したがって、私たちの研究は、亜鉛の節約だけにとどまらない、亜鉛の制限に対する細菌の適応に関するものです。そこで、病原菌である結核菌と非病原性菌であるスメグマティス菌を使用して、亜鉛の制限が細菌の生理機能や病因などにどのように影響するかを調べます。もう一つ注目しているのは、亜鉛制限時に多くの細菌によって発現される代替リボソームタンパク質ですが、それらについてはまだあまりわかっていません。
病原性マイコバクテリアと非病原性マイコバクテリアの両方が、微量栄養素である亜鉛の利用可能性に影響を受ける数百の遺伝子とタンパク質の発現レベルで、亜鉛の制限に対して劇的な反応を示しました。生理学的には、これによりマイコバクテリウム・スメグマティスの深遠な形態形成が起こり、マイコバクテリウム・スメグマティスと病原性結核菌の両方で酸化ストレス応答が大幅にアップレギュレーションされます。このプロトコールは、マイコバクテリアにおける翻訳活性代替リボソームの産生における亜鉛制限増殖の再現および標準化の困難さに対処します。
大雨イベントなど、制御できない要因が、亜鉛汚染や亜鉛の培地調製制限と相関していることが観察されました。ここで提示するバイオインジケーターの表現型は、亜鉛制限成長結果の再現性を保証します。ここで説明する定量化可能なバイオインジケーター表現型は、キレート剤を使用せずに亜鉛制限条件を達成することができます。
したがって、翻訳活性のある代替リボソームの標準化された生産や、マクロファージや動物感染などの下流アプリケーションを使用して、宿主と病原体の相互作用を研究することができます。そこで、私たちの研究室では、それぞれの代替リボソームタンパク質の特異的な機能と、それらのタンパク質のリボソームへの取り込みが翻訳にどのように影響するかを理解することに取り組んでいます。また、M.smegmatisで得られた結果をMTBにも適用できるかどうか、そしてそれらをより良い結核治療の開発に使用できるかどうかを確認しようとしています。
まず、50ミリリットルのバイオリアクターチューブに5ミリリットルの7H9-ADC培地を追加します。次に、Mycobacterium smegmatisの解凍したグリセロールストック細胞を10マイクロリットル加え、蓋をチューブにねじ込みます。チューブを約45度の角度でしっかりと配置し、摂氏37度、120rpmで18時間インキュベートします。
インキュベーション後、600ナノメートルで光学密度を測定し、0.5〜0.8程度であることを確認します。培養物を3000 x gで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを5ミリリットルの亜鉛制限媒体(ZLM)に再懸濁します。
遠心分離中は、キュベットを70%エタノールでいっぱいになるまで滅菌し、10分間放置します。次に、キュベットをZLMで3回すすぎます。最終遠心分離後、細胞ペレットを2ミリリットルのZLMに再懸濁します。
キュベットに600マイクロリットルのZLMを使用して分光光度計をブランクにします。滅菌したキュベットに600マイクロリットルの洗浄細胞を移し、600ナノメートルで吸光度を測定します。光学密度が1を超える場合は、指定された式を使用します。
キュベット内の600マイクロリットルの洗浄済みセルに添加されるZLMの体積を計算して光学密度1を得るために、計算されたZLMの体積をキュベットに加える。5〜10回ピペッティングしてよく混合し、吸光度を再測定します。次に、滅菌済みのダブルオートクレーブ処理された250ミリリットルのプラスチック製三角フラスコに50ミリリットルのZLMを加えます。
キュベットから光学密度1に調整された50マイクロリットルの培養物を追加して、フラスコに接種します。亜鉛が豊富な培地の場合は、30マイクロリットルの10ミリモル硫酸亜鉛を添加して、最終濃度を6マイクロモルにします。100rpmで3日間振とうし、37°Cで培養物をインキュベートし、固定相に到達します。
成長の毎日、96ウェル平底マイクロプレートに200マイクロリットルの培養物を追加し、モノクロメーターマイクロプレートリーダーで成長メトリクスを測定します。マイクロプレートリーダーから得られた細胞密度を報告するには、標準曲線を生成して、設定されたボリュームを使用したパス長から標準の 1 cm パス長に読み取り値を変換します。励起波長を420ナノメートル、発光波長を475ナノメートルに設定して、補因子F420の蛍光を測定します。
次に、励起波長を375ナノメートルに、発光波長を475ナノメートルに設定して、バックグラウンド蛍光を測定します。230ナノメートルから440ナノメートルの励起から5ナノメートルステップで蛍光強度スキャンを生成し、475ナノメートルで固定発光します。次の式を使用して、375ナノメートルから420ナノメートルでの蛍光強度の割合を計算します。
3日後、セルの長さを記録するために、スライドガラスとカバースリップを糸くずの出ないワイプで拭きます。10マイクロリットルの培養液をスライドにピペットで滴下し、カバースリップを置きます。カバースリップをそっと押して、培養物が広がり、その下の領域全体にほぼ広がるようにします。
100倍の油浸と10倍の眼球対物レンズを備えた複合顕微鏡を使用して、カメラアタッチメントを使用して、準備したスライドを視覚化します。平面内で焦点が合っていて動かない複数のセルがある領域の写真を撮ります。同じ顕微鏡と対物レンズを使用して、キャリブレーションスライドを画像化します。
フィジーのソフトウェアで、直線ツールを選択し、キャリブレーションスライドの長さに線を引きます。[分析] を選択し、次に [スケールの設定] を選択し、スケール バーの既知の距離を単位で入力します。次に、[グローバル] を選択して、すべての画像と測定値にスケールを適用します。
次に、画像を開き、直線ツールを使用してセルの長さに沿って線を引いて測定します。ポップアップウィンドウからセルの長さデータをスプレッドシートにコピーするか、統計分析のためにカンマ区切り値ファイルとして保存します。ZLMで増殖した野生型培養物は、亜鉛充血培地と比較して光学密度値が低く、デルタaltRP株はさらに低い値を示しました。
平均細胞長が9マイクロメートルのZLM野生型培養物では細胞の伸長が観察されましたが、亜鉛を豊富に含む細胞は約3マイクロメートルと短かった。デルタaltRP細胞は、亜鉛制限条件下で有意な伸長を示さなかった。蛍光スキャンでは、ZLM野生型培養物で補因子F420蛍光の減少が示され、デルタaltRP株ははるかに高い蛍光変動を示しました。
