Таким образом, наше исследование касается адаптации бактерий к ограничению цинка, которая выходит за рамки простого сохранения цинка. Итак, мы используем патогенные бактерии, Mycobacterium tuberculosis, и непатогенную Mycobacterium smegmatis, чтобы увидеть, как ограничение цинка влияет на такие вещи, как физиология и патогенез бактерий. Еще одна вещь, которая нас интересует, — это альтернативные рибосомные белки, которые экспрессируются многими бактериями во время ограничения цинка, но мы все еще не так много знаем о них.
Как патогенные, так и непатогенные микобактерии продемонстрировали драматическую реакцию на ограничение цинка с уровнями экспрессии в сотнях генов и белков, на которые влияла доступность микроэлемента цинка. Физиологически это приводит к глубокому морфогенезу Mycobacterium smegmatis и значительному усилению реакции на окислительный стресс как у Mycobacterium smegmatis, так и у патогенной Mycobacterium tuberculosis. Этот протокол направлен на устранение трудностей с воспроизведением и стандартизацией условий для цинк-ограничивающего роста в производстве трансляционно активных альтернативных рибосом у микобактерий.
Мы наблюдали факторы, не зависящие от нас, такие как сильный дождь, коррелирующие с загрязнением цинком и приготовлением фильтрующего материала с ограниченным содержанием цинка. Представленный здесь фенотип биоиндикатора обеспечивает воспроизводимость цинк-ограничивающих результатов роста. Описанный здесь количественно измеримый фенотип биоиндикатора позволяет достичь цинк-ограничивающих условий без использования хелатирующих агентов.
Таким образом, это позволяет стандартизированно производить трансляционно активные альтернативные рибосомы и использовать их в последующих процессах, таких как макрофаги или инфекции животных, для изучения взаимодействий хозяина и патогена. Поэтому наша лаборатория работает над пониманием специфических функций каждого альтернативного рибосомального белка и того, как включение этих белков в рибосомы может повлиять на трансляцию. И мы также пытаемся понять, можно ли применить результаты, которые мы наблюдаем у M.smegmatis, и можно ли их использовать для разработки более эффективных методов лечения туберкулеза.
Для начала добавьте пять миллилитров среды 7H9-ADC в 50-миллилитровую пробирку биореактора. Затем добавьте 10 микролитров размороженных глицериновых стоковых клеток Mycobacterium smegmatis, и закрутите крышку на тюбик. Плотно расположите трубку под углом примерно 45 градусов и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью 120 об/мин в течение 18 часов.
После инкубации измерьте оптическую плотность на уровне 600 нанометров и убедитесь, что она составляет от 0,5 до 0,8. Центрифугируйте культуру при 3000 х г в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах среды с ограниченным содержанием цинка, или ZLM.
Во время центрифугирования простерилизуйте кювету, наполнив ее 70% этанолом до переполнения, и оставьте на 10 минут. Затем трижды промойте кювету ZLM. После окончательного центрифугирования суспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах ZLM.
Заглушите спектрофотометр, используя 600 микролитров ZLM в кювете. Перенесите 600 микролитров промытых клеток в стерилизованную кювету и измерьте поглощение на 600 нанометрах. Если оптическая плотность больше единицы, используйте приведенную формулу.
Чтобы рассчитать объем ZLM, который необходимо добавить к 600 микролитрам отмытых ячеек в кювете для получения оптической плотности единицы, добавьте рассчитанный объем ZLM к кювете. Хорошо перемешайте с помощью пипетки от пяти до 10 раз и повторно измерьте абсорбцию. Далее добавьте 50 миллилитров ZLM в стерильную, двойную автоклавную пластиковую колбу Эрленмейера объемом 250 миллилитров.
Инокулируйте колбы, добавив 50 микролитров культуры, доведенной до оптической плотности одного из кюветы. Для среды, содержащей изобилие цинком, добавьте 30 микролитров 10 миллимолярного сульфата цинка, чтобы достичь конечной концентрации в шесть микромоляров. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью 100 об/мин, встряхивая в течение трех дней, чтобы достичь стационарной фазы.
Каждый день роста добавляйте 200 микролитров культуры в 96-луночный микропланшет с плоским дном и измеряйте показатели роста на считывателе микропланшетов монохроматора. Чтобы получить отчет о плотности ячеек, полученной с помощью считывателя микропланшетов, сгенерируйте стандартную кривую для преобразования показаний из длины пути с использованием заданного объема в стандартную длину пути в один сантиметр. Установите длину волны возбуждения на 420 нанометров и излучение на 475 нанометров, чтобы измерить флуоресценцию кофактора F420.
Затем установите длину волны возбуждения на 375 нанометров, а длину волны излучения на 475 нанометров, чтобы измерить фоновую флуоресценцию. Сгенерируйте сканирование интенсивности флуоресценции от возбуждения на расстоянии от 230 нанометров до 440 нанометров с пятью нанометровыми шагами с фиксированным излучением на 475 нанометров. Используя следующее уравнение, рассчитайте процент интенсивности флуоресценции на расстоянии от 375 нанометров до 420 нанометров.
Через три дня, чтобы записать длину ячейки, очистите предметное стекло и накройте крышку безворсовой салфеткой. Нанесите пипеткой каплю культуры объемом 10 микролитров на предметное стекло и установите крышку. Осторожно нажмите на защитный листок, чтобы культура распространилась и почти заполнила всю область под ней.
Используя составной микроскоп со 100-кратным погружением в масло и 10-кратным окулярным объективом С прикрепленной камерой визуализируйте подготовленный предметный предмет. Делайте снимки областей с несколькими ячейками, которые находятся в фокусе в плоскости и не движутся. Используя тот же микроскоп и объектив, сфотографируйте калибровочное стекло.
В программном обеспечении для Фиджи выберите инструмент «Прямая линия» и нарисуйте линию по всей длине калибровочного предметного стекла. Выберите «Анализ», затем «Установить масштаб» и введите известное расстояние в единицах измерения для масштабной линейки. Затем выберите глобальный, чтобы применить масштаб ко всем изображениям и измерениям.
Теперь откройте изображение и с помощью инструмента «Прямая линия» нарисуйте линию вдоль длины ячейки, чтобы измерить ее. Скопируйте данные о длине ячеек из всплывающего окна в таблицу или сохраните их в виде файла значений, разделенных запятыми, для статистического анализа. Культуры дикого типа, выращенные в ZLM, показали более низкие значения оптической плотности по сравнению с изобилующими цинком средами, а дельта-штаммы altRP имели еще более низкие значения.
Удлинение клеток наблюдалось в культурах дикого типа ZLM со средней длиной клеток девять микрометров, в то время как клетки, изобилующие цинком, были короче и составляли около трех микрометров. Клетки дельта altRP не показали значительного удлинения в условиях ограниченного цинка. Флуоресцентное сканирование показало снижение флуоресценции кофактора F420 в культурах дикого типа ZLM, при этом дельта-штаммы altRP показали гораздо более высокую вариабельность флуоресценции.
