본 연구의 범위는 탄소 함유 미립자 물질에 대한 노출에 대한 바이오마커로서 기도 대식세포의 탄소 함량을 측정하는 비침습적 방법을 개발하고 검증하는 것입니다. 우리는 이 대규모 개별 노출 평가 방법의 정확성과 신뢰성을 결정하는 것을 목표로 합니다. 당사의 프로토콜은 기도 대식세포의 탄소 함량을 측정하기 위한 비침습적이고 정밀하며 표준화된 방법을 제공합니다.
내부 노출 바이오마커로서, 이것은 탄소 함유 미립자 물질에 대한 효과적이고 정확한 개별 노출입니다. 당사의 프로토콜은 탄소 함유 미립자 물질에 대한 개별 노출에 대한 직접적이고 신뢰할 수 있는 바이오마커를 제공합니다. 이 방법은 유도 가래를 사용하여 대규모 정량화가 가능하여 다른 기술에 비해 정확성과 신뢰성을 모두 향상시킵니다.
먼저 원심분리기 튜브에 2ml의 가래 샘플을 채취합니다. 그런 다음 준비된 고정액 20-30ml를 튜브에 넣고 내용물을 잘 섞습니다. 세포 현탁액을 위한 소화액을 준비하려면 필요한 용량에 따라 0.1mg의 디티오트레이톨을 100ml의 식염수에 용해시킵니다.
이제 가래가 들어있는 튜브를 섭씨 1, 998G에서 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 버리십시오. 침전물에 동일한 양의 가래 소화물을 첨가하십시오.
혼합물을 소용돌이치고 철저히 흔듭니다. 그런 다음 완전히 액화될 때까지 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 그런 다음 70마이크로미터 필터 멤브레인을 사용하여 액화 혼합물을 여과합니다.
여과된 용액을 섭씨 4도에서 7분 동안 500G에서 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포를 침전시킵니다. 이제 Duchenne 인산염 완충액에 세포 침전물을 재현탁시킵니다.
용액을 섭씨 4도에서 7분 동안 500G로 원심분리하여 순수한 세포 침전물을 얻습니다. 세포 도말 제제의 경우, 세포 침전물에 200-600 마이크로리터의 인산염 완충액을 첨가하고 철저히 혼합합니다. 그런 다음 20마이크로리터의 세포 현탁액을 취하여 세포 도말을 만듭니다.
건조된 얼룩을 시중에서 판매되는 염색 용액으로 10초 동안 고정합니다. 그런 다음 얼룩 용액 A에 얼룩을 8초 동안 담그십시오. 염색하는 동안 슬라이드를 부드럽게 위아래로 들어 올린 다음 흐르는 물로 과도한 얼룩을 헹굽니다.
뚜렷하게 보이는 블랙 카본 입자의 작은 응집체가 세포 내에서 관찰되었으며, 탄소 입자의 양이 다양했습니다. 먼저 현미경으로 염색된 가래 슬라이드를 이미지화합니다. 염색이 잘 되고 형태학적으로 손상되지 않은 대식세포를 무작위로 선택하여 이미지를 캡처합니다.
ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정확한 픽셀 변환을 위해 스케일을 측정합니다. 측정을 선택하고 배율 설정을 클릭합니다. Distance (픽셀), actual length(실제 길이) 및 Unit of length(마이크로미터)를 입력합니다.
그런 다음 글로벌 옵션을 선택합니다. 이제 불규칙한 모양으로 셀의 윤곽을 표시하고 자유형 선택을 사용하여 배경을 제거합니다. Edit(편집)에서 Clear Outside(외부 지우기)를 선택합니다.
Analyze and Measure를 통해 세포의 전체 면적을 측정합니다. Edit 및 Cut으로 핵을 잘라냅니다. 회색 음영 이미지를 흑백으로 변환합니다.
이미지, 유형 및 8비트를 클릭합니다. 탄소 입자를 정확하게 계수하기 위해 세포 염색을 기반으로 그레이 스케일 값을 조정하려면 Image(이미지)로 이동하여 Adjust(조정), Threshold(임계값) 및 Apply(적용)를 선택합니다. 마지막으로 분석을 클릭하고 측정을 선택합니다.
카본 블랙 패키징 작업자는 대조군보다 기도 대식세포의 탄소 함량이 더 높았습니다.
