Bu çalışma, USDA-ARS CRIS projesi 6044-42000-011-00D ve CRIS projesi 6044-21000-005-000-D tarafından mali destek almıştır. Mini sütun tutma rafını yaptığı için Dan Todd'a teşekkür ederiz. Bu makalede ticari adlardan veya ticari ürünlerden bahsedilmesi, yalnızca belirli bilgiler sağlama amaçlıdır ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onay verildiği anlamına gelmez.

1. Mantar mücadelesi için tohumların hazırlanması
<ol><li>Aflatoksijenik Aspergillus flavus NRRL 3357'yi bir test tüpünde 30 ° C'de 6 gün boyunca eğimli bir Patates Dekstroz Agar (PDA) üzerinde inkübe edin. Tween 20 (1 L damıtılmış steril suda 100 μL Tween) ile 10 mL su ile test tüpünden mantar sporlarını hasat edin, bir huniye yerleştirilmiş cam yününden süzün ve sporları kullanım kılavuzuna bakarak bir hemositometre ile sayın.</li>
	<li>Spor süspansiyonunu steril su ile 1.000 spor / μL konsantrasyonuna seyreltin. Konsantrasyonu bir hemositometre ile onaylayın. NOT: Spor süspansiyonunu zorlu deneylerden en geç 2 saat önce hazırlayın.</li>
	<li>Fıstık kabuklarını yavaşça kırın ve kabuklarını çıkarın. Tohumları, tohum hacmi beher hacminin 1 / 5'ini geçmeyecek şekilde steril bir behere yerleştirin, beher hacminin yaklaşık% 70'ine% 0.05 hidrojen peroksit çözeltisi ekleyin ve tohumların 3 saat boyunca su emmesine izin verin.</li>
	<li>Hidrojen peroksit çözeltisini tohumlardan boşaltın ve tohumları kaplamak için behere yaklaşık 3 kat daha fazla %80 etanol-su karışımı (h/h) ekleyin. 1 dakika bekletin ve ardından tohumları 2 kez eşit hacimde steril damıtılmış su ile durulayın.</li>
	<li>Etanol ile sterilize edilmiş tohumlarla behere 5 kat hacimde% 3 hidrojen peroksit ekleyin ve 5 dakika bekletin, ardından sıvıyı boşaltın ve tohumları eşit hacimlerde steril su ile iki kez durulayın (Şekil 2A).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig2.jpg"> Şekil 2: Aflatoksin ve fitoaleksin fraksiyonlarının aşılanması, inkübasyonu ve ekstraksiyonu için yer fıstığı tohumlarının hazırlanması. (A) Emilmiş tohumların %3 hidrojen peroksit ile sterilize edilmesi; (B) tohumlardan testa (deri) çıkarmak; (C) embriyonik eksen parçasının kesilmesi; (D,E) bir matkap ucu ile yarım kotiledonda delme boşluğu; (F) delinmiş tohum parçalarını agar üzerine yerleştirmek; (G) delinmiş boşluğa mantar sporları uygulamak. (H) Kuluçka sonrası tohumlu petri kabı; (I) inkübe edilmiş tek tohumların (kontrol numunelerinin fotoğrafı) güçlendirilmiş boncuk tüplerine yerleştirilmesi; (J) ölçülen hacimde ekstraksiyon çözücüsünün eklenmesi; (K) numunelerin bir boncuk parçalayıcıda toz haline getirilmesi; (L) toz haline getirilmiş bulamacın santrifüjlenmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="6"><li>Tohumları steril bir kağıt havlu üzerine koyun, forseps ile tohum testasını çıkarın ve embriyonik ekseni içeren tohumun yaklaşık 1/3'ünü neşter ile kesin (Şekil 2B,C).</li>
	<li>Tohumun bu kısmını atın veya büyüme ortamı olan bir test tüpünde bir bitki yetiştirmek için kullanın (Şekil 1B, E).</li>
	<li>Tohumun kalan kısmını iki kotiledona bölün, bir Petri kabına koyun, tohum parçalarını nemli steril filtre kağıdı ile örtün, dehidrasyonu önlemek için kapağı değiştirin ve hemen aşılama adımına geçin.</li>
	<li>Zorlu deneyleri gerçekleştirmeden önce, 100 x 15 mm'lik tabaklara 26 mL %1,5 steril agar suya dökerek tohum kuluçka ortamı ile yeterli sayıda Petri kabı hazırlayın ve gece boyunca katılaşmalarına izin verin.</li>
	<li>Kalan her bir kotiledonun dış tarafının ortasında, tohumu 1,6-2,34 mm çapında steril keskin bir matkap ucu ile manuel olarak delerek 1,5-2 mm derinliğinde bir boşluk açın. Bir boşluk oluşturmak ~ 2-5 s sürer (Şekil 2D, E).</li>
	<li>4 ila 6 "delinmiş" tohum parçasını agar ile bir Petri kabına yerleştirin ve 10 μL'lik bir pipetleyici ile her yarım kotiledon parçasının delinmiş boşluğuna 2 μL 1.000 spor/μL süspansiyon uygulayın. Spor süspansiyonu yerine, kontrol tohumlarına steril su uygulayın (Şekil 2F,G).</li>
	<li>Tüm Petri kaplarını kapaklarla kapatın ve 30 °C'de ışıksız olarak 72 saat inkübe edin.</li>
</ol>2. Kuluçkaya yatırılan tohum parçalarından numune alınması ve aflatoksin ve fitoaleksin analizleri için hazırlanması
<ol><li>Tohum parçalarını forseps ile agardan çıkararak ve her birini 13 zirkonyum seramik boncuklu (12 tanesi 2,8 mm çapında ve 1 tanesi 6,5 mm çapında) etiketli 7 mL'lik boncuk şişelerine yerleştirerek 72 saatte toplayın (Şekil 2H,I). NOT: Bu noktada, hemen işlenmezse, şişeler -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirilebilir ve daha fazla işlemden önce 2 aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Fitoaleksinler ve aflatoksinler aynı tohum ekstraktında belirlenir. Ekstraksiyon için, görsel tohum boyutuna (küçük, orta veya büyük) bağlı olarak, boncuk şişelerine 2 veya 4 mL hassas bir şekilde ölçülen metanol-su karışımı (90:10, v/v) ekleyin ve 45 saniye boyunca 5,5 m/sn'de toz haline getirin. Toz haline getirilmiş tohumlu şişeleri bir santrifüje koyun ve 3 dakika boyunca 1.860 × g'da santrifüjleyin (Şekil 2J - L). NOT: Aşağıdaki önemli17,22 stilbenoid türevleri belirlenmiştir (tümü trans-konfigürasyonda): resveratrol, araşidin-1, araşidin-2, araşidin-3, 3'-izopentadienil-3,5,4'-trihidroksistilben (IPD) ve SB-1.</li>
	<li>Aflatoksin analizleri için, zorlu deneyleri çalıştırmadan önce, aşağıdaki gibi yeterli sayıda temizleme sütunu hazırlayın. Eşleşen bir polietilen gözenekli (20 μL) frit, 90° 'lik bir açıyla kesilmiş bir cam çubuk yardımıyla 1,5 mL'lik bir polipropilen kolona yerleştirin. 50 mg magnezyum silika jeli (100-200 göz) özel yapım bir kepçe ile sütuna yerleştirin ve sütunu bir cam çubukla aşağı iterek aynı frit ile kapatın (Şekil 3A - E). NOT: Bu miktarda magnezyum silika jel 75 μL hacim kaplar ve adsorban tabakasının yüksekliği 3 mm'dir.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig3.jpg"> Şekil 3: Temizleme kolonlarının ve filtrelerin hazırlanması. (A,B) Gözenekli bir fritin namluya yerleştirilmesi; (C, D) magnezyum silika jel ile doldurma varil; (E) adsorbanı paketlemek ve üst gözenekli bir fritin namluya yerleştirilmesi. (F) Bir Pasteur pipetinin üzerine 11,5 mm çapında bir cam elyaf daire yerleştirin. (G,H) Dairenin merkezini plastik veya tahta bir çubukla Pasteur pipet haznesinin dibine kadar itin ve cam elyafını sıkıca sıkıştırın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="4"><li>Bu noktada, Şekil 3F - H'de gösterildiği gibi eşleşen sayıda ısmarlama filtre hazırlayın.</li>
	<li>Aflatoksin analizleri için, süpernatantın 0,5 mL'ye kadar alikotunu hassas bir şekilde ölçün (adım 2.2'de açıklandığı gibi elde edilir), bunu özel olarak paketlenmiş mini sütuna aktarın ve ekstraktın yerçekimi ile 4 mL'lik bir cam şişeye akmasına izin verin. 1.0 mL metanol-su (90:10, v/v) karışımını kolona aktarın ve yerçekimi ile safsızlıkları aynı 4 mL şişeye yıkayın (Şekil 4A).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig4.jpg"> Şekil 4: Tohum ekstraktlarının saflaştırılması ve UPLC analizleri için hazırlanması. (A) Paketlenmiş sütunlara sahip raf. (B) Temizleme kolonlarından ayrıştırılmış saflaştırılmış ekstrakt ile altı adet 4 mL'lik şişedenN2 gazı ile buharlaştırıcı çözücü. (C) 4 mL'lik şişelere enjeksiyon çözücüsü (MeOH-H2O 9: 1, v / v) eklenmeden önce ve sonra buzlu köpük kaplarda (1 ve 2) şişelerin ve filtrelerin sıfırın altındaki bir sıcaklığa getirilmesi. (D) Soğutulmuş ekstraktın 4 mL'lik bir şişeden 400 μL'lik bir otomatik örnekleyici şişesine filtrelenmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="6"><li>Kombine elüatları atın. Aflatoksin fraksiyonunu kolondan yerçekimi ile 1.2 mL aseton-asetonitril-su-%88 formik asit (65:31:3.5:0.5, h/h) karışımı ile 4 mL'lik temiz bir cam şişeye boşaltın (Şekil 4A).</li>
	<li>Alternatif olarak, 2.0 mL asetonitril-su-%88 formik asit (96:3,5:0,5, h/h) karışımı ile kolondan aflatoksinleri elüte edin ve 2 μL'ye kadar elüatın bir alikotunu doğrudan ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) sistemine enjekte edin (çözücününN2 ile buharlaşması olmadan). NOT: Bu durumda, aflatoksinler için 10 kata kadar daha düşük kantitasyon limiti bekleyin; Vakaların çoğunda, bu tür bir hassasiyet düşüşü kabul edilebilir, çünkü zorlu tohumdaki aflatoksin konsantrasyonları genellikle yüksektir.</li>
	<li>Çözücüyü, 45 ° C'de ısıtılmış bir bloktaN2'lik bir akışta şişelerden çıkarın. Şişeyi kapatın ve bir sonraki adımda eklenen çözücünün buharlaşmasını en aza indirmek için 30-45 saniye boyunca kırılmış buz içeren bir kaba koyun. Özel yapım filtreleri tek kullanımlık test tüplerine yerleştirin ve filtrasyon sırasında solventin buharlaşmasını en aza indirmek için tüpleri başka bir kaptaki buza yerleştirin (Şekil 4B,C).</li>
	<li>Çözücünün buharlaşmasından sonra, kuru kalıntıyı hassas bir şekilde ölçülen 0.25-1.0 mL metanol-su karışımında (90:10, v/v) çözün ve 1-2 saniye boyunca girdap yapın. Saflaştırılmış ekstraktlar içeren şişeleri UPLC otomatik numune alma cihazına yerleştirin ve UPLC sistemine 0.1 ila 3.0 μL enjekte edin (Şekil 5A,B). NOT: Girdaplamadan sonraki çözeltinin bazı asılı parçacıklara sahip olduğundan şüpheleniliyorsa, çözeltiyi soğutulmuş filtreden süzün (Şekil 4D).</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig5.jpg"> Şekil 5: Saflaştırılmış ekstraktların UPLC analizlerinin süreci ve sonuçları. (A) Saflaştırılmış numune ekstraktlarının bulunduğu bir rafın UPLC otomatik numune alma cihazına yerleştirilmesi. (B) Enstrümantal analizlerin yapılması, verilerin elde edilmesi ve sonuçların yorumlanması. (C) Dört ana aflatoksinin UPLC'si; İlgilenilen başlıca zirveler olan aflatoksinler B1 ve B2 sırasıyla 0.04 ve 0.004 ng'yi temsil eder. (D) Aflatoksinler B1 ve B2'nin UPLC'si, tepe 2, 2 pg seviyesinde (8 μL'lik bir akış hücresi ile) aflatoksin B1'i temsil eder. (E) Yabani bir Arachis türü ile yerel bir fıstık tarlasından hasat edilen bir tohumun saflaştırılmış ekstraktının UPLC'si. (F) Bazik bir alüminyum oksit mini kolon ile saflaştırılmış, zorlanmış bir fıstık tohumunun ekstraktının UPLC'si. (G) Bir Florisil sütunu ile saflaştırılmış meydan okunmuş fıstık tohumu ekstraktının UPLC'si; mavi kromatogram, kolondan 1 mL metanol-su (90:10 v/v) karışımı ile yıkanan safsızlıkları sunar; siyah kromatogram, aflatoksinler M1 ve B1'in zirvelerini gösterir. Aflatoksin B1 seviyesi 48 ng / g'dır. (H) Zorlu bir tohumdan elde edilen yer fıstığı stilbenoidlerinin tipik bir kromatogramı; kısaltma: IPD = 3'-izopentadienil-3,5,4'-trihidroksistilben. Not: Tohum ekstraktlarındaki tüm stilbenoidler trans-konfigürasyondadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<ol start="10"><li>Fitoaleksin analizleri için, her bir boncuk şişesinden 200 μL süpernatanı yukarıdaki Pasteur pipet filtresine aktarın. 2 μL'lik bir UPLC otomatik numune alma cihazı şişesine filtrasyonu hızlandırmak için sıkıştırılmış bir nitrojen tankından N400 gazı kullanın ve şişeyi bir PTFE septumlu uygun bir kapakla kapatın (Şekil 4D).</li>
</ol>3. Aflatoksin analizleri
<ol><li>Tohum ekstraktlarındaki aflatoksinlerin ayrılması için, bir otomatik numune alma cihazı, bir kuaterner pompa, bir floresan dedektörü, bir UPLC BEH C18 3,0 mm x 100 mm, eşleşen bir ön kolona sahip 1,7 μm kolon ve orijinal uzunluğunun %25'ine kadar kesilmiş 0,25 iç çapa sahip standart örme PTFE bobine sahip bir kolon sonrası fotokimyasal reaktör (PHRED) ile donatılmış bir UPLC sistemi kullanın. NOT: Yazarlar tarafından kullanılan UPLC cihazı ve ilgili ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.</li>
	<li>Aşağıdaki gradyanda su (A), metanol (B) ve asetonitril (C) kullanın: başlangıç koşulları, %62.7 A, %24 B, %13.3 C, doğrusal olarak 3.75 dakikada %30 A, %45 B, %25 C olarak değiştirildi, 3.751 dakikada %0 A, %64.4 B, %35.6 C olarak değiştirildi, 3.249 dakika izokratik tutuldu, daha sonra 0.01 dakika içinde başlangıç koşullarına değiştirildi ve bir sonraki enjeksiyondan önce 2.499 dakika izokratik tutuldu. Akış hızını 0,45 mL/dk'ya ve çalışma süresini 9,5 dk'ya ayarlayın. Sistem kolon ısıtıcısında kolonu 40 °C'de tutun. Aflatoksinler B1, B2, G 1, G2 ve M1 miktar tayini için uyarma ve emisyon dalga boyları olarak sırasıyla 362 nm ve 440 nm kullanın. Majör aflatoksinlerin yapıları Şekil 6A'da gösterilmiştir. NOT: Deney koşulları altında, A. flavus NRRL 3357 tarafından yalnızca aflatoksinler B1 ve B2'nin üretilmesi beklenmektedir; tohum mücadelesi için bir A. parasiticus suşu kullanılırsa, aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2 üretimi beklenir.</li>
	<li>Yazılım kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi ilgili otantik standartların (kalibrasyon eğrisi) tepe alanlarına atıfta bulunarak aflatoksin konsantrasyonlarını belirleyin. NOT: UPLC prosedürü, floresan dedektörü için yüksek hassasiyet ayarlarında temel gürültü gösterdiğinden, aflatoksinler için Algılama Limiti (LOD) ve Kantitasyon Limiti (LOQ), LOD için 3:1 ve LOQ için 10:1 olan yaygın olarak kabul edilen Sinyal-Gürültü oranı kullanılarak değerlendirilir. Bölüm 2 ve 3'te açıklanan yer fıstığı tohumu analizi için rutin deney düzeneğinde, aflatoksinler G1 ve B1 için kantitasyon sınırlarının, aflatoksinler G2 ve B2 için sırasıyla 0,8 ve 0,08 ng/g'ye eşit veya daha az olması beklenmektedir.</li>
</ol>4. Stilbenoid fitoaleksin analizleri
<ol><li>Stilbenoidlerin ayrılması için, aşağıdaki gradyanda su (A), metanol (B) ve% 88 formik asit (C) kullanın: başlangıç koşulları,% 53 A,% 42 B,% 5 C,% 35 A,% 60 B,% 5 C olarak değiştirildi 2.0 dakikada, 4 dakika boyunca izokratik tutuldu, 0.5 dakikada% 0 A,% 95 B,% 5 C olarak değiştirildi, 2.5 dakika boyunca izokratik tutuldu, Daha sonra 0.1 dakika içinde başlangıç koşullarına değiştirildi ve bir sonraki enjeksiyondan önce 2.9 dakika boyunca izokratik tutuldu. Akış hızını 0,5 mL/dk'ya ve çalışma süresini 12,0 dk'ya ayarlayın.</li>
	<li>Stilbenoidlerin konsantrasyonlarını, ilgili otantik standartların tepe alanlarına (kalibrasyon eğrisi) ve/veya yazılım kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi yayınlanmış molar sönme katsayılarına atıfta bulunarak belirleyin. Majör stilben türevi fitoaleksinlerin yapıları Şekil 6B'de gösterilmiştir. NOT: Fitoaleksinlerin ayrılması, aynı sistem kullanılarak, ancak bir floresan dedektörü ve bir PHRED reaktörü olmadan gerçekleştirilir. Bunun yerine, yer fıstığı stilbenoidlerinin tespiti ve miktarının belirlenmesi için bir Diyot Dizi Dedektörü kullanılır. Majör stilbenoid fitoaleksinler için Kantitasyon Limiti (LOQ), stilbenoid konsantrasyonları aynı ekstrakttaki aflatoksin konsantrasyonlarını bazı büyüklük sıralarına göre aştığından pratik bir anlama sahip değildir; 3 günlük inkübasyondan sonra, stilbenoidler güvenilir bir şekilde ölçülür.</li>
</ol>

Yabani Yerfıstığı Türlerinin Aflatoksin Birikimine Direnç Açısından Değerlendirilmesi

<ol>
	<li>Janila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+breeding+for+introgression+of+fatty+acid+desaturase+mutant+alleles+(ahFAD2A+and+ahFAD2B)+enhances+oil+quality+in+high+and+low+oil+containing+peanut+genotypes.">Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2A and ahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes.</a> Plant Sci. 242, 203-213 (2016).</li><li>Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-linear+relationships+between+aflatoxin+B1+levels+and+the+biological+response+of+monkey+kidney+vero+cells.">Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells.</a> Toxins (Basel). 5 (8), 1447-1461 (2013).</li><li>American Association for Cancer Research: AACR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+chemicals+and+industrial+processes+associated+with+cancer+in+humans+based+on+human+and+animal+data:+IARC+Monographs+Volumes+1+to+20.">An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20.</a> Cancer Res. 40 (1), 1-12 (1980).</li><li>Turner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+epidemiology+of+chronic+aflatoxin+driven+impaired+child+growth.">The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth.</a> Scientifica. , 21 (2013).</li><li>Williams, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aflatoxicosis+in+developing+countries:+a+review+of+toxicology,+exposure,+potential+health+consequences,+and+interventions.">Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions.</a> Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).</li><li>van Egmond, H. P., Jonker, M. A., Abbas, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+regulations+on+aflatoxins.">Worldwide regulations on aflatoxins.</a> Aflatoxinandfood safety. , 77-93 (2005).</li><li>European Commission. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commission+Regulation+(EC)+1525/98.">Commission Regulation (EC) 1525/98.</a> Off. J. Eur. Comm. L. 201, 43-46 (1998).</li><li>Bressano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introgression+of+peanut+smut+resistance+from+landraces+to+elite+peanut+cultivars+(Arachis+hypogaea+L).">Introgression of peanut smut resistance from landraces to elite peanut cultivars (Arachis hypogaea L).</a> PLoS ONE. 14 (2), e0211920 (2019).</li><li>de Blas, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+smut+resistance+in+wild+Arachis+species+and+its+introgression+into+peanut+elite+lines.">Identification of smut resistance in wild Arachis species and its introgression into peanut elite lines.</a> Crop Sci. 59 (4), 1657-1665 (2019).</li><li>Mallikarjuna, N., Pande, S., Jadhav, D. R., Sastri, D. C., Rao, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introgression+of+disease+resistance+genes+from+Arachis+kempff-mercadoi+into+cultivated+groundnut.">Introgression of disease resistance genes from Arachis kempff-mercadoi into cultivated groundnut.</a> Plant Breeding. 123 (6), 573-576 (2004).</li><li>Moretzsohn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+peanut+(Arachis+hypogaea+L.)+and+its+wild+relatives+based+on+the+analysis+of+hypervariable+regions+of+the+genome.">Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome.</a> BMC Plant Biol. 4, 1-10 (2004).</li><li>Arias, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+to+screen+wild+peanut+species+for+aflatoxin+accumulation+and+genetic+fingerprinting.">New tools to screen wild peanut species for aflatoxin accumulation and genetic fingerprinting.</a> BMC Plant Biol. 18 (1), 170 (2018).</li><li>Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelationship+of+kernel+water+activity,+soil+temperature,+maturity,+and+phytoalexin+production+in+preharvest+aflatoxin+contamination+of+drought-stressed+peanuts.">Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts.</a> Mycopathologia. 105 (2), 117-128 (1989).</li><li>Paxton, J. D., Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+accumulation+of+legume+phytoalexins.">Biosynthesis and accumulation of legume phytoalexins.</a> Mycotoxins and phytoalexins. , 485-499 (1991).</li><li>Cole, R. J., Dorner, J. W., Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peanut+phytoalexins.">Peanut phytoalexins.</a> Mycotoxins and phytoalexins. , 501-509 (1991).</li><li>Subba Rao, P. V., Strange, R. N., Daniel, M., Purkayastha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry,+biology,+and+role+of+groundnut+phytoalexins+in+resistance+to+fungal+attack.">Chemistry, biology, and role of groundnut phytoalexins in resistance to fungal attack.</a> Handbook of phytoalexin metabolism and action. , 199-227 (1995).</li><li>Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelationship+of+phytoalexin+production+and+disease+resistance+in+selected+peanut+genotypes.">Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes.</a> J. Agric. Food. Chem. 55 (6), 2195-2200 (2007).</li><li>Paxton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytoalexins:+a+working+redefinition.">Phytoalexins: a working redefinition.</a> J. Phytopathol. 101, 106-109 (1981).</li><li>Mansfield, J. W., Bailey, J. A., Mansfield, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+phytoalexins+in+disease+resistance.">The role of phytoalexins in disease resistance.</a> Phytoalexins. , 153-288 (1982).</li><li>Strange, R. N., Ayers, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance:+the+role+of+the+hypersensitive+response+and+phytoalexins.">Resistance: the role of the hypersensitive response and phytoalexins.</a> Plant response to foliar pathogens. , 39-56 (1992).</li><li>Sobolev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+peanut+(Arachis+hypogaea)+phytoalexins+and+selected+natural+and+synthetic+stilbenoids.">Biological activity of peanut (Arachis hypogaea) phytoalexins and selected natural and synthetic stilbenoids.</a> J. Agric. Food Chem. 59 (5), 1673-1682 (2011).</li><li>Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+production+of+phytoalexins+by+peanut+(Arachis+hypogaea)+kernels+in+response+to+invasion+by+Aspergillus+Species.">Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus Species.</a> J. Agric. Food Chem. 56 (6), 1949-1954 (2008).</li><li>Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+stilbenoids+from+peanut+(Arachis+hypogaea)+seeds+challenged+by+an+Aspergillus+caelatus+strain.">New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain.</a> J. Agric. Food Chem. 57 (1), 62-68 (2009).</li><li>Trucksess, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+column+coupled+with+solution+fluorometry+or+liquid+chromatography+postcolumn+derivatization+for+determination+of+aflatoxins+in+corn,+peanuts,+and+peanut+butter:+collaborative+study.">Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study.</a> J. AOAC Int. 74 (1), 81-88 (1991).</li><li>Dorner, J. W., Blankenship, P. D., Cole, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+two+immunochemical+assays+in+the+analysis+of+peanuts+for+aflatoxin+at+37+field+laboratories.">Performance of two immunochemical assays in the analysis of peanuts for aflatoxin at 37 field laboratories.</a> J. AOAC Int. 76 (3), 637-643 (1993).</li><li>Stroka, J., Anklam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+column+cleanup+with+liquid+chromatography+using+post-column+bromination+for+determination+of+aflatoxins+in+peanut+butter,+pistachio+paste,+fig+paste,+and+paprika+powder:+collaborative+study.">Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder: collaborative study.</a> J. AOAC Int. 83 (2), 320-340 (2000).</li><li>Pal, A., Acharya, D., Saha, D., Roy, D., Dhar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sample+cleanup+during+immunoassay:+a+simple+method+for+rapid+detection+of+aflatoxin+B1+in+food+samples.">In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxin B1 in food samples.</a> J. Food Prot. 68 (10), 2169-2177 (2005).</li><li>Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid,+and+inexpensive+cleanup+method+for+quantitation+of+aflatoxins+in+important+agricultural+products+by+HPLC.">Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC.</a> J. Agric. Food Chem. 55 (6), 2136-2141 (2007).</li><li>Sobolev, V. S., Dorner, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleanup+procedure+for+determination+of+aflatoxins+in+major+agricultural+commodities+by+liquid+chromatography.">Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography.</a> J. AOAC Int. 85 (3), 642-645 (2002).</li><li>Levi, C. P., Borker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+green+coffee+for+potential+aflatoxin+contamination.">Survey of green coffee for potential aflatoxin contamination.</a> J. AOAC. 51 (3), 600-602 (1968).</li><li>Levi, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+study+on+a+method+for+detection+of+aflatoxins+B1+in+green+coffee+beans.">Collaborative study on a method for detection of aflatoxins B1 in green coffee beans.</a> J. AOAC. 52 (6), 1300-1303 (1969).</li><li>Scott, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note+on+analysis+of+aflatoxins+in+green+coffee.">Note on analysis of aflatoxins in green coffee.</a> J. AOAC. 51, 609 (1968).</li><li>Bicking, M. K. L., Kniseley, R. N., Svec, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled-column+system+for+quantitating+low+levels+of+aflatoxins.">Coupled-column system for quantitating low levels of aflatoxins.</a> J. AOAC. 66 (4), 905-908 (1983).</li><li>Kamimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+cleanup+method+for+analysis+of+aflatoxins+and+comparison+with+various+methods.">Simple, rapid cleanup method for analysis of aflatoxins and comparison with various methods.</a> J. AOAC. 68 (3), 458-461 (1985).</li><li>Hoogenboom, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+testing+of+extracts+from+aflatoxin-contaminated+peanut+meal,+following+chemical+decontamination.">Genotoxicity testing of extracts from aflatoxin-contaminated peanut meal, following chemical decontamination.</a> Food Addit. Contam. 18 (4), 329-341 (2001).</li><li>Castro, L., Vargas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+aflatoxins+B1,+B2,+G1+and+G2+in+maize+using+Florisil+clean+up+with+thin+layer+chromatography+and+visual+and+densitometric+Quantitation.">Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using Florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric Quantitation.</a> Cienc. Tecnol. Ailment. Campinas. 21, 115-122 (2001).</li><li>Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+Control+of+Aflatoxins+in+Peanut:+Method+to+Analyze+Mycotoxin+Production+and+Transgene+Expression+in+the+Peanut/Aspergillus+Pathosystem.">RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem.</a> J. Vis. Exp. (106), e53398 (2015).</li><li>Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+among+aflatoxin+test+results+on+runner+peanuts+harvested+from+small+field+plots.">Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots.</a> Peanut Sci. 31 (1), 59-63 (2004).</li></ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Önceki deneyimlerimize28 dayanarak, Aspergillus'a dirençli türleri tanımlamak ve bu fırsatçı mantara karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmek için yabani Arachis germplazm koleksiyonlarının araştırılması için uygun, basit, ucuz, çevre dostu, kimyasal bir prosedür geliştirdik. Bu yöntem, katı faz ekstraksiyonu (SPE) tekniği ile tohum ekstraktı saflaştırmasına ve Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC) ile aflatoksin miktar tayinine dayanır ve yeterince yüksek geri kazanım, hassasiyet ve doğruluk ile karakterize edilir. Önerilen "Florisil" yöntemi, aflatoksinleri28 güçlü ve seçici bir şekilde tutmak için Florisil'in (magnezyum silika jel) benzersiz özelliğine dayanan tek mini sütun temizleme prosedürünün bir modifikasyonudur. Orijinal yöntemde olduğu gibi, tohum örnekleri MeOH-H2O karışımı ile ekstrakte edildi, ancak yayınlanan 80:20 (h / v) ile karşılaştırıldığında 90:10 (h / v) gibi farklı bir oranda. Bu değişiklik, aynı aflatoksin geri kazanım hızı ile solventlerin temizleme kolonundan akış hızını 2,5 kata kadar artırmıştır. Bu 90:10 (h/h) metanol-su karışımı, 1 g substratta 5-50 ng aflatoksin konsantrasyonlarına eşdeğer başak seviyelerinde ekstraksiyon çözücüsüne eklenen aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2 standartlarının yaklaşık %100 geri kazanımını sağladı ve ayrıca çivili fıstık tohumu örneklerinden yeterince yüksek geri kazanımlar sağladı (Tablo 1).
Aflatoksinlerin Florisil adsorbandından sadece büyük hacimlerde aseton30, aseton-metanol31,32 ve aseton-su karışımları 33,34,35,36 ile ayrıştırılabileceği gösterilmiştir. Bu araştırma sırasında, asitleştirilmiş asetonitrilin, Florisil'den aflatoksinleri ayrıştırma kabiliyetinde asetona benzer şekilde davrandığını keşfettik. Bildiğimiz kadarıyla, asetonitrilin bu özelliği literatürde bildirilmemiştir. Bu özelliğin keşfi, saflaştırılmış ekstraktın doğrudan UPLC sistemine enjekte edilmesine izin verir, bu da hazırlama süresini önemli ölçüde azaltan solvent buharlaştırma adımını atlayabilir. Asetonitril aseton (aseton-asetonitril-su-%88 formik asit (65:31:3.5:0.5, h/v)) ile karıştırıldığında bile, saflaştırılmış elüatlardan suyun pürüzsüz, eksiksiz ve hızlı bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlayarak çözücü buharlaşma süresini önemli ölçüde azalttı. Asetonitrilin varlığı, iki ek yıkama çözücüsünün, metanol ve kloroform-metanol karışımının gerekli olduğu yayınlanmış bir yönteme kıyasla, Florisil kolonundaki safsızlıkları etkili bir şekilde gidermek için tek bir çözücü, metanol-su (90:10, v/h) karışımının kullanılmasına izin verdi. 28
Ortalama olarak, aflatoksinlerin elüsyonu için 1.2 mL kullanıldığında aflatoksin B1 standart geri kazanımı ~% 98 idi. 50 mg Florisil miktarı, 1.2 mL elüsyon çözücüsünün mini sütunu namlunun tepesine kadar doldurması ve aynı zamanda tatmin edici bir geri kazanım sağlaması için seçildi (Tablo 1). Bu yaklaşım, kolon varilinin yalnızca bir kez doldurulması gerektiğinden temizleme prosedürünü hızlandırır. Bu projenin ilk aşamalarında, nispeten büyük bir parçacık boyutuna, 100-200 ağa sahip ticari bir Florisil fraksiyonunun, adsorbanın sadece 3 mm'lik bir katmanını tutan küçük bir kolon için uygun olup olmayacağı açık değildi. Bu nedenle, ABD standart test elekleri 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 ve >400 mesh kullanılarak ticari 100-200 mesh ürününden elde edilen farklı Florisil fraksiyonlarını araştırdık. Tüm bu fraksiyonlar, tatmin edici bir geri kazanım ile tekrarlanabilir, neredeyse eşleşen sonuçlar sağladı. Daha küçük parçacık boyutu fraksiyonları, UV ışığı altında kolonda daha dar aflatoksin bantları göstermesine rağmen, bu fraksiyonlar, ticari 100-200 gözenekli üründen hiçbir şekilde üstün değildi. Ek olarak, 100-200 ağ fraksiyonu, tüm prosedür için en kısa elüsyon sürelerini (8-12 dakika) gösterdi.
Gradyan UPLC çözücü dağıtımı, aflatoksinlerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasına ve ayrıca polar olmayan safsızlıkların kolondan tamamen uzaklaştırılmasına izin verdi (Şekil 5G). Bu yaklaşım, kusursuz kolon çalışmasına ve yüzlerce numunenin analizinin tekrarlanabilir sonuçlarına yol açtı. Florisil sütunundan çıkarılan aflatoksinlerin kimliği daha önce açıklandığı gibi doğrulandı. 28 Burada kullanılan 3 mm çaplı analitik UPLC kolonu, aynı kimyanın 2,1 mm çapındaki kolonuna kıyasla daha yüksek konsantrasyonlarda aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2'nin daha yüksek seçicilik ve daha güvenilir bir şekilde ayrıldığını göstermiştir. Ayrıca, 3 mm'lik kolonun uzun ömürlülüğü (1.200'den fazla enjeksiyon), 2.1 mm'lik kolonun (800 enjeksiyona kadar) ömründen önemli ölçüde daha yüksekti. 3 mm'lik kolon daha yüksek bir mobil faz oranı (%40 daha fazla) gerektirse de, bu dezavantaj kolonun yukarıdaki avantajlarından daha iyi performans gösterdi.
Florisil mini kolonu, Aspergillus metabolitleri ile yoğun şekilde kontamine olmuş yer fıstığı tohumlarının ekstraktlarının saflaştırılması için etkiliydi (Şekil 5G); Bu tür tohumlar ayrıca mantar istilasına yanıt olarak tohumlar tarafından üretilen yüksek seviyelerde stilbenoid fitoaleksin içeriyordu. Tüm bu safsızlıklar, tohumlardaki aflatoksin konsantrasyonunu 106 kat22'ye kadar aşabilir ve bu da bu tohumları aflatoksin analizleri için zorlu nesneler haline getirir. Şekil 5G , aflatoksin tutma süreleri içinde kromatogramda enterferans yapan piklerin eksikliğini göstermektedir, bu da aflatoksin tespitini ve kantitasyonunu test edilen tüm seviyelerde tavizsiz hale getirmiştir (Tablo 1). Tablo 1'de görüldüğü gibi, yöntemin doğruluğu ve kesinliği, aynı zamanda aflatoksin tespiti için en kritik aralık olan test edilen 1.0-50.0 ng/g aralığında yeterince yüksekti. Çeşitli yabani fıstık genotipleri için farklı seviyelerdeki geri kazanımlar tekdüzeydi ve beş farklı ekstraksiyon için standart sapmalar esasen düşüktü.
Yöntem ayrıca, 10.000 ng / g'ın üzerinde toplam aflatoksinler içeren sıfırdan son derece yüksek seviyelere kadar doğal olarak kontamine olmuş yer fıstığı, pamuk, mısır ve pirinç tohumları üzerinde de test edildi. Mısır, pamuk tohumu ve pirinçten 5 ng/g düzeyinde aflatoksin B1, B2, G1 ve G2 geri kazanımı sırasıyla %76.1 ile %93.7, %77.1 ile %86.6 ve %90.5 ile %96.2 arasında değişmiştir. Pirinçten aflatoksinlerin en yüksek geri kazanımına, eluentin "saflığı", yani neredeyse herhangi bir safsızlık eksikliği eşlik etti. Ayrıca, pirinç, ortalama olarak 19 mg / tohum test edilen en küçük tek nesneyi temsil etti.
Bir Florisil sütunu kullanılarak tek bir fıstık tohumu için (bombardıman, tartma, ekstraksiyon, santrifüjleme ve saflaştırma dahil) toplam hazırlama süresi 20 dakikayı geçmedi. Florisil mini sütununun maliyeti, ticari temizleme sütunlarından >10 kat daha azdır. Yayınlanan prosedüre kıyasla daha düşük hacimlerde adsorban, çözücü ve nitrojen gazı kullanılmasından ek tasarruf sağlanır28. Mini kolon, çalışması için pompalama veya vakum cihazları gerektirmez ve belirsiz bir raf ömrüne sahiptir.
Bitki germplazmını aflatoksinlere direnç açısından araştırmak son derece zordur çünkü mikotoksin birikimi normal bir dağılım izlemez37,38; Bu olgunun üstesinden gelmek için tek tohumlarda çok sayıda aflatoksin analizine ihtiyaç vardır. Aflatoksin içeriğinin yanı sıra, kantitatif fitoaleksin bileşimi ile ilgili bilgiler, tek bir tohumdan elde edilebilecek (Şekil 1A) ve belirli bir bitkiye kadar izlenebilecek (Şekil 1E) geniş bir bilgi birikimi ışığında oldukça değerlidir. Yöntem, arazi ırkları, gelişmiş ıslah hatları ve elit fıstık çeşitleri dahil olmak üzere yüzlerce katılımı taramak için başarıyla kullanılmıştır. Yöntem, yer fıstığı ön ıslah ve ıslah araştırma programlarında kullanılmak üzere önerilmektedir ve mantar direnci için yer fıstığı genlerinin karakterizasyonuna yardımcı olabilir.

Yer fıstığı (Arachis hypogaea L.), dünyanın en önemli gıda ürünlerinden biridir. 100'den fazla ülkede yetiştirilmekte ve toplam üretimi 45 milyon tonu aşmaktadır1. Yer fıstığı, mısır ve pamuk tohumu gibi tarımsal ürünler genellikle aflatoksin üreten toprak kaynaklı mantarlar olan Aspergillus türleri tarafından istila edilir2. Bu ürünler, çevresel koşullar yüksek sıcaklıklar ve kuraklık ile karakterize edildiğinde, hasat öncesi aflatoksin kontaminasyonuna karşı özellikle hassastır. Aflatoksinler bilinen en güçlü kanserojenler arasındadır3. Dünyadaki tarımsal emtiaların dörtte birinikirletiyorlar 4 ve dünya nüfusunun yaklaşık yarısını kronik olarak aflatoksinlere maruz bırakıyorlar5. Yüksek kanserojenlikleri ve toksisiteleri nedeniyle, gıdalardaki aflatoksin varlığı, dünyanın çoğu ülkesinde pratik olarak kabul edilebilir en düşük sınırlarda düzenlenmektedir6.
Avrupa Birliği (AB), insani tüketim ürünlerindeki aflatoksin B1 için maksimum 2 ng/g ve toplam aflatoksinler (B1, B2, G1 ve G2) için maksimum 4 ng/g seviyesini yasalaştırmıştır7. Bu tür düşük limitler, aflatoksinlerle kontamine olmuş malları işleyen tarım ve gıda endüstrisi üzerinde önemli bir baskı oluşturmaktadır. Kontamine yer fıstığının aflatoksin izlemesi ve yeniden işlenmesi, aflatoksinlerin gıda zincirine girmesini önlemek için pasif ve maliyetli bir strateji olarak kabul edilebilir. Bu nedenle, yer fıstığı endüstrisinin tüm büyük segmentleri, genellikle mantar hastalıklarına karşı sınırlı direnç gösteren mevcut yer fıstığı çeşitlerinin aflatoksin kontaminasyonu nedeniyle muazzam kar kayıpları yaşamaktadır. Aflatoksin problemini çözmek için ileriye dönük bir yaklaşım, gen introgresyonu yoluyla mantara dirençli yer fıstığı çeşitlerinin elde edilmesi, yani genetik bilginin dirençli yabani yer fıstığı türlerinden elit çeşitlere aktarılmasıdır. Son yıllarda 8,9, yabani yer fıstığı türleri, genetik hastalık direncinin kaynakları olarak önemli ölçüde dikkate alınmıştır, çünkü kültür yer fıstığının dar genetik tabanı artık yer fıstığı bitkisine ihtiyaç duyulan direnç özelliklerini sağlayamamaktadır10,11. Yabani yer fıstığı türlerinden başarılı bir şekilde introgresyon, binlerce tek, küçük ve kıt tohumun analizini gerektirir (Şekil 1A) 12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig1.jpg"> Şekil 1: Tek tohum analizi akış şeması. (A) Farklı pazar tipi yer fıstığı çeşitlerinin karşılaştırmalı büyüklüğü ile yabani Arachis spp. (1) Virginia; (2) koşucu; (3) İspanyolca; (4) yabani Arachis spp. (B) Yabani Arachis spp. (levha A, tohum 4) üç bölüme ayrılmış, (5) embriyonik eksenli yarım tohum; Tohumun bu kısmı bir bitki yetiştirmek için kullanılır (E). (C) (6) ve (7) numaralı parçalar bir matkap ucu ile delinir ve (D) mantar sporları ile aşılanır. 30 °C'de 72 saat inkübasyondan sonra, tohum parçalarından biri (6) veya (7) aflatoksin ve fitoaleksin analizleri için, diğeri ise RNA/transkriptom dizilimi için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Mantar patojenlerine karşı yer fıstığı direnci, fitoaleksinler 13,14,15,16,17 ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Yer fıstığı fitoaleksinleri, ekzojen uyaranlara, özellikle mantar istilasına maruz kaldıktan sonra bitki dokularında biyosentezlenen ve biriken antimikrobiyal stilbenoidler ile temsil edilir 16,17,18. Mantar istilası bölgesinde yeterli konsantrasyonda fitoaleksin birikimi mantar büyümesini engeller ve bitki savunması için kritik öneme sahiptir 19,20,21. Fitoaleksinler inhibitör konsantrasyonlara(16,22) biriktiğinde patojen büyümeyi durdurur. Yer fıstığında aflatoksijenik mantarlara karşı savunma bileşikleri olarak stilbenoidlerin rolü, 30 yılı aşkın bir süre önce saha deneylerindedeğerlendirildi 13. Bu deneyler, yer fıstığı stilbenoidlerinin hasat öncesi aflatoksin kontaminasyonunda çok önemli bir direnç faktörü olduğu hipotezini açıkça destekledi. Bu tür kanıtlar, stilbenlerin tarlada zarar görmüş yer fıstığında doğal olarak üretildiği gerçeğine dayanmaktadır; stilbenler, aflatoksijenik mantarlara karşı kayda değer biyolojik aktivite gösterir; Tohumlardaki aflatoksin kontaminasyonu, yalnızca yer fıstığı kuraklığa bağlı tohum dehidrasyonu nedeniyle fitoaleksin sentezi kapasitesini kaybettiğinde tespit edildi. Başka bir saha deneyi seti, fitoaleksin üretimi ile tarımsal açıdan önemli yer fıstığı hastalıklarına karşı yer fıstığı genotip direnci arasındaki ilişkiyi doğruladı17.
Mantar istilasına karşı yer fıstığı direncinin doğal fitoaleksin bazlı mekanizmasının daha iyi anlaşılması, aflatoksin kontaminasyonunun kontrolü için umut verici bir stratejidir 15,17.Bu nedenle, aflatoksin analizlerine ek olarak, aynı tohumların fitoaleksinler için kantitatif olarak analiz edilmesi önemlidir. Bu direnç mekanizması tam olarak araştırılmamış ve anlaşılmamış olsa da, mantara dayanıklı yeni çeşitler için yer fıstığı bitkilerinin ıslahı ve genetik olarak değiştirilmesi için çok önemlidir23. Farklı ürünlerde aflatoksin tayini için çeşitli analitik prosedürlerin varlığına rağmen, özellikle geleneksel yöntemlerin analitik ve maliyet etkin gereksinimleri karşılamadığı durumlarda, belirli araştırmalar için hala basit yöntemlere ihtiyaç vardır. Yer fıstığı endüstrisi, tarım ve özel laboratuvarlar tarafından kullanılan modern temizleme yöntemlerinin çoğu antikor bazlı24 ve immünoassay 25,26,27 cihazlarıdır. Seçici ve hassastırlar, ancak yaygın adsorbanlarla dolu mini sütunlardan önemli ölçüde daha pahalıdırlar. Ek olarak, bu yöntemlerin hiçbiri birkaç miligram ağırlığındaki numunelerin analizi için tasarlanmamıştır. Magnezyum silika jel (Florisil) ile paketlenmiş mini kolonların28 analitik kullanımına ilişkin önceki araştırmamıza dayanarak, bu prosedürü devam eden ve ileriye dönük ön ıslah ve ıslah programlarının ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirdik.
Bu çalışmanın amacı, tek yer fıstığı tohumlarında aflatoksinlerin ve fitoaleksinlerin kantitatif tayini için tahribatsız, orta verimli, çevre dostu bir yöntem geliştirmekti. Böyle bir yöntem geliştirilmiştir. Yayınlanmış yöntemlere göre avantajları, daha yüksek hassasiyet, aflatoksinleri ve fitoaleksinleri tek tohum ekstraktında analiz etme yeteneği, numuneleri tartma ihtiyacının olmaması ve daha küçük hacimli sarf malzemeleri sayesinde daha düşük maliyettir. Entegre yöntemin akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Genetik analizler ve diğer adımlar bu metinde belirtilmiş ve önerilen yöntemin önemini ve tüm prosedürle nasıl entegre edildiğini göstermek için şekilde gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone, Optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A996-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard pre-column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186003975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity BEH C18 3 x 100mm column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity BEH C18 2.1 x 100mm column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxins B1, B2, G1, and G2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9441-1VL</td>
			<td>Dissolve the contents of the commercial vial in 5 mL of methanol to obtain 5 &#181;g/mL for aflatoxins B1 and G1 and 1.5 &#181;g/mL for B2 and G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxin B1 (1mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6636-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxin B2 (1mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9887-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxin G1 (1mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0138-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxin G2 (1mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0263-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aflatoxin M1 (10 &#181;g)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CRM46319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated (2kg)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD214510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina oxide basic (60-325 mesh)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A941-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium</td>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Ruptor 24&#160;</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-042E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (1000mL)</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>10001L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (250mL)</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>1000250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (400mL)</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>1000400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (600mL)</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>1000600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade, scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (LSE Compact)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Model: 6755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, micro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Model: 6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic beads (2.8 mm)</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic beads (6.5 mm)</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromeleon 7 series Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit</td>
			<td>Kyocera</td>
			<td>07896</td>
			<td>1.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit</td>
			<td>Kyocera</td>
			<td>07357</td>
			<td>2.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit</td>
			<td>Kyocera</td>
			<td>07985</td>
			<td>2.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2805M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporator, nitrogen</td>
			<td>organimation</td>
			<td>11106</td>
			<td>6-position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel, Microsoft</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (#4)</td>
			<td>Cytiva Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper cutter, stainless steel (ID 11.5mm)</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, glass fibre</td>
			<td>Cytiva Whatman</td>
			<td>934-AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (2800mL)</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>44202XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Florisil (100-200 mesh)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F101-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Integra Lifescience (Miltex)</td>
			<td>PM-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (88%, ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A118P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80oC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TSX70086D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Funnel (15 x 80mm)</td>
			<td>DWK Life Sciences (Kimax)</td>
			<td>2902060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelzan (medium)</td>
			<td>Caisson Labs&#160;</td>
			<td>G024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rod (custom)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handle, scalpel&#160;</td>
			<td>Feather</td>
			<td>#7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-4</td>
			<td>30%, Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket, round with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>136VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>8.2&#34; x 4.39&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34256</td>
			<td>16.4&#34; x 14.43&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>Cenmed</td>
			<td>B113660SBXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini column rack (custom)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer, touch (maxi mix II)</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>37600 (model 231)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves&#160;</td>
			<td>Microflex</td>
			<td>XC310M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, compressed (ultra high purity)</td>
			<td>Jones Welding</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel</td>
			<td>Georgia-Pacific</td>
			<td>20023 (D400)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-636-AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH/ATC electrode</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhCR Photochemical Reactor</td>
			<td>Waters (Vicam)</td>
			<td>600001222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, pasteur</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>9&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (1 mL) (Reference 2)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4924000088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (10 &#956;L) (Reference)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022470051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips: 10 &#956;L, 200 &#956;L, 1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (200 &#181;L)(Ergofit)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-146-679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates, petri (100x15mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (500g)</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;&#160;</td>
			<td>BD213400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reinforced bead tube (2 mL)</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reinforced bead tube (7 mL)</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repipettor, Dispensette III (10mL)</td>
			<td>Brandtech</td>
			<td>4701141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5010-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoop (custom)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screwcap jar (250 mL)&#160;</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>1395250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel, spherical (200-400 mesh)&#160;</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>97727-U</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE extract clean 1.5-mL polypropylene column&#160;</td>
			<td>American Chromotography Supplies</td>
			<td>SP-5122382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE extract clean PP frits (for 1.5 mL minicolumn)</td>
			<td>American Chromotography Supplies</td>
			<td>SP-3119414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer, UV-visible</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-385-351 (Genesys 50)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube</td>
			<td>Corning (Pyrex)</td>
			<td>982516X</td>
			<td>16x125mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube (Disposable)(16x125mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube (Disposable)(150x250mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Vanquish DAD detector (UPLC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VF-D11-A-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Vanquish Fluourescense detector (UPLC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VF-D51-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Vanquish quaternary pump F (UPLC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VF-P20-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VF-A10-A-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 (polysorbate 20) (enzyme grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial caps (4mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C4015-75A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial caps (autosampler)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C4010-60A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials &#38; caps (16 mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B7800-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials, glass (4mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C4015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials, polypropylene (autosampler) (400mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C4010-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Optima&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-destructive spe-uplc-based quantification of aflatoxins and stilbenoid phytoalexins in single peanut (arachis spp.) seeds

Aflatoksinler, başta Aspergillus flavus olmak üzere bazı mantar türlerinin oldukça kanserojen ikincil metabolitleridir. Aflatoksinler genellikle yer fıstığı da dahil olmak üzere ekonomik açıdan önemli tarımsal ürünleri kirleterek insan ve hayvan sağlığı için yüksek risk oluşturur. Dar genetik taban nedeniyle, yer fıstığı çeşitleri mantar patojenlerine karşı sınırlı direnç gösterir. Bu nedenle, Aspergillus'a toleransı olan çok sayıda yabani fıstık türü, bilim adamları tarafından hastalık direnci kaynakları olarak önemli ölçüde dikkate alınmıştır.
Aflatoksinlere direnç için bitki germplazmını araştırmak zordur, çünkü aflatoksin birikimi normal bir dağılım izlemez, bu da binlerce tek fıstık tohumunun analizine duyulan ihtiyacı belirler. Yeterince hidratlı yer fıstığı (Arachis spp.) tohumları, Aspergillus türleri tarafından enfekte edildiğinde, savunma fitoaleksinleri olarak kabul edilen biyolojik olarak aktif stilbenler (stilbenoidler) üretebilir. Yer fıstığı stilbenleri mantar gelişimini ve aflatoksin üretimini engeller. Bu nedenle, Aspergillus istilasına karşı tohum direncinin/duyarlılığının doğasını açıklamak için yer fıstığı stilbenoidleri için aynı tohumları analiz etmek çok önemlidir. Yayınlanan yöntemlerin hiçbiri aflatoksinler ve/veya stilben fitoaleksinler için tek tohum analizleri sunmamaktadır.
Çevre dostu, ucuz sarf malzemeleri kullanan, hassas ve seçici olan böyle bir yönteme olan talebi karşılamaya çalıştık. Ek olarak, yöntem tohumun sadece yarısını kullandığı ve embriyonik ekseni içeren diğer yarısını sağlam bıraktığı için tahribatsızdır. Böyle bir teknik, yer fıstığı bitkisinin çimlenmesine ve büyümesine, aflatoksin ve stilbenoid analizi için kullanılan aynı tohumdan tam olgunluğa izin verir. Bu yöntemin entegre kısmı olan Aspergillus ile tohumların manuel olarak zorlanması, yöntemdeki diğer adımlara göre daha fazla zaman ve emek gerektiren sınırlayıcı bir adımdır. Yöntem, Aspergillus'a dirençli türleri tanımlamak ve bu mantar patojenine karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmek için yabani Arachis germplazmının araştırılması için kullanılmıştır.

Peanut (Arachis hypogaea L.) is one of the major food crops in the world. It is cultivated in more than 100 countries with total production exceeding 45 million tons1. Agricultural commodities, such as peanut, corn, and cottonseed are often invaded by species of Aspergillus, soil-born fungi that produce aflatoxins2. These commodities are particularly susceptible to preharvest aflatoxin contamination when environmental conditions are characterized by high temperatures and drought. Aflatoxins are among the most potent carcinogens known3. They contaminate a quarter of the agricultural commodities in the world4 making about half of the world&#39;s population chronically exposed to aflatoxins5. Due to their high carcinogenicity and toxicity, aflatoxin presence in food is regulated at the lowest practically acceptable limits in most countries of the world6.
The European Union (EU) has legislated a maximum level of 2 ng/g for aflatoxin B1 and 4 ng/g for total aflatoxins (B1, B2, G1, and G2) in products for human consumption7. Such low limits put substantial pressure on agriculture and the food industry that processes commodities contaminated with aflatoxins. Aflatoxin monitoring and reprocessing of contaminated peanuts may be considered a passive and costly strategy to prevent aflatoxins from entering the food chain. That is why all major segments&#160;of the peanut industry experience tremendous profit losses due to the aflatoxin contamination of current peanut cultivars that often demonstrate limited resistance to fungal diseases. A prospective approach to resolve the aflatoxin problem is to obtain fungus-resistant peanut cultivars through gene introgression, that is, the transfer of genetic information from resistant wild peanut species to elite cultivars. In recent years8,9, wild peanut species have received substantial consideration as sources of genetic disease resistance because the narrow genetic base of cultivated peanuts can no longer provide the needed level of resistance traits to the peanut plant10,11. Successful introgression from wild peanut species requires the analyses of thousands of single small and scarce&#160;seeds (Figure 1A) 12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig1.jpg" /> 
Figure 1: Single-seed analysis flowchart. (A) Comparative size of different market-type peanut cultivars vs. wild Arachis spp. (1) Virginia; (2) runner; (3) Spanish; (4) wild Arachis spp. (B) Wild Arachis spp. (plate A, seed 4) cut into three sections, (5) half seed with embryonic axis; this portion of the seed is used to grow a plant (E). (C) Parts (6) and (7) are drilled with a drill bit and (D) inoculated with fungal spores. After incubation for 72h at 30 &#176;C, one of the seed parts, (6) or (7) is used for aflatoxin and phytoalexin analyses, and another is used for RNA/transcriptome sequencing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Peanut resistance to fungal pathogens is strongly associated with phytoalexins13,14,15,16,17. Peanut phytoalexins are represented by antimicrobial stilbenoids that are biosynthesized and accumulated in plant tissues after exposure to exogenous stimuli, particularly, to fungal invasion16,17,18. Rapid accumulation of sufficient concentrations of phytoalexins at the site of fungal invasion is inhibitory to fungal growth and is critical for plant defense19,20,21. Pathogen stops growing when phytoalexins accumulate to inhibitory concentrations16,22. The role of stilbenoids as defensive compounds against aflatoxigenic fungi in peanut was evaluated over 30 years ago in field experiments13. Those experiments clearly supported the hypothesis that peanut stilbenoids are a crucial resistance factor in preharvest aflatoxin contamination. Such evidence is based on the facts that stilbenes are naturally produced in field-damaged peanuts; stilbenes demonstrate appreciable biological activity against aflatoxigenic fungi; and aflatoxin contamination in seeds was detected only when peanuts lost the capacity for phytoalexin synthesis due to drought-induced seed dehydration. Another set of field experiments confirmed the association between phytoalexin production and peanut genotype resistance to agriculturally important peanut diseases17.
A better understanding of the natural phytoalexin-based mechanism of peanut resistance to fungal invasion is a promising strategy for the control of aflatoxin contamination15,17. Therefore, in addition to the aflatoxin analyses, it is important to quantitatively analyze the same seeds for phytoalexins. Although this mechanism for resistance is not fully researched and understood, yet it is crucial for breeding and genetically modifying peanut plants for new fungal-resistant cultivars23. Despite the existence of various analytical procedures for aflatoxin determination in different commodities, there is still a need for simple methods for specific research, particularly when traditional methods do not satisfy analytical and cost-effective requirements. Most modern cleanup methods used by the peanut industry, agriculture, and private laboratories are antibody-based24 and immunoassay25,26,27devices. They are selective and sensitive but substantially more expensive than minicolumns packed with common adsorbents. In addition, none of those methods were designed for the analyses of few-milligram-weight samples. Based on our previous research on the analytical use of magnesium silica gel (Florisil)-packed minicolumns28, we modified this procedure to suit the needs of ongoing and prospective pre-breeding and breeding programs.
The purpose of this work was to develop a non-destructive, medium throughput, environment-friendly method for the quantitative determination of aflatoxins and phytoalexins in single peanut seeds. Such a method has been developed. Its advantages over published methods are higher sensitivity, the ability to analyze aflatoxins and phytoalexins in a single-seed extract, lack of the need to weigh samples, and lower cost thanks to smaller volumes of consumables. The flow chart of the integrated method is shown in Figure 1. The genetic analyses and other steps are mentioned in this text and demonstrated in the figure to show the importance of the suggested method and how it is integrated with the entire procedure.

Yazar Gündemi: Aspergillus'a Karşı Genetik Direnci Belirlemek için Fıstık Tohumlarındaki Aflatoksinlerin ve Fitoaleksinlerin Miktar Tayini

Tek Yer Fıstığında (Arachis spp.) Aflatoksinlerin ve Stilbenoid Fitoaleksinlerin Tahribatsız SPE-UPLC Tabanlı Miktar Tayini Tohum

The scope of the research was to develop a method of quantification of aflatoxins and defensive phytoalexins in thousands of peanut seeds for the exploration of wild Arachis germplasm, to identify species resistant to aspergillus, and to determine and characterize novel sources of genetic resistance to this fungal pathogen. Our research group has found that the most promising approach to identify peanut germplasm that does not accumulate aflatoxin is to perform a holistic analysis of each individual seed, including its transcriptomics, genomics, phytoalexins, and mycotoxin profiles. We have developed protocols for wild and cultivated peanut seed analysis, which means using 1/4 of a single seed for chemical profiling, Developing high-throughput methods for effective seed challenging, extraction, and accurate quantification of phytoalexins in peanut seed samples.We have discovered numerous peanut phytoalexins and developed efficient and inexpensive methods for aflatoxin analysis, as well as for screening peanut germplasm with reduced or no aflatoxin accumulation. The methods include genotyping and determination of seed viability.

Tohumlarda aflatoksin miktar tayini için geliştirilen yöntem, yabani yer fıstığı türlerinin aflatoksin birikimine direnç açısından değerlendirilmesi prosedürünün tamamının özüdür. Özel olarak paketlenmiş mini sütunlar ve filtreler, büyük hacimli solventlerin olmaması, maliyetli ve gereksiz 0,22 veya 0,45 μm ticari filtreler ve pompalama cihazları nedeniyle önemli ölçüde tasarruf sağlar ve genel prosedürü basitleştirir. Aflatoksin analizleri yöntemi, Tablo 1'de görüldüğü gibi öğütülmüş tohumlardan test edilen 1.0-50.0 ng/g aflatoksin aralığında yüksek geri kazanım, doğruluk ve hassasiyet sağlar. Yüksek derecede kontamine olmuş numuneler, doğrusal test edilen değere seyreltildi. Şekil 5C , dört ana aflatoksinin, B1, B2, G1 ve G2'nin 5 dakikalık elüsyon süresi içinde temel olarak ayrılmasını göstermektedir, bu da yer fıstığı tohumlarının mantar mücadelesi prosedürün sınırlayıcı aşaması olduğundan ve UPLC analizlerinden değil, kabul edilebilir.
Önerilen yöntem, aflatoksin B1 için 2 pg'lik bir kantitasyon limiti ile yeterince hassastır (Şekil 5D). Ekstraktların yüksek saflığı, yabani bir Arachis türüne sahip bir tarladan hasat edilen saflaştırılmış tohum ekstraktının bir UPLC'sinden (Şekil 5E) görüldüğü gibi aflatoksinlerin kesin olarak ölçülmesine izin verir. Daha önce yayınlanmış bir mini sütun yöntemi29, önerilen yönteme (Şekil 5G) kıyasla mantarla mücadele edilen yer fıstığı tohumları (Şekil 5F) için tatmin edici saflık elde etme yeteneğine sahip değildir. Şekil 5F'den, aflatoksinler B2, G1 ve G2'nin, birçoğu aflatoksinlerden sonra ayrıştırılan stilbenoid fitoaleksinler ve mantar metabolitleri olan yüksek konsantrasyonlarda enterferans yapan safsızlıkların varlığı nedeniyle güvenilir bir şekilde tespit edilemediği ve miktarının belirlenemediği açıktır. Buna karşılık, Şekil 5G, magnezyum silika jel kolonunun aflatoksin fraksiyonundaki safsızlıkların giderilmesindeki yüksek verimliliğini göstermektedir. Mavi kromatogram, kolondan 1 mL metanol-su (90:10) karışımı ile yıkanan enterferans yapan safsızlıkları sunar; siyah kromatogram, aflatoksinler M1 ve B1'in gizlenmemiş zirvelerini gösterir. Bu kromatogram, zorlu bir yabani tür tohumunun ekstraktını temsil eder. Aflatoksin B1 seviyesi 48 ng/g'dır.
Yer fıstığı fitoaleksinlerinin kantitasyonu, bir tarladan elde edilen doğal bir tohum veya mantarla mücadele eden bir tohum olabilen aynı tohumdaki aflatoksinlerin analizlerine değerli bir katkı sağlar. Şekil 5H, zorlu bir tohumdan elde edilen fıstık savunma stilbenoidlerinin tipik bir kromatogramını göstermektedir. Bileşiklerin ayrılması, aflatoksin analizleri için kullanılan aynı analitik kolon kullanılarak gerçekleştirilir. Kolon ve seçilen kromatografik koşullar, stilbenoidlerin güvenilir bir şekilde kantitasyonuna izin veren piklerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasını sağlar. Sorunlu tohumlarda aflatoksin-fitoaleksin ilişkisinin değerlendirilmesi bu sunumun kapsamı dışındadır ve yöntem burada, yazarların laboratuvarında birkaç yıldır kullanılan ve yararlı olduğu kanıtlanmış potansiyel bir araştırma aracı olarak önerilmektedir.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig6.jpg"> Şekil 6: Majör aflatoksinlerin ve stilben türevi yer fıstığı fitoaleksinlerinin yapıları. (A) Majör aflatoksinlerin yapıları: 1, B, 1; 2, B, 2; 3, G1; 4, G2. (B) Başlıca stilben türevi yer fıstığı fitoaleksinlerinin yapıları: 6, resveratrol; 7, Araşidin-1; 8, Araşidin-2; 9, Araşidin-3; 10, IPD (3 "-izopentadienil-3,5,4" -trihidroksistilben); 11, SB-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Spike seviyesia (ng/g)</td>
			<td colspan="4">Aflatoksinler</td>
		</tr><tr><td>B1</td>
			<td>B2</td>
			<td>G1</td>
			<td>G2</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>85.87 (0.97)</td>
			<td>82.33 (0.67)</td>
			<td>86.63 (2.89)</td>
			<td>84.01 (0.86)</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>91.43 (2.76)</td>
			<td>87.32 (0.47)</td>
			<td>88.08 (2.08)</td>
			<td>87.73 (0.77)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>81.21 (3.16)</td>
			<td>85.33 (1.98)</td>
			<td>81.76 (4.66)</td>
			<td>88.46 (3.24)</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Florisil sütunu ve 1.2 mL aflatoksin fraksiyonu elüsyon karışımı kullanılarak yer fıstığı tohumlarından aflatoksinlerin geri kazanımı. [ortalama (SD), %; n = 5]. Georgia 06G yer fıstığı çeşidine ait aflatoksin içermeyen öğütülmüş numuneler (50 g), 50, 5 veya 1 ng/g seviyesinde aflatoksin stok çözeltisi içeren bir mikro şırınga yardımıyla eşit şekilde çivilenmiş ve oda sıcaklığında 16 saat bekletilmiştir . Aflatoksinler B1 ve G1 için ani değerler verilmiştir; aflatoksinlerB2 ve G2 için 0.33 çarpma faktörü kullanılmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Quantification of Aflatoxins and Phytoalexins in Peanut Seeds to Identify Genetic Resistance Against Aspergillus  at JoVE.com

Ultra performanslı sıvı kromatografisi kullanarak tek fıstık tohumlarında aflatoksinlerin ve stilbenoid fitoaleksinlerin miktar tayini için orta verimli bir yöntem gösteriyoruz. Bu yöntem, aflatoksijenik Aspergillus türleri tarafından zorlanan yabani Arachis türlerinin analizleri için özel olarak geliştirilmiştir.

Aflatoxins are highly carcinogenic secondary metabolites of some fungal species, particularly Aspergillus flavus. Aflatoxins often contaminate ...

Araştırmanın kapsamı, yabani Arachis germplazmının araştırılması için binlerce yer fıstığı tohumunda aflatoksinlerin ve savunma fitoaleksinlerinin miktar tayini için bir yöntem geliştirmek, aspergillusa dirençli türleri tanımlamak ve bu mantar patojenine karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmekti. Araştırma grubumuz, aflatoksin biriktirmeyen yer fıstığı germplazmını tanımlamak için en umut verici yaklaşımın, transkriptomikleri, genomikleri, fitoaleksinleri ve mikotoksin profilleri dahil olmak üzere her bir tohumun bütünsel bir analizini yapmak olduğunu bulmuştur. Yabani ve ekili fıstık tohumu analizi için protokoller geliştirdik, bu da kimyasal profilleme için tek bir tohumun 1 / 4'ünü kullanmak, Yer fıstığı tohumu örneklerinde fitoaleksinlerin etkili tohum mücadelesi, ekstraksiyonu ve doğru miktar tayini için yüksek verimli yöntemler geliştirmek anlamına geliyor.Çok sayıda yer fıstığı fitoaleksini keşfettik ve aflatoksin analizinin yanı sıra aflatoksin birikimi azalmış veya hiç olmayan yer fıstığı germplazmının taranması için verimli ve ucuz yöntemler geliştirdik. Yöntemler, genotipleme ve tohum canlılığının belirlenmesini içerir.

non-destructive-spe-uplc-based-quantification-aflatoxins-stilbenoid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds

588 Görüntüleme.  U.S. Department of Agriculture. Araştırmanın kapsamı, yabani Arachis germplazmının araştırılması için binlerce yer fıstığı tohumunda aflatoksinlerin ve savunma fitoaleksinlerinin miktar tayini için bir yöntem geliştirmek, aspergillusa dirençli türleri tanımlamak ve bu mantar patojenine karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmekti. Araştırma grubumuz, aflatoksin biriktirmeyen yer fıstığı germplazmını tanımlamak için en umut verici yaklaşımın, transkriptomikle...