O escopo de nossa pesquisa envolve o desenvolvimento e validação de um método não invasivo para medir o conteúdo de carbono em macrófagos das vias aéreas como um biomarcador para exposição a material particulado contendo carbono. Nosso objetivo é determinar a precisão e a confiabilidade desse método de avaliações de exposição individual em larga escala. Nosso protocolo fornece um método não invasivo, preciso e padronizado para medir o conteúdo de carbono em macrófagos das vias aéreas.
Como um biomarcador de exposição interna, esta é uma exposição individual eficaz e precisa a material particulado contendo carbono. Nosso protocolo oferece um biomarcador direto e confiável para exposição individual a material particulado contendo carbono. Este método permite a quantificação em larga escala usando escarro induzido, aumentando a precisão e a confiabilidade em comparação com outras técnicas.
Comece coletando uma amostra de escarro de dois mililitros em um tubo de centrífuga. Em seguida, adicione 20 a 30 mililitros da solução fixadora preparada ao tubo e misture bem o conteúdo. Para preparar a solução digestiva para a suspensão celular, dissolva 0,1 gramas de ditiotreitol em 100 mililitros de soro fisiológico, de acordo com a dosagem necessária.
Agora, centrifugue o tubo contendo o escarro a 1.998 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante. Adicione um volume igual de digestão de escarro ao precipitado.
Vortex e agite bem a mistura. Em seguida, coloque o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius até a liquefação completa. Em seguida, filtre a mistura liquefeita usando uma membrana filtrante de 70 micrômetros.
Centrifugar a solução filtrada a 500 g durante sete minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante, mantendo a célula precipitada. Agora, ressuspenda o precipitado celular em tampão fosfato de Duchenne.
Centrifugar a solução a 500 g durante sete minutos a quatro graus Celsius para obter um precipitado de células puras. Para a preparação do esfregaço celular, adicione 200 a 600 microlitros de tampão fosfato ao sedimento celular e misture bem. Em seguida, pegue 20 microlitros da suspensão celular e crie um esfregaço celular.
Fixe o esfregaço seco com uma solução de coloração disponível comercialmente por 10 segundos. Em seguida, mergulhe o esfregaço na solução de coloração A por oito segundos. Durante a coloração, levante suavemente a lâmina para cima e para baixo e, em seguida, enxágue o excesso de mancha com água corrente.
Pequenos agregados de partículas de carbono negro distintamente visíveis foram observados dentro das células, variando na quantidade de partículas de carbono. Para começar, imagine as lâminas de escarro coradas ao microscópio. Selecione aleatoriamente macrófagos bem corados e morfologicamente intactos e capture suas imagens.
Usando o software ImageJ, meça a escala para uma conversão precisa de pixels. Selecione Medir e clique em Definir escala. Insira a Distância em pixels, comprimento real, e a Unidade de comprimento, micrômetros.
Em seguida, marque a opção Global. Agora, contorne as células com uma forma irregular e remova o fundo usando seleções à mão livre. Em Editar, selecione Limpar Exterior.
Meça a área total das células por meio de Analisar e Medir. Recorte o núcleo com Editar e Recortar. Para converter a imagem em escala de cinza em preto e branco.
Clique em Imagem, Tipo e 8 bits. Para ajustar o valor da escala de cinza com base na coloração celular para contar partículas de carbono com precisão, vá para Imagem, escolha Ajustar, Limite e Aplicar. Por fim, clique em Analisar e selecione Medição.
Os trabalhadores de embalagens de negro de fumo apresentaram maior teor de carbono nos macrófagos das vias aéreas do que o grupo controle.
