Araştırmamızın kapsamı, karbon içeren partikül maddeye maruz kalma için bir biyobelirteç olarak hava yolu makrofajlarındaki karbon içeriğini ölçmek için invaziv olmayan bir yöntemin geliştirilmesini ve doğrulanmasını içerir. Büyük ölçekli bireysel maruziyet değerlendirmelerinin bu yönteminin doğruluğunu ve güvenilirliğini belirlemeyi amaçlıyoruz. Protokolümüz, hava yolu makrofajlarındaki karbon içeriğini ölçmek için invaziv olmayan, hassas, standartlaştırılmış bir yöntem sağlar.
Dahili bir maruziyet biyobelirteç olarak bu, karbon içeren partikül maddeye etkili ve doğru bir şekilde bireysel maruziyettir. Protokolümüz, karbon içeren partikül maddelere bireysel maruziyet için doğrudan güvenilir bir biyobelirteç sunar. Bu yöntem, indüklenmiş balgam kullanılarak büyük ölçekli nicelemeye izin vererek, diğer tekniklere kıyasla hem doğruluğu hem de güvenilirliği artırır.
Bir santrifüj tüpünde iki mililitrelik bir balgam örneği toplayarak başlayın. Daha sonra, hazırlanan fiksatif çözeltiden 20 ila 30 mililitre tüpe ekleyin ve içeriği iyice karıştırın. Hücre süspansiyonu için sindirim çözeltisini hazırlamak için, gerekli doza göre 0.1 gram ditiyotreitol'ü 100 mililitre salin içinde çözün.
Şimdi, balgam içeren tüpü 1.998 G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı atın. Çökeltiye eşit miktarda balgam sindirimi ekleyin.
Karışımı girdap haline getirin ve iyice çalkalayın. Daha sonra, tüpü tamamen sıvılaşana kadar 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Ardından, sıvılaştırılmış karışımı 70 mikrometrelik bir filtre membranı kullanarak süzün.
Filtrelenmiş çözeltiyi 500 G'de dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Hücre çökeltisini koruyarak süpernatanı atın. Şimdi, Duchenne fosfat tamponunda hücre çökeltisini yeniden süspanse edin.
Saf bir hücre çökeltisi elde etmek için çözeltiyi 500 G'de dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Hücre yayma hazırlığı için, hücre tortusuna 200 ila 600 mikrolitre fosfat tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, 20 mikrolitre hücre süspansiyonu alın ve bir hücre yayması oluşturun.
Kurumuş smear'ı piyasada bulunan bir boyama solüsyonu ile 10 saniye boyunca sabitleyin. Daha sonra, smear'ı sekiz saniye boyunca boyama çözeltisi A'ya batırın. Boyama sırasında, sürgüyü yavaşça yukarı ve aşağı kaldırın, ardından fazla lekeyi akan su ile durulayın.
Hücrelerin içinde, karbon parçacıklarının miktarına göre değişen, belirgin şekilde görülebilen siyah karbon parçacıklarının küçük agregaları gözlendi. Başlamak için, lekeli balgam slaytlarını mikroskop altında görüntüleyin. İyi boyanmış ve morfolojik olarak bozulmamış makrofajları rastgele seçin ve görüntülerini yakalayın.
ImageJ yazılımını kullanarak, doğru piksel dönüşümü için ölçeği ölçün. Hesaplama'yı seçin ve Ölçeği Ayarla'ya tıklayın. Piksel cinsinden Mesafe'yi, gerçek uzunluğu ve Uzunluk birimi'ni mikrometre olarak girin.
Ardından, Global seçeneğini işaretleyin. Şimdi, düzensiz bir şekle sahip hücrelerin ana hatlarını çizin ve serbest seçimleri kullanarak arka planı kaldırın. Düzenle'nin altında, Dışını Temizle'yi seçin.
Analiz Et ve Ölç ile hücrelerin toplam alanını ölçün. Düzenle ve Kes ile çekirdeği kesin. Gri tonlamalı görüntüyü siyah beyaza dönüştürmek için.
Görüntü, Tür ve 8 bit'i tıklatın. Karbon parçacıklarını doğru bir şekilde saymak üzere hücre boyamaya dayalı gri tonlama değerini ayarlamak için Görüntü'ye gidin, Ayarla, Eşik ve Uygula'yı seçin. Son olarak, Analiz Et'e tıklayın ve Ölçüm'ü seçin.
Karbon siyahı ambalaj çalışanları, hava yolu makrofajlarında kontrol grubuna göre daha yüksek karbon içeriğine sahipti.
