הטכניקות הזימוגרפיות הנוכחיות מזהות מספר מוגבל של פרוטאזות. פפטיד פלואורסצנטי זימוגרפיה משתמש פפטידים פלואורסצנטיים כמו המצע המתכלה המאפשר מדידה של מגוון גדול יותר של פרוטאזות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא עיצוב מודולרי.
הרצף של הפפטיד הפלואורסצנטי קובע אילו פרוטאזות מזוהות ואת הפפטיד הפלואורסצנטי ניתן להחליף בקלות עם פפטיד של רצף אחר, יכולת לזהות פרוטאזות אחרות. טכניקה זו יכולה לעזור ליידע את העיצוב של השימוש בפפטידים כמקשרים צולבים מתכלים בביו-חומרים מהונדסים כגון אלה המשמשים לאספקת תרופות או יישומי הנדסת רקמות. שילוב של פפטיד זה בטכניקה זו יכול לזהות פרוטאזות מופרשות רקמות האחראיות על השפלה ביו-חומרית.
הדגמה של טכניקה זו חשובה על מנת לדמיין את הגישה מרובת השכבות הייחודית בהשוואה לטכניקות zymography אחרות. הדגמת טכניקה זו תהיה, אמיה פשמוק, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכן פתרון ג'ל לפתרון 10%polyacrylamide כמפורט בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט.
מיד לפני שופכים את הג'ל, מוסיפים את TEMED ו- APS. לאחר מכן, למלא ולרוקן 1.5 מילימטר מיני ג'ל קלטת באמצע הדרך עם פתרון ג'ל פתרון. מוסיפים שכבה דקה של isopropanol לראש ג'ל פוליאקרילמיד כדי לייצר ג'ל ברמה ולמנוע בועות.
השתמש בפתרון פוליאקרילמיד שאריות כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תגובת הפילמיזציה. כאשר הפוליאקרילמיד בצינור התגבש לחלוטין התגובה הושלמה. בעוד שכבת הג'ל הראשונה לפתרון היא פולמריזציה, יש לאחזר את ערכת Azido-PEG3-Maleimide מאחסון בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ולאפשר לרכיבים להגיע לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להמיס את הרכיבים של בקבוקון 2 בנפח המומלץ היצרן של DMSO. ומערבולת למשך 30 שניות כדי להבטיח שהנוזלים מעורבבים היטב. מעבירים את תכולת בקבוקון אחד לתוך נקי, יבש 100 מיליליטר עגול בקבוקון עגול המכיל בר ערבוב.
מיד להכניס פקק מחיצת גומי עם דיאפרגמה שניתן לנקב עם מזרק לתוך הפה של הבקבוק. לאחר מכן, הכנס שתי מחטי מזרק 18-מד לתוך הסרעפת. חבר את אחד ממחטי המזרק למיכל דלק אינרטי ואפשר לגז למלא את הבקבוק התחתון העגול במשך שלוש דקות.
לאחר מכן, לכבות את הגז אינרטי ולנתק אותו מהמחט. באמצעות מזרק, להזריק את התוכן המלא של בקבוקון 2 לתוך הבקבוקון. הסר את שתי המחטים ואת המזרק.
אפשר לרכיבים לערבב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב. לאחר מכן להסיר את פקק מחיצת גומי ולהעביר את התוכן לצינור נקי חמישה מיליליטר צנטריפוגה. לאחר שכבת הג'ל הראשונה לפתרון יש פולימרציה לשפוך את שכבת isopropanol.
מזלף מיליליטר אחד של מים מיונים על גבי הג'ל ולאחר מכן לשפוך את המים כדי לשטוף את הג'ל. יש לאחזר את הפפטיד הפלואורסצנטי התפקודי של תיול מאחסון ב-80 מעלות צלזיוס. אפשר לו להפשיר בטמפרטורת החדר.
הכינו פתרון ג'ל 10%-פתרון המכיל את מולקולת המקשר Azido-PEG3-Maleimide ואת הפפטיד הפלואורסצנטי כמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט. מיד לפני שפיכת הג'ל מוסיפים את ה- TMED וה- APS. לאחר מכן, ממלאים חצי מהחלק הנותר של קלטת הג'ל בתסמת הג'ל לפתרון פפטיד.
מוסיפים שכבה דקה של isopropanol לראש ג'ל פוליאקרילמיד כדי לייצר ג'ל ברמה ולמנוע בועות. השתמש בפתרון פוליאקרילמיד שאריות כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תגובת הפילמיזציה. לאחר השלמת התגובה, יוצקים את שכבת isopropanol.
מזלף מיליליטר אחד של מים מיונים על גבי הג'ל ולאחר מכן לשפוך את המים כדי לשטוף את הג'ל. אם לא משתמשים בג'לים מיד, מאחסנים אותם על ידי טבילתם בקופסת פלסטיק מלאה ב-100 מיליליטר של 1x PBS בארבע מעלות צלזיוס. עוטפים את התיבה בנייר אלומיניום כדי למנוע פוטובלאצ'ים.
תחילה, הכן פתרון ג'ל לערום של 5%כפי שמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט. מיד לפני שפיכת הג'ל מוסיפים את ה- TMED וה- APS. ממלאים את החלק הריק הנותר של קלטת הג'ל בתסמת ג'ל הערימה.
הכנס במהירות מסרק ג'ל 1.5 מילימטר לשכבת ג'ל הערימה כדי לוודא שאין בועות להישאר לכודים מתחת ל בארות. השתמש בפתרון פוליאקרילמיד שאריות כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תגובת הפילמיזציה. כאשר התגובה הושלמה, בעדינות להסיר את המסרק ואת הקלטת מהגב של קלטת ג'ל.
כדי להתחיל, להמיס דגימות במאגר מדגם zymography קונבנציונאלי. הוסף 400 מיליליטר os 1X טריס גליצן SDS פועל חיץ למנגנוני ג'ל. לטעון עד 35 microliters של מדגם לגם.
הפעל את הדגימות ב 120 וולט בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה וחצי או עד תקני המשקל המולקולריים מצביעים על כך פרוטאזות של עניין נמצאים בתוך שכבת ג'ל פתרון פפטיד. לאחר מכן, להסיר את הג'לים מתוך קלטת פלסטיק. לשטוף את הג'לים שלוש פעמים במאגר re-naturing בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה.
עם כל שטיפה, נמשך 10 דקות. מעבירים ג'לים לתתסיר חיץ מתפתח למשך 15 דקות. לאחר מכן החלף את הפתרון עם חיץ פיתוח טרי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה במשך 24 שעות.
לאחר מכן, השתמש בתמונה סורק ג'ל פלואורסצנטי עם מסנני העירור וההפחתה המתאימים כדי לדמיין את הג'לים. במחקר זה כדי פרוטאז פלואורסצנטי פפטידים מתכלים משולבים ג'לים פוליאקרילמיד. QGIW הוא רצף קולגן אחד נגזר שנועד לזהות קולגנזה הסלולר, בעוד LACW הוא רצף כי כבר אופטימיזציה לגילוי של MMP-14 ו MMP-11.
הדמיה פלואורסצנטית חושפת להקות רבות בתוך ג'ל הפפטיד LACW, בעוד שרק להקה אחת נראית בג'ל QGIW. בהשוואה לזימוגרפיה של ג'לטין, ג'ל LACW מסוגל לזהות רצועות פרוטאוליטיות יותר, מה שמדגים את היכולת של פפטיד זימוגרפיה לזהות מגוון רחב יותר של פרוטאזות הקיימות בדגימות ביולוגיות מאשר שיטות מסורתיות המשתמשות במצעים מקומיים. תאי פפטיד zymography הם דגירה אז במאגר פיתוח המכיל גם GM6001, ספקטרום רחב מעכבי MMP, או E64, מעכב קטפסין כללי.
טיפול בג'ל הפפטיד LACW עם GM6001, מקטין את עוצמת הרצועות. בעוד טיפול עם E64 אין השפעה ניכרת. הטיפול בג'ל הפפטיד QGIQ עם GM6001 גורם לאבלציה מלאה של הלהקות שנראו בעבר.
בעוד E64 אין השפעה. ג'לטין zymography מתבצע באמצעות מטוהר, מופעל MMP-9 כדי להשוות את הרגישות של פפטיד zymography לסטנדרט הזהב הנוכחי. ג'ל LACW מסוגל לזהות את הריכוזים הקטנים ביותר של MMP-9.
פרוטאזות דורשות תנאים ספציפיים כדי לטבע מחדש ולהיות מופעלות. בזהירות להכין את פתרונות המאגר כדי להבטיח כי הרכב PH נכונים. שיטה זו יכולה להיות משלימה על ידי טכניקות קיימות כדי לאמת את הזהות ולבצע ניתוח נוסף של proteases נמדד.
זה כולל סופג מערבי, PCR בזמן אמת, וספקטרומטריית מסה. להיות זהיר בעת טיפול פוליאקרילמיד. פתרון unpolymerized נחשב neurotoxin חזק וציוד מגן אישי המתאים תמיד צריך להיות משוחק בעת הטיפול בו.
