アッセイを開始する前に、我々は、以下の試薬が正しく準備されていることを確認する必要があります。 <ol><li> 50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.5の。カリウムphospate二塩基、水を精製し、1M HClでpHを調整するの三水和物11.4 mg / mlのを使用して準備します。この溶液を37で使用する° Cの前に配置されます。 </li><li> 50mMリン酸カリウム緩衝液中でカゼインの6.5 mg / mlに混合して調製した0.65％重量/容積カゼイン溶液、。均一な分散が達成されるまで徐々に緩やかに攪拌しながら溶液の温度は℃で約10分間80から85に増​​加した。それは解決策を沸騰しないように非常に重要です。 NaOHとHClで必要に応じてpHを調整されます。 </li><li>精製水を6.1Nの株式1時55分を希釈した110 mMのトリクロロ酢酸溶液を、。トリクロロ酢酸は強酸であり、取り扱いには注意してください。 </li><li> 0.5mMのフォリン＆Ciolcalteaの、または直接プロテアーゼの活性に関連する測定可能な色の変化を生成するチロシンと反応するソリューションですフォリンのフェノール試薬、。フォリンのフェノール試薬は酸であり、取り扱いには注意してください。 </li><li>精製水にanyhydrous炭酸ナトリウム53 mg / mlのを用いて調製した500mMの炭酸ナトリウム溶液、。 37 5mMの酢酸カルシウムと10mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH7.5、で構成される酵素希釈液を、℃のこのソリューションは、我々は固体プロテアーゼのサンプルを溶解または酵素液を希釈するために使用するものです。 </li><li> 1.1 mmのL -チロシン標準原液。精製水に0.2 mg / mlのL -チロシンを用いて調製し、チロシンが溶けるまで穏やかに加熱。カゼインと同様に、このソリューションを沸騰されません。 L -チロシン標準を室温に戻します。このソリューションは、当社の標準曲線を作成するためにさらに希釈されます。 </li><li>プロテアーゼ溶液。使用する直前に、ステップ6で準備酵素希釈液にプロテアーゼを溶解する。 </li></ol>必要に応じて、0.1〜0.2単位/ mlに酵素希釈液を用いて溶解されている所定の活動の固体プロテアーゼのサンプルを、使用してください。このソリューションは、品質管理アッセイの陽性コントロールとして、我々は酵素活性を決定するために実行する計算のための検証として提供しています。 プロテアーゼアッセイや標準曲線を設定する<ol><li>このアッセイを開始するには、約15 MLSを保持する適切なバイアルを見つける。テストされる各酵素について、4つのバイアルが必要です。 1バイアルは、空白として使用され、そして3人は、プロテアーゼの三希釈液のアッセイの活動に使用されます。お互いに最​​終計算をチェックする際に三希釈に便利です。 <ol><li> fourバイアルの各セットに、私たちの0.65％カゼイン溶液の5mlsを追加。それらを37℃の水浴中で平衡化させて° Cを約5分間。 </li><li>酵素の試験のサンプルバイアルの3つにテストされるソリューションではなく、ブランクの様々なボリュームを追加します。ちょうど10分間37 ° Cのために渦巻くとインキュベートして混合。このインキュベーション時間中のプロテアーゼ活性およびチロシンの必然的な解放は、測定および試験サンプル間で比較されるものです。 </li></ol></li><li>この10分間のインキュベーション後、反応を停止するには、各チューブにTCA試薬の5mlのを追加します。次に、各チューブ内の酵素溶液の最終体積が1ミリリットルになるように、、各チューブにさえブランクを酵素溶液の適切な量を追加します。これは、酵素自体の吸光度値を考慮すると、各チューブに最終容量が等しいかどうかを確認するために行われます。 37ソリューションをインキュベート℃で30分間。 この30分間のインキュベーションの間に、あなたのチロシン標準希釈液をセットアップすることもできます。簡単に8 MLSを保持できる6 DRAMバイアル（ドラムのバイアルは、ポリプロピレンチューブに置換することができます）を使用してください。 0.05、0.10、0.20、0.40、0.50シックスバイアルに、MLSに以下のボリュームで1.1 mmのチロシン標準のストック溶液を加える。空白に任意のチロシン標準を追加しないでください。下の規格は、ほとんど色の変化が得られる不純なテストサンプル用に必要になる場合があります。チロシン標準溶液を添加した後は、2 MLSのボリュームをもたらすための基準の各々に精製水の適切な量を追加します。 </li><li> 30分間のインキュベーションの後、試験溶液と0.45ミクロンポリエーテルスルホンシリンジフィルターを使用して空白の各フィルタをかける。ろ過は、サンプルから任意の不溶物を除去するために必要です。 <ol><li>少なくとも8 MLSを保持できる4ドラムバイアルにろ過2テストサンプルのMLSと空白のろ液を追加。規格が準備されたバイアルの同じタイプを使用することができます。 </li><li>規格と標準空白を含むバイアルのすべてに、炭酸ナトリウムの5mlsを追加。最良の結果を得るには、すぐ後にフォリン試薬1mlを加える。 </li><li>フォリン試薬の添加によって作成された任意のpHの低下を調整するために炭酸ナトリウムを追加。 </li><li>テストサンプルとTESに炭酸ナトリウムを追加tのブランク。これらのソリューションは、炭酸ナトリウムの添加後に濁ってくる。無料のチロシンと主に反応するフォリン試薬を、追加。 </li><li>渦巻きによってDRAMのバイアルを混合し、30分間37℃でインキュベートする。 </li></ol>このインキュベーション後に、基準がチロシン付加量と相関する色のグラデーションを持っていることに気付くはずです。チロシンの最高濃度は、最も濃い色に現れる。また、私たちのテストサンプルでかなりの色の変化に気づくことができる。これらのソリューションの2mlsは、適切なキュベットに0.45ミクロンポリエーテルスルホンシリンジフィルターを使用してフィルタリングされます。アッセイが行われるので、今度は私たちの吸光度値を記録するために分光光度計に進むことができます。 </li></ol>吸光度を測定し、酵素活性の計算<ol><li>サンプルの吸光度は、660nmの波長を用いて分光光度計によって測定されます。光パスは、1センチメートルに設定されています。規格、標準的な空白、別のテストサンプル、およびテストのブランクの吸光度値を記録します。すべてのデータが収集された後、標準曲線を作成することができます。曲線を生成するために、標準と標準のブランクの間の吸光度の差を計算する必要があります。これは、標準溶液中のチロシンの量に起因する吸光度の値です。この簡単な計算の後、Y軸上の私たちの基準の吸光度の変化に対し、X軸上の私たちの5標準の各マイクロモルの量をプロットするグラフプログラムを使用して標準曲線を作成します。 <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center">チロシン標準の音量</th><th style="text-align:center">チロシンuMoles </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0.055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0.111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0.221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0.442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0.553 </td></tr></tbody></table></li><li>データ点を入力したら、最高のフィット感と、対応するスロープ式のラインを生成する。 試験サンプルの吸光度とテストのブランクの吸光度との差を計算することにより、テストサンプルの吸光度の変化を見つける。スロープ式にテストサンプルの1つのための吸光度値を挿入し、解決することは、この特定のタンパク質分解反応中のチロシン解放のマイクロモルになります。 / mlあたり単位で酵素の活性を得るために、次の計算を実行します。 （umoleチロシン同等物が放出さ）×（11） 単位/ mlの酵素= __________________________________________ （1）×（10）×（2） アッセイの11 =総体積（ミリリットル） アッセイの10 =時間（分単位）単位の定義に従って 1酵素の酵素の=ボリューム（ミリリットル）を使用 比色定量に使用されている2 =ボリューム（ミリリットル） 斜面の方程式から得られるマイクロモルのチロシンに相当リリースの数を取り、我々の場合に11mlsであるMLS、のアッセイの合計量を掛けます。他の3つの量がこの値を分ける：（のは1ミリリットルを使用できるように）変化させた我々は10分間実行したアッセイの時間、、アッセイで使用される酵素の量、、比色検出に使用されるミリリットルの容積、これかもしれないあなたのキュベットに基づいて異なります。私たちは2 MLSを使用する。 </li><li> &quot;ユニット&quot;と呼ばれるプロテアーゼ活性の分収率の測定に時間で割ったチロシンのマイクロモル。私たちは、単位/ mlの条件で酵素活性のmeasurmentを残して、分子と分母の体積測定の単位を取り消すことができます。酵素希釈液で希釈した固体プロテアーゼのサンプルでのアクティビティを決定するために、我々はmg / mlで、もともとこのアッセイで使用される固体の濃度で単位/ mlで私たちの活動を割ります。、単位/ mgの面での活動を私たちに残して。 ユニット/ ml酵素 単位/ mgの固体= _____________________ MGソリッド/ mlの酵素 </li></ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

私達はちょうどシグマのユニバーサルプロテアーゼ活性のアッセイを用いてプロテアーゼ活性を分析する方法を示してきました。さらに、このアッセイでは、実験のためにそれらを受け取る前に、私たちのプロテアーゼが正確に活動を決定していることを確認するのに便利です。これまで見てきたように、この手順を実行するとき、それは徐々にではなく、それらを沸かすためにカゼインおよびチロシンソリューションの両方を加熱することを忘れないように極めて重要です。また、それは両方の規格のために、あなたが持っている各テストサンプルのための別のブランクを準備することが重要です。

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu&#039;s Phenol Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, Free Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

プロテアーゼはペプチド結合を切断。ラボでは、それはしばしば測定および/またはプロテアーゼの活性を比較する必要があります。シグマの非特異的プロテアーゼ活性のアッセイは、我々は品質管理の手順の中でやっているプロテアーゼの活性を、決定するために標準化された手順として使用できます。このアッセイでは、カゼインが基質として機能します。我々がテストしているプロテアーゼはカゼインを消化するときに、アミノ酸のチロシンが他のアミノ酸とペプチドフラグメントと一緒に遊離させる。フォリンとCiocalteusフェノール、またはフォリン試薬は、主に定量化し、分光光度計で吸光度値として測定される青色の発色団を、生成する無料のチロシンと反応する。カゼインから解放されより多くのチロシン、より多くの発色団が生成され、プロテアーゼの活性を強く。プロテアーゼの活性によって生成された吸光度はマイクロモルのチロシンの量と吸光度の変化を関連させるFC試薬とチロシンの既知量を反応させることによって生成された標準曲線と比較されています。標準曲線からタンパク質分解酵素サンプルの活性は、毎分カゼインから遊離チロシン同等物のマイクロモルの量である、ユニットの観点から決定することができます。 中国語のこの記事を表示するには、 <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">ここをクリック</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate at JoVE.com

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

プロテアーゼはペプチド結合を切断。ラボでは、それはしばしば測定および/またはプロテアーゼの活性を比較する必要があります。シグマの非特異的プロテアーゼ活性のアッセイは、プロテアーゼの活性を決定するために標準化された手順として使用できます。

シグマの非特異的プロテアーゼの活性アッセイ - 基質としてカゼイン

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

<a class="grey_button" href="/video/910">
ChineseVersion
</a>

sigma-s-non-specific-protease-activity-assay-casein-as-a-substrate

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Alcohols and Phenols

SCIENTISTS IN ACTION

76.3K ビュー.  Sigma Aldrich.  ChineseVersion 

ビデオ: Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

生化学

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

蛍光ペプチド ザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

がん研究

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

プロテアーゼ活性の画面に蛍光ペプチド胸の谷間アッセイ: アプリケーション コロナ ウイルスのスパイク蛋白質のアクティブ化

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

生物学

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

免疫・感染学

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

グルカンホスファターゼの基質結合を測定するためのコンカナバリンAベースの沈降アッセイ

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための、最小の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的な方法

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...

生物工学

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

プロテアーゼのタンパク質分解活性をスクリーニングするための蛍光性ペプチド切断アッセイ

1. Designing and Preparing the Peptides

	Acquire the sequence of the fusion protein of interest from a public database such as NCBI ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫診断

特殊なアッセイ

An In Vitro Assay for Measuring Neutrophil Serine Protease Activity Using a Fluorescent Reporter

Source: Frey, D. L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62193">Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an in vitro assay to quantify neutrophil serine protease activity in sputum samples. The sample containing secreted protease is incubated with a fluorescent reporter bearing a recognition motif. Cleavage of the motif by the protease enables individual fluorescence emission by the donor and acceptor fluorophore of the reporter, indicating protease activity in the sample.

蛍光レポーターを用いた好中球セリンプロテアーゼ活性測定のためのin vitroアッセイ

NOTE: The following protocols describe the sample preparation and the quantification of neutrophil serine proteases (NSPs) activity. The experimental ...

シグマの非特異的プロテアーゼの活性アッセイ - 基質としてカゼイン

文字起こし

要約

さらに動画を探す

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

蛍光ペプチドザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出

プロテアーゼ活性の画面に蛍光ペプチド胸の谷間アッセイ: アプリケーションコロナウイルスのスパイク蛋白質のアクティブ化

プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

グルカンホスファターゼの基質結合を測定するためのコンカナバリンAベースの沈降アッセイ

無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための、最小の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的な方法

プロテアーゼのタンパク質分解活性をスクリーニングするための蛍光性ペプチド切断アッセイ

蛍光レポーターを用いた好中球セリンプロテアーゼ活性測定のためのin vitroアッセイ

シグマの非特異的プロテアーゼの活性アッセイ - 基質としてカゼイン

文字起こし

要約

さらに動画を探す

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

蛍光ペプチド ザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出

プロテアーゼ活性の画面に蛍光ペプチド胸の谷間アッセイ: アプリケーション コロナ ウイルスのスパイク蛋白質のアクティブ化

プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

グルカンホスファターゼの基質結合を測定するためのコンカナバリンAベースの沈降アッセイ

無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための、最小の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的な方法

プロテアーゼのタンパク質分解活性をスクリーニングするための蛍光性ペプチド切断アッセイ

蛍光レポーターを用いた好中球セリンプロテアーゼ活性測定のためのin vitroアッセイ

蛍光ペプチドザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出

プロテアーゼ活性の画面に蛍光ペプチド胸の谷間アッセイ: アプリケーションコロナウイルスのスパイク蛋白質のアクティブ化