לפני תחילת assay, אנחנו צריכים לוודא כי ריאגנטים הבאים מוכנים כראוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט 50 מ&quot;מ הצפת אשלגן, pH 7.5. הכן באמצעות 11.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​phospate dibasic אשלגן, הידראט של מים מטוהרים והתאמת pH עם 1M HCl. פתרון זה ממוקם ב 37 מעלות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.65% משקל / נפח פתרון קזאין, שהוכן על ידי ערבוב של 6.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של קזאין ב חיץ 50 mM אשלגן זרחתי. בהדרגה הגדילו את הטמפרטורה פתרון עם ערבוב עדין 80-85 מעלות צלזיוס למשך כ -10 דקות עד פיזור אחיד מושגת. חשוב מאוד לא להרתיח את הפתרון. PH הוא מותאם אז אם יש צורך עם NaOH ו HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 110 חומצה Trichloroacetic פתרון מ&quot;מ, שהוכן על ידי דילול המניות 1:55 6.1N עם מים מטוהרים. חומצה Trichloroacetic היא חומצה חזקה יש לנהוג בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 mM Folin &amp;, או מגיב Ciolcaltea של פנול של Folin, המהווה את הפתרון יגיב עם טירוזין לחולל שינוי צבע למדידה יהיה קשור ישירות לפעילות של פרוטאזות. מגיב פנול של Folin היא חומצה וצריך לטפל בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתרן 500 mM פתרון קרבונט, שהוכן באמצעות 53 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של סודיום קרבונט anyhydrous של מים מטוהרים. פתרון diluent האנזים, אשר מורכב של 10 הצפת נתרן אצטט מ&quot;מ עם Acetate סידן 5mm, pH 7.5, בשעה 37 ° C. פתרון זה מה שאנו משתמשים בו כדי להמיס דגימות פרוטאז מוצק או לדלל פתרונות האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המניה 1.1 mM L-tyrosine תקן פתרון. הוכן באמצעות 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​L-tyrosine ב מטוהרים מים מחוממים בעדינות עד טירוזין נמס. כמו קזאין, אינם להרתיח את הפתרון הזה. אפשר תקן L-tyrosine כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. פתרון זה יהיה מדולל יותר כדי להפוך עקומת הרגילה שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטאז פתרון. מיד לפני השימוש, לפזר פרוטאז בפתרון diluent אנזים מוכן בשלב 6. </li></ol> במידת הצורך, להשתמש במדגם פרוטאז מוצק של פעילות קבועה מראש, אשר מומס באמצעות diluent האנזים 0.1-0.2 יחידות / מ&quot;ל. פתרון זה משמש כביקורת חיובית assay בקרת איכות כמו אימות עבור החישובים נבצע לקביעת פעילות האנזים. הגדרת Assay פרוטאז ועקומות רגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את זה assay, למצוא בקבוקוני מתאים אשר יחזיקו כ - 15 MLS. במשך כל אנזים זה תיבחן, 4 צלוחיות נדרשים. בקבוקון אחד ישמש ריק, ושלושה אחרים ישמשו לפעילות assay של שלושה דילולים של פרוטאז. שלושה דילולים שימושיים בעת בדיקת חישובים הסופית אחד נגד השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר כל אחד של ארבעה בקבוקונים, להוסיף 5mls של הפתרון שלנו 0.65% קזאין. תנו להם לאזן באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך כ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שונות כרכים של פתרון אנזים ייבדקו שלוש צלוחיות של מדגם הבדיקה, אך לא ריקה. מערבבים על ידי מתערבלים דגירה של 37 מעלות בדיוק עשר דקות. פעילות הפרוטאז והשחרור תוצאתי של טירוזין במהלך תקופה זו הדגירה היא מה יהיה נמדד בהשוואה בין דגימות הבדיקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה זה 10 דקות, מוסיפים את 5 ה-MLS של מגיב TCA על צינור אחד כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, להוסיף נפח מתאים של תמיסת האנזים צינור אחד, אפילו ריק, כך נפח הסופי של פתרון האנזים במבחנה כל 1 מ&quot;ל. הדבר נעשה על חשבון הערך ספיגת של האנזים עצמו כדי להבטיח את הנפח הסופי במבחנה כל שווה. דגירה הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה זה 30 דקות, ייתכן שתרצה להגדיר דילולים תקן טירוזין שלך. השתמש ב-DRAM 6 צלוחיות (צלוחיות DRAM ניתן להחליף עם צינורות פוליפרופילן) אשר יכול בקלות להחזיק 8 MLS. כדי שש צלוחיות, להוסיף את הפתרונות 1.1 mM טירוזין מניות רגיל עם הכרכים הבאים MLS: 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50. אין להוסיף שום תקן טירוזין על ריק. סטנדרטים התחתון עשוי להיות נחוץ עבור דגימות מבחן טמא שיניבו שינוי צבע קטנה. לאחר פתרון סטנדרטי טירוזין נוספה, להוסיף נפח מתאים של מים מטוהרים לכל הסטנדרטים להביא את נפח 2-MLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 30 דקות, לסנן כל הפתרונות מבחן ריק באמצעות 0.45 אממ polyethersulfone מזרק הסינון. סינון נדרשת להסיר כל insolubles מן הדגימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הסינון 2 MLS של דגימות בדיקה תסנין ריק 4 צלוחיות DRAM שיכול להכיל לפחות 8 MLS. אותו סוג של הבקבוקון שבו הסטנדרטים היו מוכנים ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל בקבוקונים המכילים את הסטנדרטים ריק רגיל, להוסיף 5mls של סודיום קרבונט. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מוסיפים 1 מ&quot;ל של ריאגנט של Folin מייד לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סודיום קרבונט להסדיר כל טיפה pH נוצר על ידי תוספת של מגיב של Folin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סודיום קרבונט על דגימות הבדיקה TESריק לא. פתרונות אלה הופכים מעונן לאחר תוספת של סודיום קרבונט. הוספת ריאגנט של Folin, אשר יגיב בעיקר עם טירוזין חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את בקבוקוני ה-DRAM ידי מתערבלים לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li></ol> לאחר דגירה זה, אתה צריך לשים לב שהסטנדרטים יש הדרגתיות של צבע correlating עם כמות של טירוזין הוסיף, הריכוזים הגבוהים ביותר של טירוזין המופיעים האפלים ביותר. ניתן גם לשים לב לשינוי צבע ניכר דגימות הבדיקה שלנו. 2mls של פתרונות אלה מסוננים באמצעות 0.45 אממ polyethersulfone מזרק לתוך cuvettes מסנן מתאים. כעת, assay מתבצע, אתה יכול להמשיך ספקטרופוטומטר כדי להקליט ספיגת הערכים שלנו. </li></ol> מדידת ספיגת ואת חישוב פעילות האנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספיגת של דגימות נמדד על ידי ספקטרופוטומטר באמצעות אורך גל של 660nm. נתיב האור מוגדר 1cm. הקלט את ספיגת ערכים של תקנים, תקן ריק, דגימות מבחן אחר, מבחן ריק. לאחר שכל הנתונים נאספו, עקומת סטנדרט ניתן ליצור. על מנת ליצור את עקומת, ההבדל בין ספיגת ריק תקן תקן חייב להיות מחושב. זהו ערך ספיגת לייחס סכום של טירוזין של פתרונות סטנדרטיים. לאחר החישוב הפשוט הזה, ליצור את עקומת סטנדרט באמצעות תוכנית גרפים לעלילה שינוי ספיגת הסטנדרטים שלנו על ציר Y, ​​לעומת הסכום micromoles עבור כל הסטנדרטים שלנו 5 על ציר ה-X. <table style="width: 416px; height: 118px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> נפח תקן טירוזין </th><th style="text-align:center"> uMoles טירוזין </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0.055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0.111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0.221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0.442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0.553 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי נקודות הנתונים הוזנו, ליצור קו בכושר הטוב ביותר ואת המשוואה מדרון המקביל. מצא את השינוי ספיגת בדגימות בדיקה על ידי חישוב ההפרש בין ספיגת במבחן מדגם ואת ספיגת ריק הבדיקה. הכנסת ערך ספיגת אחד של דגימות בדיקה למשוואה מדרון ופתרון תגרום micromoles של שחרור טירוזין במהלך התגובה הזאת proteolytic בפרט. כדי לקבל את הפעילות של האנזים יחידות מ&quot;ל /, לבצע את החישוב הבא: (ושווי טירוזין umole שוחרר) x (11) יחידות / מ&quot;ל אנזים = __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = סה&quot;כ נפח (ב מיליליטר) של assay 10 = שעה של assay (בדקות) לפי ההגדרה היחידה 1 = נפח האנזים (ב מיליליטר) של האנזים המשמש Volume 2 = (ב מיליליטר) המשמשים קביעת Colorimetric קח את מספר ושווי micromoles טירוזין שוחרר המתקבל המשוואה המדרון הכפל אותו ב מהנפח הכולל של assay ב-MLS, שבמקרה שלנו הוא 11mls. מחלקים ערך זה על ידי שלושה כמויות אחרות: הזמן של assay, אשר רצנו 10 דקות, נפח של אנזים המשמש assay, שהיה מגוונות (בואו להשתמש 1ml), נפח מ&quot;ל המשמש לגילוי colorimetric, אשר עשוי שונים המבוססים על קובט שלך. השתמשנו 2 MLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micromoles של טירוזין מחולק זמן מדידת התשואות דקות של פעילות הפרוטאז שנקרא &quot;יחידות&quot;. אנחנו יכולים לבטל את יחידות למדידת נפח במונה וגם במכנה, משאיר מדידה של פעילות האנזים במונחים של יחידות / מ&quot;ל. על מנת לקבוע את הפעילות מדגם פרוטאז מוצק מדולל diluent האנזים, אנו מחלקים את הפעילות שלנו ביחידות / ml ידי ריכוז מוצק המשמש assay זה במקור מ&quot;ג / מ&quot;ל. והותיר אותנו עם פעילות במונחים של יחידות / מ&quot;ג . יחידות / מ&quot;ל אנזים יחידות / מוצק מ&quot;ג = _____________________ מ&quot;ג מוצק / מ&quot;ל אנזים </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

הוכחנו רק אותך איך לנתח פעילות הפרוטאז באמצעות פעילות assay אוניברסלי של סיגמא פרוטאז. בנוסף, assay זו שימושית כדי להבטיח פרוטאזות שלנו קבעו דווקא פעילות לפני שתקבל אותם עבור הניסויים שלך. כפי שראיתם, בעת ביצוע הליך זה, זה בעל חשיבות עליונה לזכור חום הן קזאין ופתרונות טירוזין לאט, לא להרתיח אותם. כמו כן, זה קריטי כדי להכין את החסר שונה עבור שני תקני שלך למדגם כל מבחן שיש לך.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin &#38; Ciocalteu&#39;s Phenol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate, Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine, Free Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Profiler Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PP0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Fluorescent Detection Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PF0100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

פרוטאזות לשבור אג&quot;ח הפפטיד. במעבדה, היא לעתים קרובות צורך למדוד ו / או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. הלא ספציפית של סיגמא פעילות assay פרוטאז יכולים לשמש בהליך סטנדרטי כדי לקבוע את הפעילות של פרוטאזות, וזה מה שאנחנו עושים במהלך הליכי בקרת האיכות שלנו. ב assay זו, קזאין משמש מצע. כאשר אנו בודקים פרוטאז מעכל קזאין, טירוזין חומצה אמינית משוחרר יחד עם חומצות אמינו אחרות ושברי פפטיד. מגיב Folin ו Ciocalteus פנול, או של Folin בעיקר מגיב עם טירוזין חינם לייצר chromophore בצבע כחול, אשר לכימות ומדד כערך ספיגת על ספקטרופוטומטר. טירוזין יותר כי הוא שוחרר מבית קזאין, יותר chromophores נוצרים חזקה יותר פעילות של פרוטאז. ספיגת ערכים שנוצר על ידי פעילות של פרוטאז הם לעומת עקומת רגיל, אשר מופק על ידי מגיבים בכמויות ידוע של טירוזין עם מגיב FC לתאם שינויים ספיגת עם כמות של טירוזין ב micromoles. מתוך עקומת סטנדרט הפעילות של דגימות פרוטאז ניתן לקבוע במונחים של יחידות, המהווה את הסכום micromoles ושווי טירוזין שוחרר מבית קזאין לדקה. כדי להציג את המאמר הזה בסינית, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">לחץ כאן</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate at JoVE.com

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

פרוטאזות לשבור אג&quot;ח הפפטיד. במעבדה, היא לעתים קרובות צורך למדוד ו / או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. הלא ספציפית של סיגמא פעילות assay פרוטאז יכולים לשמש בהליך סטנדרטי כדי לקבוע את הפעילות של פרוטאזות.

סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

<a class="grey_button" href="/video/910">
ChineseVersion
</a>

sigma-s-non-specific-protease-activity-assay-casein-as-a-substrate

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Alcohols and Phenols

SCIENTISTS IN ACTION

76.0K Views.  Sigma Aldrich.  ChineseVersion 

Video: Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic mechanisms of proteolytic enzymes1-3. With the advent of mass spectrometry-based proteomics, the enzymatically-catalyzed incorporation of 18O-atoms from stable isotopically enriched water has become a popular method to quantitatively compare protein expression levels (reviewed by Fenselau and Yao4, Miyagi and Rao5 and Ye et al.6). 18O-labeling constitutes a simple and low-cost alternative to chemical (e.g. iTRAQ, ICAT) and metabolic (e.g. SILAC) labeling techniques7. Depending on the protease utilized, 18O-labeling can result in the incorporation of up to two 18O-atoms in the C-terminal carboxyl group of the cleavage product3. The labeling reaction can be subdivided into two independent processes, the peptide bond cleavage and the carboxyl oxygen exchange reaction8. In our PALeO (protease-assisted labeling employing 18O-enriched water) adaptation of enzymatic 18O-labeling, we utilized 50% 18O-enriched water to yield distinctive isotope signatures. In combination with high-resolution matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight tandem mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS/MS), the characteristic isotope envelopes can be used to identify cleavage products with a high level of specificity. We previously have used the PALeO-methodology to detect and characterize endogenous proteases9 and monitor proteolytic reactions10-11. Since PALeO encodes the very essence of the proteolytic cleavage reaction, the experimental setup is simple and biochemical enrichment steps of cleavage products can be circumvented. The PALeO-method can easily be extended to (i) time course experiments that monitor the dynamics of proteolytic cleavage reactions and (ii) the analysis of proteolysis in complex biological samples that represent physiological conditions. PALeO-TimeCourse experiments help identifying rate-limiting processing steps and reaction intermediates in complex proteolytic pathway reactions. Furthermore, the PALeO-reaction allows us to identify proteolytic enzymes such as the serine protease trypsin that is capable to rebind its cleavage products and catalyze the incorporation of a second 18O-atom. Such "double-labeling" enzymes can be used for postdigestion 18O-labeling, in which peptides are exclusively labeled by the carboxyl oxygen exchange reaction. Our third strategy extends labeling employing 18O-enriched water beyond enzymes and uses acidic pH conditions to introduce 18O-stable isotope signatures into peptides.

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Stable isotope labeling workflows employing 18O-enriched water (LeO-workflows) are versatile tools for quantitative and qualitative proteomics studies. In protease-assisted (PALeO) workflows, 18O-atoms are introduced by proteolytic cleavage and carboxyl oxygen exchange reactions mediated by proteases. In the acid-catalyzed (ALeO) workflow, 18O-atoms are introduced by carboxyl oxygen exchange at low pH.

פרוטאז וחומצת קטליזאטור זרימות עבודת תיוג המעסיק<sup&gt; 18</supמים&gt; O-מועשר

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...