Nos recherches portent donc sur les adaptations bactériennes à la limitation du zinc qui vont au-delà de la simple conservation du zinc. Nous utilisons donc les bactéries pathogènes, Mycobacterium tuberculosis, et les bactéries non pathogènes, Mycobacterium smegmatis, afin de voir comment la limitation du zinc affecte des choses comme la physiologie bactérienne et la pathogenèse. Une autre chose qui nous intéresse, ce sont les protéines ribosomales alternatives, qui sont exprimées par de nombreuses bactéries lors de la limitation du zinc, mais nous n’en savons toujours pas grand-chose.
Les mycobactéries pathogènes et non pathogènes ont montré des réponses spectaculaires à la limitation du zinc, les niveaux d’expression dans des centaines de gènes et de protéines étant influencés par la disponibilité du micronutriment zinc. Physiologiquement, cela se traduit par une morphogenèse profonde de Mycobacterium smegmatis et une réponse au stress oxydatif significativement régulée chez Mycobacterium smegmatis et Mycobacterium tuberculosis pathogène. Ce protocole aborde la difficulté de reproduction et la normalisation des conditions de croissance limitant le zinc dans la production de ribosomes alternatifs translationnellement actifs chez les mycobactéries.
Nous avons observé des facteurs hors de notre contrôle, comme une forte pluie, en corrélation avec une contamination par le zinc et une préparation limitée des milieux par le zinc. Le phénotype du bioindicateur présenté ici garantit la reproductibilité des résultats de croissance limitant le zinc. Le phénotype bio-indicateur quantifiable décrit ici permet d’obtenir des conditions limitant le zinc sans utiliser d’agents chélateurs.
Par conséquent, il permet la production standardisée d’un ribosome alternatif translationnellement actif et des applications en aval telles que les infections de macrophages ou d’animaux pour étudier les interactions hôte-pathogène. Notre laboratoire s’efforce donc de comprendre les fonctions spécifiques de chaque protéine ribosomique alternative et comment l’incorporation de ces protéines dans les ribosomes pourrait affecter la traduction. Et nous essayons également de voir si les résultats que nous voyons avec M. smegmatis peuvent également être appliqués au MTB, et si ceux-ci peuvent être utilisés pour développer de meilleurs traitements contre la tuberculose.
Pour commencer, ajoutez cinq millilitres de milieu 7H9-ADC dans un tube de bioréacteur de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 10 microlitres de cellules souches de glycérol décongelées de Mycobacterium smegmatis et vissez le couvercle sur le tube. Positionnez fermement le tube à un angle d’environ 45 degrés et incubez à 37 degrés Celsius avec 120 tr/min pendant 18 heures.
Après l’incubation, mesurez la densité optique à 600 nanomètres et confirmez qu’elle est d’environ 0,5 à 0,8. Centrifugez la culture à 3000 x g pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu limité en zinc, ou ZLM.
Pendant la centrifugation, stérilisez une cuvette en la remplissant d’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’elle déborde, et laissez-la reposer pendant 10 minutes. Rincez ensuite la cuvette trois fois avec du ZLM. Après la centrifugation finale, remettre en suspension la pastille de cellule dans deux millilitres de ZLM.
Blanchir le spectrophotomètre à l’aide de 600 microlitres de ZLM dans une cuvette. Transférez 600 microlitres de cellules lavées dans la cuvette stérilisée et mesurez l’absorbance à 600 nanomètres. Si la densité optique est supérieure à un, utilisez la formule donnée.
Pour calculer le volume de ZLM à ajouter aux 600 microlitres de cellules lavées dans la cuvette pour obtenir une densité optique de un, ajoutez le volume calculé de ZLM à la cuvette. Mélangez bien en pipetant cinq à 10 fois et mesurez à nouveau l’absorbance. Ensuite, ajoutez 50 millilitres de ZLM dans l’erlenmeyer en plastique stérile, double autoclave de 250 millilitres.
Inoculer les flacons en ajoutant 50 microlitres de la culture ajustée à une densité optique de un de la cuvette. Pour un milieu riche en zinc, ajoutez 30 microlitres de sulfate de zinc de 10 millimolaires pour obtenir une concentration finale de six micromolaires. Incuber la culture à 37 degrés Celsius avec 100 tr/min en secouant pendant trois jours pour atteindre la phase stationnaire.
Chaque jour de croissance, ajoutez 200 microlitres de culture dans une microplaque à fond plat de 96 puits et mesurez les paramètres de croissance sur un lecteur de microplaques monochromateur. Pour indiquer la densité cellulaire obtenue à partir d’un lecteur de microplaques, générez une courbe standard pour convertir la lecture de la longueur de chemin à l’aide d’un volume défini en longueur de trajet standard d’un centimètre. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 420 nanomètres et l’émission à 475 nanomètres pour mesurer la fluorescence du cofacteur F420.
Réglez ensuite la longueur d’onde d’excitation sur 375 nanomètres et la longueur d’onde d’émission sur 475 nanomètres pour mesurer la fluorescence de fond. Générez un balayage d’intensité de fluorescence à partir d’une excitation à 230 nanomètres à 440 nanomètres en cinq nanomètres, avec une émission fixe à 475 nanomètres. À l’aide de l’équation suivante, calculez le pourcentage d’intensité de fluorescence à 375 nanomètres à 420 nanomètres.
Après trois jours, pour enregistrer la longueur de la cellule, nettoyez une lame de verre et une lamelle avec une lingette non pelucheuse. Pipetez une goutte de culture de 10 microlitres sur la lame et placez la lamelle. Appuyez doucement sur la lamelle pour que la culture s’étale et remplisse presque toute la zone en dessous.
À l’aide d’un microscope composé avec une immersion dans l’huile 100X et des objectifs oculaires 10X Avec l’accessoire de la caméra, visualisez la lame préparée. Prenez des photos de zones avec plusieurs cellules qui sont nettes dans le plan et qui ne bougent pas. À l’aide du même microscope et du même objectif, imagez une lame d’étalonnage.
Dans le logiciel Fidji, sélectionnez l’outil de ligne droite et tracez une ligne sur toute la longueur de la diapositive d’étalonnage. Sélectionnez Analyser, puis Définir l’échelle et entrez la distance connue en unité pour la barre d’échelle. Sélectionnez ensuite global pour appliquer l’échelle à toutes les images et mesures.
Ouvrez maintenant l’image et utilisez l’outil Ligne droite pour tracer une ligne le long de la longueur de la cellule afin de la mesurer. Copiez les données de longueur de cellule de la fenêtre contextuelle dans une feuille de calcul ou enregistrez-les sous forme de fichier de valeurs séparées par des virgules pour l’analyse statistique. Les cultures de type sauvage cultivées dans le ZLM ont montré des valeurs de densité optique inférieures à celles des milieux riches en zinc, les souches delta altRP ayant des valeurs encore plus faibles.
L’élongation cellulaire a été observée dans les cultures de type sauvage ZLM avec une longueur cellulaire moyenne de neuf micromètres, tandis que les cellules remplies de zinc étaient plus courtes à environ trois micromètres. Les cellules delta altRP n’ont pas montré d’allongement significatif dans des conditions limitées en zinc. Les balayages de fluorescence ont montré une diminution de la fluorescence du cofacteur F420 dans les cultures de type sauvage ZLM, les souches delta altRP montrant une variabilité de fluorescence beaucoup plus élevée.
