因此，我们的研究涉及细菌对锌限制的适应，而不仅仅是锌保护。因此，我们使用病原菌结核分枝杆菌和非致病性耻垢分枝杆菌，以了解锌限制如何影响细菌生理学和发病机制等。我们感兴趣的另一件事是替代核糖体蛋白，在锌限制期间，许多细菌都会表达这种蛋白，但我们仍然对它们了解不多。
致病性和非致病性分枝杆菌都显示出对锌限制的显着反应，数百个基因和蛋白质的表达水平受微量营养素锌的可用性影响。从生理学上讲，这导致耻垢分枝杆菌的深刻形态发生，并显着上调耻垢分枝杆菌和病原性结核分枝杆菌的氧化应激反应。该方案解决了分枝杆菌中翻译活性替代核糖体生产中锌限制生长的困难和标准化条件。
我们观察到了我们无法控制的因素，例如大雨事件，这些因素与锌污染和锌限制培养基制备有关。此处介绍的生物指示剂表型确保了限锌生长结果的可重复性。此处描述的可量化生物指示剂表型允许在不使用螯合剂的情况下达到限锌条件。
因此，它能够标准化生产具有翻译活性的替代核糖体和下游应用，例如巨噬细胞或动物感染，以研究宿主-病原体相互作用。因此，我们的实验室正在努力了解每种替代核糖体蛋白的特定功能，以及将这些蛋白质掺入核糖体如何影响翻译。我们还在尝试看看我们在耻垢分枝杆菌中看到的结果是否也可以应用于 MTB，以及这些结果是否可以用于开发更好的结核病治疗方法。
首先，将 5 mL 7H9-ADC 培养基添加到 50 mL生物反应器管中。然后加入 10 微升解冻的耻垢分枝杆菌甘油储备细胞，并将盖子拧到管上。将试管牢固地放置在大约 45 度角，并在 37 摄氏度下以 120 rpm 的速度孵育 18 小时。
孵育后，测量 600 纳米的光密度并确认其约为 0.5 至 0.8。将培养物以 3000 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 5 毫升限锌培养基或 ZLM 中。
离心过程中，用 70% 乙醇填充比色皿直至溢出，对比色皿进行消毒，然后静置 10 分钟。然后用 ZLM 冲洗比色皿 3 次。最后一次离心后，将细胞沉淀重悬于 2 mL ZLM 中。
在比色皿中使用 600 μL ZLM 空白分光光度计。将 600 微升洗涤的细胞转移到灭菌的比色皿中，并测量 600 纳米处的吸光度。如果光密度大于 1，则使用给定的公式。
要计算要添加到比色皿中 600 微升洗涤细胞中的 ZLM 体积以获得光密度 1，请将计算出的 ZLM 体积添加到比色皿中。通过移液 5 到 10 次充分混合，然后重新测量吸光度。接下来，将 50 毫升 ZLM 添加到无菌、双重高压灭菌的 250 毫升塑料锥形瓶中。
通过从比色皿中加入 50 微升调整至 1 光密度的培养物来接种培养瓶。对于充满锌的培养基，添加 30 微升 10 毫摩尔硫酸锌，以达到 6 微摩尔的最终浓度。将培养物在 37 摄氏度下以 100 rpm 振荡孵育 3 天，以达到固定相。
生长的每一天，在 96 孔平底微孔板中加入 200 微升培养物，并在光栅酶标仪上测量生长指标。要报告从酶标仪获得的细胞密度，请生成一条标准曲线，以将使用设定体积的光程长度读数转换为标准的 1 厘米光程长度。将激发波长设置为 420 纳米，发射波长为 475 纳米，以测量辅因子 F420 的荧光。
然后将激发波长设置为 375 纳米，发射波长设置为 475 纳米以测量背景荧光。以 5 纳米步长生成从 230 纳米到 440 纳米激发的荧光强度扫描，固定发射为 475 纳米。使用以下公式，计算 375 纳米至 420 纳米处荧光强度的百分比。
三天后，要记录细胞长度，请用无绒抹布清洁载玻片和盖玻片。吸取 10 微升培养物滴到载玻片上，然后放置盖玻片。轻轻按压盖玻片，使培养物扩散到几乎填满下面的整个区域。
使用具有 100 倍油浸和 10 倍目镜的复合显微镜，通过相机附件，可视化准备好的载玻片。拍摄具有多个像元的区域，这些像元在平面中聚焦且不移动。使用相同的显微镜和物镜，对校准玻片进行成像。
在 Fiji 软件中，选择直线工具并在校准玻片的长度上画一条线。选择 Analyze（分析），然后选择 Set Scale（设置比例），然后输入比例尺的已知距离（单位）。然后选择 global （全局） 以将比例应用于所有图像和测量值。
现在打开图像并使用直线工具沿单元格的长度画一条线来测量它。将弹出窗口中的单元格长度数据复制到电子表格中，或将其另存为逗号分隔值文件以进行统计分析。与充满锌的培养基相比，在 ZLM 中生长的野生型培养物显示出较低的光密度值，而 delta altRP 菌株的值甚至更低。
在平均细胞长度为 9 微米的 ZLM 野生型培养物中观察到细胞伸长，而充满锌的细胞较短，约为 3 微米。Delta altRP 细胞在锌限制条件下未显示显着伸长。荧光扫描显示 ZLM 野生型培养物中辅因子 F420 荧光降低，delta altRP 菌株显示出更高的荧光变异性。
