Объем наших исследований включает в себя разработку и валидацию неинвазивного метода измерения содержания углерода в макрофагах дыхательных путей в качестве биомаркера воздействия углеродсодержащих твердых частиц. Мы стремимся определить точность и надежность данного метода крупномасштабной индивидуальной оценки воздействия. Наш протокол представляет собой неинвазивный, точный, стандартизированный метод измерения содержания углерода в макрофагах дыхательных путей.
В качестве биомаркера внутреннего воздействия это эффективное и точное индивидуальное воздействие углеродсодержащих твердых частиц. Наш протокол предлагает прямой надежный биомаркер для индивидуального воздействия углеродсодержащих твердых частиц. Этот метод позволяет проводить крупномасштабную количественную оценку с использованием индуцированной мокроты, повышая точность и надежность по сравнению с другими методами.
Начните со сбора образца мокроты объемом два миллилитра в центрифужную пробирку. Затем добавьте в тюбик от 20 до 30 миллилитров приготовленного фиксирующего раствора и тщательно перемешайте содержимое. Чтобы приготовить пищеварительный раствор для клеточной суспензии, растворите 0,1 грамма дитиотреитола в 100 миллилитрах физиологического раствора, согласно необходимой дозировке.
Теперь центрифугируйте пробирку, содержащую мокроту, при температуре 1 998 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Затем выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте к осадку равный объем переваренной мокроты.
Вортсируйте и тщательно встряхните смесь. После этого поместите трубку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия до полного разжижения. Затем отфильтруйте разжиженную смесь с помощью фильтрующей мембраны 70 микрометров.
Центрифугируйте отфильтрованный раствор при температуре 500 G в течение семи минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от надосадочной жидкости, сохраняя в клетке осадок. Теперь ресуспендируйте клеточный осадок в фосфатном буфере Дюшенна.
Центрифугируйте раствор при 500 G в течение семи минут при четырех градусах Цельсия, чтобы получить чистый осадок клеток. Для приготовления клеточного мазка добавьте в клеточный осадок от 200 до 600 микролитров фосфатного буфера и тщательно перемешайте. Затем возьмите 20 микролитров клеточной суспензии и создайте клеточный мазок.
Зафиксируйте засохший мазок с помощью имеющегося в продаже раствора для окрашивания на 10 секунд. После этого погрузите мазок в раствор для окрашивания А на восемь секунд. Во время окрашивания аккуратно поднимайте предметное стекло вверх и вниз, затем смойте излишки пятна проточной водой.
Внутри ячеек наблюдались небольшие агрегаты отчетливо видимых частиц черного углерода, различающиеся по количеству углеродных частиц. Для начала сфотографируйте окрашенные стекла мокроты под микроскопом. Случайным образом отбирайте хорошо окрашенные и морфологически интактные макрофаги и делайте их снимки.
С помощью программного обеспечения ImageJ измерьте масштаб для точного преобразования пикселей. Выберите «Измерить» и нажмите «Установить масштаб». Введите Расстояние в пикселях, фактическую длину и Единицу измерения длины, микрометры.
Затем отметьте галочкой опцию «Глобальный». Теперь обведите ячейки неправильной формой и удалите фон с помощью произвольных выделений. В разделе Редактировать выберите Очистить снаружи.
Измерьте общую площадь ячеек с помощью функций «Анализ и измерение». Вырежьте ядро с помощью клавиш «Редактировать» и «Вырезать». Преобразование изображения в оттенках серого в черно-белое.
Нажмите «Изображение», «Тип» и «8-бит». Чтобы настроить значение оттенков серого на основе окрашивания ячеек для точного подсчета частиц углерода, перейдите в раздел «Изображение», выберите «Настроить», «Порог» и «Применить». Наконец, нажмите «Анализ» и выберите «Измерение».
Работники упаковки из технического углерода имели более высокое содержание углерода в макрофагах дыхательных путей, чем в контрольной группе.
