cap with polytetrafluoroethylene septum on the vial. For separations of aflatoxins, implement a gradient using water, methanol, and acetyl nitrile with specific percentage compositions and runtimes. Set the flow rate to 0.45 milliliters per minute and runtime to 9.5 minutes.In the system column heater, set the column temperature to 40 degrees Celsius. To quantify aflatoxins, set excitation and emission wavelengths to 362 and 440 nanometers, respectively. Then using the calibration curve method and UPCL software manual, perform the analysis to determine aflatoxin concentrations in the test samples.For the separation of stilbenoids, use a gradient consisting of water, methanol, and 88%formic acid with specific percentage conditions and times. Set the flow rate to 0.5 milliliters per minute and runtime to 12 minutes. Using the calibration curve method, determine the concentrations of stilbenoids and compare the peak areas of the test sample with pure, authentic standards.The UPLC based aflatoxin quantification method achieve sensitive quantification of aflatoxin B1 with a limit of two picograms per injection. The purified extract of seeds harvested from a wild Areca species showed unambiguous quantification of aflatoxins. The magnesium silica gel column approach effectively removes impurities from the aflatoxin fraction and demonstrates high efficiency of quantification in contrast to previous methods.In addition, this method also aids in the quantitation of peanut phytoalexins.