היקף המחקר שלנו כולל פיתוח ותיקוף שיטה לא פולשנית למדידת תכולת פחמן במקרופאגים בדרכי הנשימה כסמן ביולוגי לחשיפה לחומר חלקיקי המכיל פחמן. אנו שואפים לקבוע את הדיוק והאמינות של שיטה זו של הערכות חשיפה פרטניות בקנה מידה גדול. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה לא פולשנית, מדויקת ומתוקננת למדידת תכולת פחמן במקרופאגים בדרכי הנשימה.
כסמן ביולוגי פנימי לחשיפה, זוהי חשיפה אינדיבידואלית יעילה ומדויקת לחומר חלקיקי המכיל פחמן. הפרוטוקול שלנו מציע סמן ביולוגי אמין ישיר לחשיפה אישית לחומר חלקיקי המכיל פחמן. שיטה זו מאפשרת כימות בקנה מידה גדול באמצעות כיח מושרה, שיפור הדיוק והאמינות בהשוואה לטכניקות אחרות.
התחל באיסוף דגימת כיח של שני מיליליטר בצינור צנטריפוגה. לאחר מכן, להוסיף 20 עד 30 מיליליטר של פתרון קיבוע מוכן לצינור ולערבב את התוכן ביסודיות. כדי להכין את פתרון העיכול עבור השעיית התא, להמיס 0.1 גרם של dithiothreitol ב 100 מיליליטר של מלוחים, על פי המינון הנדרש.
עכשיו, צנטריפוגה את הצינור המכיל את הכיח ב 1, 998 G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט. הוסף נפח שווה של עיכול כיח למשקע.
מערבלים ומנערים היטב את התערובת. לאחר מכן, הניחו את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להנזלה מלאה. לאחר מכן, סננו את התערובת הנוזלית באמצעות קרום מסנן של 70 מיקרומטר.
צנטריפוגה את התמיסה המסוננת ב 500 גרם במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט, תוך שמירה על זירוז התא. כעת, השהה מחדש את משקע התא במאגר פוספט דושן.
צנטריפוגה את התמיסה ב 500 גרם במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל משקע תא טהור. להכנת מריחת תאים, הוסיפו 200 עד 600 מיקרוליטר של חיץ פוספט למשקעי התא וערבבו היטב. לאחר מכן, לקחת 20 מיקרוליטר של תרחיף התא וליצור כתם התא.
תקן את המריחה המיובשת עם תמיסת צביעה זמינה מסחרית למשך 10 שניות. לאחר מכן, לטבול את הכתם בתמיסת צביעה A למשך שמונה שניות. במהלך הכתמה, הרימו בעדינות את המגלשה מעלה ומטה, ולאחר מכן שטפו את עודפי הכתם במים זורמים.
בתוך התאים נצפו אגרגטים קטנים של חלקיקי פחמן שחור הנראים בבירור, המשתנים בכמות חלקיקי הפחמן. כדי להתחיל, דמיינו את החלקות הכיח המוכתמות מתחת למיקרוסקופ. בחר באופן אקראי מקרופאגים מוכתמים היטב ושלמים מורפולוגית וצלם את התמונות שלהם.
באמצעות תוכנת ImageJ, מדוד את קנה המידה להמרת פיקסלים מדויקת. בחרו 'מדידה' ולחצו על 'קבע קנה מידה'. הזן את המרחק בפיקסלים, את האורך בפועל ואת יחידת האורך, מיקרומטרים.
לאחר מכן, סמן את גלובלי אופציה. כעת, תאר את התאים בצורה לא סדירה והסר את הרקע באמצעות בחירות חופשיות. תחת ערוך, בחר נקה בחוץ.
מדוד את השטח הכולל של התאים באמצעות ניתוח ומדידה. גזור את הגרעין עם עריכה וגזור. כדי להמיר את התמונה בקנה מידה אפור לשחור-לבן.
לחץ על תמונה, סוג ו- 8 סיביות. כדי להתאים את ערך קנה המידה האפור בהתבסס על צביעת תאים כדי לספור חלקיקי פחמן במדויק, עבור אל תמונה, בחר התאמה, סף והחל. לבסוף, לחץ על נתח ובחר מדידה.
עובדי אריזות פחמן שחור היו בעלי תכולת פחמן גבוהה יותר במקרופאגים בדרכי הנשימה מאשר קבוצת הביקורת.
