Bu nedenle araştırmamız, sadece çinko korunmasının ötesine geçen çinko sınırlamasına bakteriyel adaptasyonlarla ilgilidir. Bu yüzden patojenik bakterileri, Mycobacterium tuberculosis ve patojenik olmayan Mycobacterium smegmatis'i, çinko sınırlamasının bakteri fizyolojisi ve patogenezi gibi şeyleri nasıl etkilediğini görmek için kullanıyoruz. İlgilendiğimiz bir diğer şey de, çinko sınırlaması sırasında birçok bakteri tarafından ifade edilen alternatif ribozomal proteinlerdir, ancak onlar hakkında hala çok fazla şey bilmiyoruz.
Hem patojenik hem de patojenik olmayan mikobakteriler, mikro besin çinkosunun mevcudiyetinden etkilenen yüzlerce gen ve proteindeki ekspresyon seviyeleri ile çinko sınırlamasına dramatik tepkiler gösterdi. Fizyolojik olarak, bu, Mycobacterium smegmatis için derin bir morfogenez ile sonuçlanır ve hem Mycobacterium smegmatis hem de patojenik Mycobacterium tuberculosis'te oksidatif stres yanıtını önemli ölçüde artırır. Bu protokol, mikobakterilerde translasyonel olarak aktif alternatif ribozomların üretiminde çinko sınırlayıcı büyüme için koşulların çoğaltılması ve standartlaştırılması zorluğunu ele almaktadır.
Çinko kontaminasyonu ve çinko sınırlı ortam hazırlığı ile ilişkili şiddetli bir yağmur olayı gibi kontrolümüz dışındaki faktörleri gözlemledik. Burada sunulan biyoindikatör fenotipi, çinko sınırlayıcı büyüme sonuçlarının tekrarlanabilirliğini sağlar. Burada açıklanan ölçülebilir biyoindikatör fenotipi, şelatlama maddeleri kullanılmadan çinko sınırlayıcı koşulların elde edilmesine izin verir.
Bu nedenle, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için translasyonel olarak aktif bir alternatif ribozomların ve makrofaj veya hayvan enfeksiyonları gibi aşağı akış uygulamalarının standartlaştırılmış üretimini sağlar. Bu nedenle laboratuvarımız, her bir alternatif ribozomal proteinin spesifik işlevlerini ve bu proteinlerin ribozomlara dahil edilmesinin translasyonu nasıl etkileyebileceğini anlamak için çalışıyor. Ayrıca, M.smegmatis'te gördüğümüz sonuçların MTB'ye de uygulanıp uygulanamayacağını ve bunların daha iyi TB tedavileri geliştirmek için kullanılıp kullanılamayacağını görmeye çalışıyoruz.
Başlamak için, 50 mililitrelik bir biyoreaktör tüpüne beş mililitre 7H9-ADC ortamı ekleyin. Daha sonra 10 mikrolitre çözülmüş gliserol Mycobacterium smegmatis stok hücrelerini ekleyin ve kapağı tüpün üzerine vidalayın. Tüpü yaklaşık 45 derecelik bir açıyla sıkıca yerleştirin ve 18 saat boyunca 120 rpm ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün ve 0,5 ila 0,8 arasında olduğunu onaylayın. Kültürü beş dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti beş mililitre çinko sınırlı ortamda veya ZLM'de yeniden süspanse edin.
Santrifüjleme sırasında, bir küveti taşana kadar% 70 etanol ile doldurarak sterilize edin ve 10 dakika bekletin. Ardından küveti ZLM ile üç kez durulayın. Son santrifüjlemeden sonra, hücre peletini iki mililitre ZLM'de yeniden süspanse edin.
Bir küvette 600 mikrolitre ZLM kullanarak spektrofotometreyi boşaltın. 600 mikrolitre yıkanmış hücreyi sterilize edilmiş küvete aktarın ve emilimi 600 nanometrede ölçün. Optik yoğunluk birin üzerindeyse, verilen formülü kullanın.
Küvetteki 600 mikrolitre yıkanmış hücreye eklenecek ZLM hacmini hesaplamak ve bir optik yoğunluk elde etmek için, hesaplanan ZLM hacmini küvete ekleyin. Beş ila 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın ve emiciliği yeniden ölçün. Ardından, steril, çift otoklavlanmış 250 mililitrelik plastik Erlenmeyer şişesine 50 mililitre ZLM ekleyin.
Küvetten bir optik yoğunluğa ayarlanmış 50 mikrolitre kültür ekleyerek şişeleri aşılayın. Çinko dolgulu ortamlar için, altı mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için 30 mikrolitre 10 milimolar çinko sülfat ekleyin. Kültürü 37 santigrat derecede 100 rpm'de inkübe edin, durağan faza ulaşmak için üç gün çalkalayın.
Büyümenin her günü, 96 oyuklu düz tabanlı bir mikroplakaya 200 mikrolitre kültür ekleyin ve bir monokromatör mikroplaka okuyucusunda büyüme ölçümlerini ölçün. Bir mikroplaka okuyucusundan elde edilen hücre yoğunluğunu raporlamak için, ayarlanmış bir hacim kullanarak okumayı yol uzunluğundan standart bir santimetre yol uzunluğuna dönüştürmek için standart bir eğri oluşturun. F420 kofaktörünün floresansını ölçmek için uyarma dalga boyunu 420 nanometreye ve emisyonu 475 nanometreye ayarlayın.
Ardından, arka plan floresansını ölçmek için uyarma dalga boyunu 375 nanometreye ve emisyon dalga boyunu 475 nanometreye ayarlayın. Beş nanometre adımlarla 230 nanometreden 440 nanometreye kadar uyarımdan 475 nanometrede sabit emisyonla bir Floresan Yoğunluğu Taraması oluşturun. Aşağıdaki denklemi kullanarak, 375 nanometre ila 420 nanometre arasında floresan yoğunluğunun yüzdesini hesaplayın.
Üç gün sonra, hücre uzunluğunu kaydetmek için bir cam slaytı temizleyin ve tüy bırakmayan bir mendille kapağı kapatın. Slaytın üzerine 10 mikrolitrelik bir kültür damlası pipetleyin ve kapak fişini yerleştirin. Kapak fişine hafifçe bastırın, böylece kültür neredeyse altındaki tüm alanı dolduracak şekilde yayılır.
100X yağa daldırma ve 10X oküler objektifli bir bileşik mikroskop kullanarak Kamera eklentisi ile hazırlanan slaydı görselleştirin. Düzlemde odakta olan ve hareket etmeyen birden fazla hücrenin bulunduğu alanların fotoğraflarını çekin. Aynı mikroskobu ve objektifi kullanarak bir kalibrasyon slaydı görüntüleyin.
Fiji yazılımında, düz çizgi aracını seçin ve kalibrasyon slaytının uzunluğu boyunca bir çizgi çizin. Analiz Et'i seçin, ardından Ölçeği Ayarla'yı seçin ve ölçek çubuğu için bilinen mesafeyi birim cinsinden girin. Ardından, ölçeği tüm görüntülere ve ölçümlere uygulamak için genel'i seçin.
Şimdi görüntüyü açın ve ölçmek için hücrenin uzunluğu boyunca bir çizgi çizmek için düz çizgi aracını kullanın. Açılır pencereden hücre uzunluğu verilerini bir elektronik tabloya kopyalayın veya istatistiksel analiz için virgülle ayrılmış değer dosyası olarak kaydedin. ZLM'de yetiştirilen yabani tip kültürler, çinko dolgulu ortamlara kıyasla daha düşük optik yoğunluk değerleri gösterdi ve delta altRP suşları daha da düşük değerlere sahipti.
Ortalama hücre uzunluğu dokuz mikrometre olan ZLM vahşi tip kültürlerde hücre uzaması gözlenirken, çinko dolgun hücreler yaklaşık üç mikrometrede daha kısaydı. Delta altRP hücreleri, çinko sınırlı koşullarda önemli bir uzama göstermedi. Floresan taramaları, ZLM vahşi tip kültürlerde azalmış kofaktör F420 floresansı gösterdi ve delta altRP suşları çok daha yüksek floresan değişkenliği gösterdi.
