לכן המחקר שלנו עוסק בהסתגלות חיידקים למגבלות אבץ שהן מעבר לשימור אבץ בלבד. לכן אנו משתמשים בחיידקים הפתוגניים, Mycobacterium tuberculosis, ובחיידק הלא-פתוגני Mycobacterium smegmatis, כדי לראות כיצד הגבלת אבץ משפיעה על דברים כמו פיזיולוגיה של חיידקים ופתוגנזה. דבר נוסף שמעניין אותנו הוא חלבונים ריבוזומליים אלטרנטיביים, שמתבטאים על ידי חיידקים רבים במהלך הגבלת האבץ, אבל אנחנו עדיין לא יודעים עליהם הרבה.
גם מיקובקטריות פתוגניות וגם לא פתוגניות הראו תגובות דרמטיות להגבלת אבץ עם רמות ביטוי במאות גנים וחלבונים שהושפעו מזמינות המיקרו-נוטריאנט אבץ. מבחינה פיזיולוגית, התוצאה היא מורפוגנזה עמוקה ל-Mycobacterium smegmatis והגבירה משמעותית את תגובת העקה החמצונית הן ב-Mycobacterium smegmatis והן ב-Mycobacterium tuberculosis הפתוגני. פרוטוקול זה מטפל בקושי להתרבות ולתקנן תנאים לגידול מגביל אבץ בייצור ריבוזומים חלופיים פעילים בתרגום במיקובקטריה.
צפינו בגורמים שאינם בשליטתנו, כמו אירוע גשם כבד, בקורלציה עם זיהום אבץ והכנה מוגבלת של אמצעי אבץ. הפנוטיפ הביו-אינדיקטור המוצג כאן מבטיח שחזור של תוצאות גידול מגבילות אבץ. הפנוטיפ הביו-אינדיקטור הניתן לכימות המתואר כאן מאפשר השגת תנאים מגבילים של אבץ ללא שימוש בחומרי כלאט.
לכן, הוא מאפשר ייצור סטנדרטי של ריבוזומים חלופיים פעילים בתרגום ויישומים במורד הזרם כגון מקרופאגים או זיהומים בבעלי חיים כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן. לכן המעבדה שלנו עובדת על הבנת הפונקציות הספציפיות של כל חלבון ריבוזומלי חלופי וכיצד שילוב החלבונים האלה בריבוזומים יכול להשפיע על התרגום. ואנחנו גם מנסים לראות אם ניתן ליישם את התוצאות שאנו רואים ב-M.smegmatis גם על MTB, ואם ניתן להשתמש בהן כדי לפתח טיפולים טובים יותר לשחפת.
כדי להתחיל, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום 7H9-ADC לצינור ביו-ריאקטור של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של תאי מלאי גליצרול מופשרים של Mycobacterium smegmatis, והברג את המכסה על הצינור. מקם את הצינור בחוזקה בזווית של כ-45 מעלות ודגר ב-37 מעלות צלזיוס עם 120 סל"ד למשך 18 שעות.
לאחר הדגירה, מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר ואשר שהיא בסביבות 0.5 עד 0.8. צנטריפוגה את התרבות ב 3000 x גרם למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיה מוגבלת באבץ, או ZLM.
במהלך הצנטריפוגה, עקרו קובטה על ידי מילויה באתנול 70% עד שהיא עולה על גדותיה, והניחו לה לשבת במשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו את הקובט שלוש פעמים עם ZLM. לאחר הצנטריפוגה הסופית, השעו מחדש את כדור התא בשני מיליליטר ZLM.
רוקן את הספקטרופוטומטר באמצעות 600 מיקרוליטר ZLM בקובטה. העבירו 600 מיקרוליטר של תאים שטופים לקובטה המעוקרת ומדדו את הספיגה ב-600 ננומטר. אם הצפיפות האופטית היא מעל אחת, השתמש בנוסחה הנתונה.
כדי לחשב את נפח ה- ZLM שיתווסף ל -600 מיקרוליטר של תאים שטופים בקובט כדי לקבל צפיפות אופטית של אחד, הוסף את הנפח המחושב של ZLM לקובטה. מערבבים היטב על ידי פיפטינג חמש עד 10 פעמים ומודדים מחדש את הספיגה. לאחר מכן, הוסף 50 מיליליטר של ZLM לבקבוק הפלסטיק הסטרילי והכפול של 250 מיליליטר.
חסנו את הצלוחיות על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של התרבית המותאמת לצפיפות אופטית של אחת מהקובטה. עבור מדיה גדושה באבץ, הוסף 30 מיקרוליטר של אבץ גופרתי של 10 מילי-מולרי כדי להשיג ריכוז סופי של שש מיקרומולר. דגרו על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול של 100 סל"ד במשך שלושה ימים כדי להגיע לשלב הנייח.
בכל יום של הגידול, הוסף 200 מיקרוליטר תרבית במיקרו-צלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות ומדוד את מדדי הגידול בקורא מיקרו-פלטות מונוכרומטור. כדי לדווח על צפיפות התאים המתקבלת מקורא מיקרו-פלטות, צור עקומה סטנדרטית כדי להמיר את הקריאה מאורך הנתיב באמצעות נפח מוגדר לאורך הנתיב הסטנדרטי של סנטימטר אחד. הגדר את אורך גל העירור ל-420 ננומטר ואת הפליטה ל-475 ננומטר כדי למדוד את הקרינה של קופקטור F420.
לאחר מכן הגדר את אורך גל העירור ל-375 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ל-475 ננומטר כדי למדוד את הקרינה ברקע. צור סריקת עוצמת פלואורסצנציה מעירור ב-230 ננומטר ל-440 ננומטר בצעדים של חמישה ננומטר, עם פליטה קבועה ב-475 ננומטר. באמצעות המשוואה הבאה, חשב את אחוז עוצמת הקרינה ב-375 ננומטר עד 420 ננומטר.
לאחר שלושה ימים, כדי לתעד את אורך התא, נקה שקופית זכוכית ומכסה את החלקה עם מגבון נטול מוך. פיפטה טיפת תרבית של 10 מיקרוליטר על המגלשה והנח את פתק הכיסוי. לחץ בעדינות על פתק הכיסוי כך שהתרבית תתפשט כמעט ותמלא את כל האזור שמתחתיו.
באמצעות מיקרוסקופ מורכב עם טבילת שמן פי 100 ומטרות עיניים פי 10 עם חיבור מצלמה, דמיין את השקופית המוכנה. צלם תמונות של אזורים עם תאים מרובים שנמצאים במיקוד במישור ואינם זזים. באמצעות אותו מיקרוסקופ ומטרה, דמיין שקופית כיול.
בתוכנת פיג'י, בחר בכלי הקו הישר וצייר קו לאורך שקופית הכיול. בחר נתח, ואחריו הגדר קנה מידה והזן את המרחק הידוע ביחידה עבור סרגל קנה המידה. לאחר מכן בחרו 'כולל' כדי להחיל את קנה המידה על כל התמונות והמדידות.
כעת פתח את התמונה והשתמש בכלי הקו הישר כדי לצייר קו לאורך התא כדי למדוד אותו. העתק את נתוני אורך התא מהחלון המוקפץ לגיליון אלקטרוני או שמור אותם כקובץ ערכים מופרד בפסיקים לניתוח סטטיסטי. תרביות מסוג בר שגדלו ב-ZLM הראו ערכי צפיפות אופטיים נמוכים יותר בהשוואה למדיה גדושה באבץ, כאשר לזני דלתא altRP יש ערכים נמוכים עוד יותר.
התארכות תאים נצפתה בתרביות מסוג פרא ZLM עם אורך תא ממוצע של תשעה מיקרומטרים, בעוד שתאים מלאי אבץ היו קצרים יותר בסביבות שלושה מיקרומטרים. תאי דלתא altRP לא הראו התארכות משמעותית בתנאים מוגבלים באבץ. סריקות פלואורסצנטיות הראו ירידה בפלואורסצנטיות של קופקטור F420 בתרביות מסוג פרא ZLM, כאשר זני דלתא altRP הראו שונות פלואורסצנטית גבוהה בהרבה.
