Unsere Forschung befasst sich also mit bakteriellen Anpassungen an die Zinklimitierung, die über die reine Zinkkonservierung hinausgehen. Wir verwenden also das pathogene Bakterium Mycobacterium tuberculosis und das nicht-pathogene Mycobacterium smegmatis, um zu sehen, wie sich die Zinklimitierung auf Dinge wie die bakterielle Physiologie und Pathogenese auswirkt. Eine andere Sache, an der wir interessiert sind, sind alternative ribosomale Proteine, die von vielen Bakterien während der Zinklimitierung exprimiert werden, aber wir wissen noch nicht so viel über sie.
Sowohl pathogene als auch nicht-pathogene Mykobakterien zeigten dramatische Reaktionen auf die Zinklimitierung mit Expressionsniveaus in Hunderten von Genen und Proteinen, die durch die Verfügbarkeit des Mikronährstoffs Zink beeinflusst wurden. Physiologisch führt dies zu einer tiefgreifenden Morphogenese für Mycobacterium smegmatis und einer signifikant hochregulierten oxidativen Stressantwort sowohl bei Mycobacterium smegmatis als auch bei pathogenen Mycobacterium tuberculosis. Dieses Protokoll befasst sich mit der Schwierigkeit, die Bedingungen für das Zink-limitierende Wachstum bei der Produktion von translational aktiven alternativen Ribosomen in Mykobakterien zu reproduzieren und zu standardisieren.
Wir beobachteten Faktoren, die außerhalb unserer Kontrolle lagen, wie z. B. ein Starkregenereignis, das mit Zinkkontamination und einer begrenzten Zinkmedienvorbereitung korrelierte. Der hier vorgestellte Bioindikator-Phänotyp gewährleistet die Reproduzierbarkeit von zinklimitierenden Wachstumsergebnissen. Der hier beschriebene quantifizierbare Bioindikator-Phänotyp ermöglicht es, zinklimitierende Bedingungen ohne den Einsatz von Chelatbildnern zu erreichen.
Daher ermöglicht es die standardisierte Herstellung einer translational aktiven alternativen Ribosomen und nachgelagerte Anwendungen wie Makrophagen oder Tierinfektionen zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Daher arbeitet unser Labor daran, die spezifischen Funktionen jedes alternativen ribosomalen Proteins zu verstehen und zu verstehen, wie sich der Einbau dieser Proteine in Ribosomen auf die Translation auswirken könnte. Und wir versuchen auch zu sehen, ob die Ergebnisse, die wir bei M.smegmatis sehen, auch auf MTB angewendet werden können und ob diese zur Entwicklung besserer TB-Behandlungen genutzt werden können.
Geben Sie zunächst fünf Milliliter 7H9-ADC-Medium in ein 50-Milliliter-Bioreaktorröhrchen. Fügen Sie dann 10 Mikroliter aufgetaute Glycerin-Stammzellen von Mycobacterium smegmatis hinzu und schrauben Sie den Deckel auf das Röhrchen. Positionieren Sie das Röhrchen fest in einem Winkel von etwa 45 Grad und inkubieren Sie es 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 120 U/min.
Messen Sie nach der Inkubation die optische Dichte bei 600 Nanometern und bestätigen Sie, dass sie bei etwa 0,5 bis 0,8 liegt. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 3000 x g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern zinkbegrenztem Medium (ZLM).
Während der Zentrifugation sterilisieren Sie eine Küvette, indem Sie sie mit 70 % Ethanol füllen, bis sie überläuft, und lassen Sie sie 10 Minuten ruhen. Spülen Sie die Küvette dann dreimal mit ZLM aus. Nach der abschließenden Zentrifugation wird das Zellpellet in zwei Millilitern ZLM resuspendiert.
Blanko das Spektralphotometer mit 600 Mikrolitern ZLM in einer Küvette. Übertragen Sie 600 Mikroliter gewaschener Zellen in die sterilisierte Küvette und messen Sie die Absorption bei 600 Nanometern. Wenn die optische Dichte über eins liegt, verwenden Sie die angegebene Formel.
Um das Volumen von ZLM zu berechnen, das zu den 600 Mikrolitern gewaschener Zellen in der Küvette addiert werden soll, um eine optische Dichte von eins zu erhalten, addieren Sie das berechnete Volumen von ZLM zur Küvette. Durch fünf- bis zehnmaliges Pipettieren gut mischen und die Extinktion erneut messen. Geben Sie anschließend 50 Milliliter ZLM in den sterilen, doppelt autoklavierten 250-Milliliter-Kunststoff-Erlenmeyerkolben.
Die Kolben werden mit 50 Mikrolitern der Kultur beimpft, die auf eine optische Dichte von eins aus der Küvette eingestellt sind. Für zinkreiche Medien fügen Sie 30 Mikroliter 10 millimolare Zinksulfate hinzu, um eine Endkonzentration von sechs Mikromolaren zu erreichen. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 100 U/min drei Tage lang, um die stationäre Phase zu erreichen.
Geben Sie an jedem Tag des Wachstums 200 Mikroliter Kultur in eine 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden und messen Sie die Wachstumsmetriken auf einem Monochromator-Mikroplatten-Reader. Um die von einem Mikroplatten-Reader erhaltene Zelldichte zu melden, generieren Sie eine Standardkurve, um den Messwert von der Weglänge unter Verwendung eines festgelegten Volumens in die standardmäßige Weglänge von einem Zentimeter umzurechnen. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 420 Nanometer und die Emission auf 475 Nanometer ein, um die Fluoreszenz des Cofaktors F420 zu messen.
Stellen Sie dann die Anregungswellenlänge auf 375 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 475 Nanometer ein, um die Hintergrundfluoreszenz zu messen. Erzeugen Sie einen Fluoreszenzintensitätsscan aus Anregung bei 230 Nanometern bis 440 Nanometern in fünf Nanometerschritten, mit fester Emission bei 475 Nanometern. Berechnen Sie anhand der folgenden Gleichung den prozentualen Anteil der Fluoreszenzintensität bei 375 Nanometern bis 420 Nanometern.
Um die Zelllänge nach drei Tagen aufzuzeichnen, reinigen Sie einen Objektträger und einen Deckglas mit einem fusselfreien Tuch. Pipettieren Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Kultur auf den Objektträger und legen Sie den Deckschirm auf. Drücken Sie vorsichtig auf den Deckglas, so dass sich die Kultur ausbreitet und fast den gesamten Bereich darunter ausfüllt.
Visualisieren Sie mit einem Kompositmikroskop mit 100-facher Ölimmersion und 10-fachen Okularobjektiven mit Kamerabefestigung den vorbereiteten Objektträger. Machen Sie Bilder von Bereichen mit mehreren Zellen, die in der Ebene scharf sind und sich nicht bewegen. Nehmen Sie mit demselben Mikroskop und Objektiv ein Bild eines Kalibrierungsobjektträgers auf.
Wählen Sie in der Fiji-Software das Werkzeug für gerade Linien aus und zeichnen Sie eine Linie über die Länge des Kalibrierungsobjektträgers. Wählen Sie Analysieren aus, gefolgt von Maßstab festlegen, und geben Sie die bekannte Entfernung in Einheiten für die Maßstabsleiste ein. Wählen Sie dann Global, um die Skala auf alle Bilder und Messungen anzuwenden.
Öffnen Sie nun das Bild und zeichnen Sie mit dem Werkzeug für gerade Linien eine Linie entlang der Länge der Zelle, um sie zu messen. Kopieren Sie die Zellenlängendaten aus dem Popup-Fenster in eine Tabelle oder speichern Sie sie als Datei mit kommagetrennten Werten für die statistische Analyse. Wildtyp-Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, zeigten niedrigere optische Dichtewerte im Vergleich zu zinkreichen Medien, wobei delta altRP-Stämme noch niedrigere Werte aufwiesen.
In ZLM-Wildtyp-Kulturen mit einer durchschnittlichen Zelllänge von neun Mikrometern wurde eine Zellverlängerung beobachtet, während zinkreiche Zellen mit etwa drei Mikrometern kürzer waren. Delta-AltRP-Zellen zeigten unter zinkbegrenzten Bedingungen keine signifikante Elongation. Fluoreszenzscans zeigten eine verminderte Cofaktor-F420-Fluoreszenz in ZLM-Wildtyp-Kulturen, wobei delta-altRP-Stämme eine viel höhere Fluoreszenzvariabilität aufwiesen.
