Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

Riepilogo

Trasporto retrogrado di colorante fluorescente etichetta una sotto-popolazione di neuroni basati su proiezione anatomica. Assoni con etichetta possono essere mirati visivamente In vivo, Permettendo registrazione extracellulare da assoni identificati. Questa tecnica facilita la registrazione quando i neuroni non possono essere etichettati con la manipolazione genetica o sono difficili da isolare con 'cieco' In vivo Approcci.

Abstract

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di registrare le risposte-unità singole da una popolazione di neuroni identificati. Nelle registrazioni elettrofisiologiche in vivo di singoli neuroni sono fondamentali per la comprensione di come i circuiti neurali funzionano in condizioni naturali. Tradizionalmente, queste registrazioni sono state effettuate 'cieco', intendendo l'identità della cellula registrata è sconosciuto all'inizio della registrazione. Identità cellulare può essere determinata successivamente via intracellulare ^1, juxtacellular ² o loose-patch ³ ionoforesi di colorante, ma queste registrazioni non può essere pre-mirati a specifici neuroni in regioni con tipi di cellule funzionalmente eterogenee. Proteine ​​fluorescenti possono essere espressi in modo specifico tipo cellulare permettendo visivamente a guida singola cellula elettrofisiologia ^4-6. Tuttavia, ci sono molti sistemi modello per cui questi strumenti genetici non sono disponibili. Anche in sistemi modello geneticamente accessibili, il PRO desideratomoter può essere sconosciuto o neuroni geneticamente omogenee può avere diversi modelli di proiezione. Allo stesso modo, vettori virali sono stati utilizzati per etichettare specifici sottogruppi di neuroni di proiezione ^7, ma l'uso di questo metodo è limitato dalla tossicità e la mancanza di specificità trans-sinaptica. Pertanto, sono necessari ulteriori tecniche che offrono specifiche di pre-visualizzazione per registrare da singoli neuroni identificati in vivo. Pre-visualizzazione del neurone bersaglio è particolarmente utile per le difficili condizioni di registrazione, per cui le registrazioni monocellulari classici sono spesso proibitivo ^8-11. La nuova tecnica descritta in questo articolo utilizza il trasporto retrogrado di un colorante fluorescente applicato utilizzando aghi di tungsteno per etichettare rapidamente e selettivamente uno specifico sottoinsieme di cellule all'interno di una particolare regione del cervello in base alle loro uniche proiezioni assonali, fornendo in tal modo un segnale visivo per ottenere registrazioni elettrofisiologiche mirate dai neuroni identificati in un intatto circuito withina vertebrato CNS.

Il romanzo progresso più significativo del nostro metodo è l'uso di marcatori fluorescenti per indirizzare specifici tipi cellulari in un sistema modello accessibile non geneticamente. Pesci debolmente elettrici sono un sistema ottimo modello per lo studio di circuiti neurali in sveglio, comportandosi animali ^12. Abbiamo utilizzato questa tecnica per studiare l'elaborazione sensoriale da "piccole celle" nel nucleo exterolateral anteriore (ELA) di pesci debolmente elettrico mormyrid. "Piccole celle" sono ipotizzate per essere in tempo comparatore neuroni importanti per rilevare differenze submillisecond nei tempi di arrivo dei picchi presinaptici ^13. Tuttavia, le caratteristiche anatomiche come mielina denso, sinapsi engulfing, e corpi cellulari piccoli hanno reso estremamente difficile per registrare da queste cellule con metodi tradizionali ^{11, 14.} Qui mostriamo che il nostro nuovo metodo etichette selettivamente queste cellule nel 28% dei preparativi, consentendo affidabili, registrazioni e caratte robustirizzazione delle risposte a stimoli electrosensory.

Protocollo

1. Preparare aghi Dye rivestite

1. Elettroliticamente affinare un micron di diametro filo di tungsteno ¹⁵ 160. Aghi diametro punta finale dovrebbero variare 5-50 micron. Il numero di aghi necessari dipende dalla dimensione della regione di essere etichettati. Abbiamo preparato 5 aghi per 3-5 iniezioni nel nucleo exterolateral posteriore (ELP).
2. La notte prima dell'esperimento, una goccia (<0,25 ml) di 2 mm destrano coniugato con Alexa Fluor 10.000 MW inchiostri a pigmenti sul distali 100 micron di ogni ago.
3. Lasciare gli aghi di aria secca a temperatura ambiente, senza colorante concentrato sulla punta. Memorizzare gli aghi a 4 ° C in un contenitore scuro per proteggerle dalla luce.

2. Preparare animali di Chirurgia

1. Indurre anestesia generale mettendo il pesce in una soluzione di 300 mg / L MS-222 in acqua serbatoio.
2. Pesare il pesce e la misura di lunghezza della forcella (punta del muso alla forcella di pinna caudale) e la profondità del corpo (massima dorso-Ventradistanza L nel piano trasversale). Queste misurazioni dovrebbero rientrare nei range indicato in Tabella 1 in modo che il pesce si inserisce all'interno di una camera di registrazione abbastanza piccolo da mettere sotto un obiettivo microscopio immersione in acqua (Figura 1).
3. Immobilizzare e zittire elettricamente il pesce, iniettando 100 ml di 3 mg / ml flaxedil nella muscolatura dorsale del corpo.
4. Riempire la camera di registrazione (Figura 1A), con serbatoio acqua. Posizionare il pesce ventrale rivolto verso il basso sulla piattaforma nel centro della camera (Figura 1). Fornire una soluzione aerata di 100 mg / L MS-222 usando un puntale posizionato nella bocca del pesce (1-2 ml / min). Stabilizzare il pesce con barre fissate in cera posizionati su entrambi i lati del corpo (Figura 1C). Monitorare la salute del pesce controllando il flusso di sangue continuo nei vasi oculari e un normale colore della carrozzeria.
5. Ruotare la piattaforma lungo il suo asse lungo ed abbassare l'estremità posteriore del platfOrm modo che un lato della superficie dorsale della testa del pesce è esposta sopra l'acqua, mentre il resto del corpo del pesce rimane sommerso. Un piccolo pezzo di Kimwipe deve essere posizionato su qualsiasi parte non sommersa della pelle contro l'essiccamento.

3. Chirurgia (Figura 2)

La procedura chirurgica di base qui descritta è ben consolidata e affidabile utilizzato per non vedenti nelle registrazioni in vivo su mormiridi ^16. Per altre applicazioni, esporre le regioni desiderati per l'etichettatura e la registrazione. La regione contenente terminali degli assoni delle cellule di interesse deve essere raggiungibile da un ago colorante rivestita. La regione contenente segmenti più prossimali di quegli stessi assoni deve disporre di spazio sufficiente sopra il tessuto per ospitare la distanza di lavoro della lente immersione in acqua (2 mm nostro caso).

1. Applicare una soluzione 0,4% di lidocaina alla superficie esposta della testata utilizzando un Q-tip.
2. Usando un bisturi, tagliare il perimetro di un pezzo rettangolare di pelle. Rimuovere il rettangolo utilizzando un paio di pinze. La dimensione del rettangolo si adatterà dimensioni pesci, ma dovrebbe essere di circa 3 mm x 5 mm per un pesce 6,2 cm (Figura 2A). Il bordo laterale del rettangolo dovrebbe allinearsi con il centro dell'occhio, il bordo anteriore del rettangolo dovrebbe essere solo posteriore e l'occhio, e il bordo mediale del rettangolo dovrebbe essere solo laterale della linea mediana del pesce.
3. Espandere la regione cranio esposto anteromedialmente per esporre un ulteriore 2,5 mm Area non sovrapposte quadrato (Figura 2B).
4. Tutto chiaro e asciugare la superficie esposta del cranio con la lama del bisturi per raschiare via qualsiasi tessuto e Kimwipes eccesso e aria forzata per asciugare la superficie (Figura 2C).
5. Incollare un palo di metallo alla regione antero-mediale cranio esposto usando Super Glue. Attendere fino a quando la colla è completamente asciutta (Figura 2D).
6. Rimuovere un rettangolo di cranio, circa 2 mm x 4 mm per un cm di pesce 6.2. Utilizzare un trapano dentistico con una ~ 0,5 millimetri di diametro palla mulino punta in metallo duro per assottigliare il perimetro del rettangolo. Poi, utilizzando un bisturi e pinze, tagliare il perimetro del rettangolo e buccia via per esporre il cervello sottostante. Perforazione supplementare o il taglio con forbici piccole possono essere necessarie per esporre completamente EL (Figura 2E). Se si verifica sanguinamento muscolare, un'unità elettrocauterizzazione può essere usato.
7. Tagliare sia la dura madre (pigmentato) e la pia madre (chiaro) con le forbici a molla o con un ago e rimuovere le parti tagliate con un paio di pinze. Le parti anteriore e posteriore del nucleo exterolateral (EL) sono ora visibili, ELA e ELP, rispettivamente (Figura 3A).

4. Marcatura retrograda degli assoni di interesse

1. Posizionare un manipolatore con un ago colorante rivestito (fatto nel passaggio 1) al di sopra della regione di destinazione contenente assoni di interest, nel nostro caso Elp.
2. Rapidamente inserire l'ago circa 25 micron nel tessuto. Attendere 15-30 secondi, fino a quando tutto il colorante è venuto fuori, e quindi ritrarre l'ago.
3. Ripetere con altri aghi freschi se necessario, mettendo ognuno in una posizione diversa, in modo che il colore è distribuito in tutta la regione di destinazione. Abbiamo usato 3-5 aghi per preparazione.
4. Sciacquare il colorante in eccesso dalla cavità con la soluzione di Ringer Hickman.
5. Attendere almeno 2 ore per l'assorbimento colorante e dei trasporti.

5. Visualizzazione degli assoni di interesse

1. Posizionare la camera di registrazione, insieme ai pesci, sotto l'obiettivo di un montante, fisso stadi microscopio ad epifluorescenza. Come il corpo del pesce occlude penetrazione della luce, fonti di luce sia bianchi e fluorescenti devono venire dall'alto. Posizionamento accurato di una sorgente di luce in fibra ottica al di sopra della cavità del cranio consente immagini campo chiaro soddisfacenti. Per una visualizzazione epifluorescenza, filtro a fluorescenzaspecifiche devono corrispondere l'assorbimento / emissione spettro del colorante.
2. Passare alla respirazione serbatoio acqua fresca e mantenere la stessa velocità di flusso. Posizionare un filo di terra nella cavità cervello esposto e collegare a terra del headstage registrazione (vedere 6.3).
3. Posizionare una coppia di elettrodi di registrazione vicino alla base della coda e collegarsi ad un amplificatore differenziale e dispositivo di registrazione (ad esempio monitor audio, oscilloscopio, o computer) per monitorare il comando scarico organo elettrico (EODC). Dopo il pesce recupera dalla anestesia, il EODC può essere utilizzato come indicatore della condizione del pesce.
4. Preparare un disegno in scala della regione del cervello visto a basso ingrandimento. Includere i principali vasi sanguigni come punti di riferimento (può variare da pesce a pesce) per identificare l'esatta posizione di etichettati assoni visibili solo sotto forte ingrandimento (Figura 3D).
5. Confermare il posizionamento colorante. Primo visualizzare tutto il tessuto con campo chiaro illuminazione per l'orientamento ( Figura 3A). Poi vedere con illuminazione fluorescente (Figura 3B). ELP avrà etichettatura diffusa (figure 3B e 3C). Ridurre al minimo l'eccitazione di fluorescenza per limitare gli effetti fotodinamica e fototossica del colorante.
6. Utilizzare i vasi come punti di riferimento per individuare ELA in alto ingrandimento. Illuminare con luce fluorescente durante la ricerca di un assone etichetta vicino alla superficie. (Figura 4).

6. Record di attività extracellulare

1. Tirare elettrodi di registrazione di aspirazione utilizzando uno millimetri OD, 0,58 millimetri ID borosilicato capillare di vetro con filamento. Ideale formato di punta dipenderà dal diametro degli assoni bersaglio, che nel nostro caso è 0,1-0,2 micron ^17. Per la nostra applicazione, diametro punta dell'elettrodo erano 1,5 ± 0,4 micron (range: 1,0-2,4 micron) con una lunghezza 5 mm, gambo stretto al fine di avvicinare gli assoni etichettati senza spostare il tessuto circostante densamente.
2. Riempire elettrodi con filtrati soluzione suoneria di Hickman. Finale resistenza punta è 45,2 ± 38,0 MW (range: 16-155 MW).
3. Posizionare l'elettrodo in un porta elettrodo con una presa di pressione e collegarlo a un headstage amplificatore montato su un manipolatore. Eseguire una linea di pressione della presa di pressione per un finale incrocio a T in un manometro e una siringa per il monitoraggio e il controllo della pressione, rispettivamente.
4. Collegare l'headstage ad un amplificatore e un dispositivo di acquisizione analogico-digitale.
5. Con 30 mbar di pressione verso l'esterno nella linea di elettrodo, posizionare un elettrodo accanto a un assone etichettato. Una telecamera livello di luce scarsa interfacciato con software di imaging è usato per visualizzare posizionamento pipetta. Avviare vicino alla superficie del tessuto e far avanzare l'elettrodo verso l'assone. Quando ci si avvicina l'assone, la pressione verso l'esterno dovrebbe causare un leggero, ma percettibile movimento del assone.
6. Mentre l'elettrodo si trova accanto al assone, (Figura 4A, in alto) registrare il potenteial all'elettrodo pur presentando stimoli prova (nel nostro caso, abbiamo utilizzato 100 msec monofasici impulsi trasversali positivi e negativi ad una intensità di 20 mV / cm; Figura 1A). I potenziali d'azione non dovrebbero essere osservate, anche se un artefatto elettrico conferma la corretta registrazione / stimolazione (Figura 4A, in basso).
7. Rilasciare la pressione verso l'esterno in elettrodo e ripetere la stimolazione / registrazione. I potenziali d'azione non dovrebbero ancora essere osservati (Figura 4B).
8. Applicare una leggera (125 ± 25 mbar) di aspirazione per l'elettrodo e la stimolazione / registrazione ripetuta. I potenziali d'azione dovrebbero ora essere osservate in risposta alla stimolazione (Figura 4C). Attività spontanea può anche verificarsi. In caso di inosservanza potenziali d'azione, rilasciare l'aspirazione, deselezionare l'elettrodo con una leggera pressione, spostare l'elettrodo leggermente, e tentare di nuovo di aspirazione. Una volta che i potenziali d'azione sono visibili, chiudere la linea di pressione.
9. Stimolare e registrare comedesiderato.

7. Terminazione e smaltimento

1. Una volta che tutte le registrazioni desiderate sono completi, passare alla respirazione con 100 mg / L MS-222 finché il EODC è fermato. No EODC dovrebbe essere rilevata per almeno 10 minuti.
2. Eliminare il pesce in base alle linee guida istituzionali e protocolli per la cura degli animali approvati.

8. Rappresentante dei risultati

Per la nostra applicazione particolare, siamo interessati a studiare stimolo di codifica da neuroni sensoriali centrali. Registrazioni di successo da assoni etichettati consentono l'analisi delle risposte-singola unità di stimolazione sensoriale ^18. Figura 5A mostra i potenziali di azione di rappresentanza evocati dalla stimolazione electrosensory trasversale con elettrodi bipolari situati sulla parte interna delle pareti sinistra e destra della camera di registrazione. Spike volte può essere presentato come un complotto raster picco (Figura 5B). A 25 msec pre-stimolo vento registrazioneome dimostra il basso livello di attività spontanea. Questo particolare ELA "piccola cella" è di lunga durata passare sintonizzato stimolo ad un'intensità di stimolo 6 mV / cm, aumentando il numero di picchi al ripetizione come stimolo durata aumenta (Figura 5C). La media primo picco di latenza è 4.28 ± 0.16 msec, coerente con la latenza prevista per le piccole cellule in ELA ^11.

Figura 1. Specifiche per una camera di registrazione che può andare bene sotto l'obiettivo di un microscopio epiflourescent fisso stadio. (A) camera di registrazione quadrati a scala fatta di plexiglass che mostra vista superiore, laterale e posteriore. Gruppi accoppiati di elettrodi stimolanti (asterischi) alla periferia permettono sia trasversale (rosso-nero) o stimolazione longitudinale (blu-giallo). Un pezzo aggiuntivo di plexiglass in un angolo, con un foro in gomma rivestita in centro (arancione),detiene una pipetta di aspirazione che mantiene un livello d'acqua costante. Due pali in acciaio inox verticali avvitati nel fondo della camera (verde fisso) si connettono a pali in acciaio inox (contorno verde) collegati alla piattaforma di sostegno del pesce (grigio chiaro, dettagliato in C) tramite morsetti a disco regolabili. Una fotografia della camera di seguito si riporta il disegno di scala. (B) viste individuali e montati dei morsetti circolari a disco in plastica utilizzati per fissare la piattaforma per i montanti verticali. Ogni morsetto disco ha una scanalatura (verde) per un post e un foro centrale per la vite di serraggio. Morsetti a disco sono ruotate in modo che i solchi perpendicolari tra loro. Serrando la vite (rosso) fascette i posti in atto per prevenire ulteriori verticale e il movimento di rotazione della piattaforma. (C) viste a scala frontale e laterale della piattaforma plexiglass utilizzato per contenere il pesce sul posto. La piattaforma è rivestita con uno strato di cera di paraffina (blu) che contiene dowe legnols (barre nere) in grado di sostenere il pesce. Tubi per respirating il pesce passa attraverso un foro nel 'testata' della piattaforma e termina in una punta di pipetta posizionato nella bocca del pesce. Un palo di acciaio testa inox (barra grigia) si connette alla piattaforma tramite un giunto a sfera che permette la rotazione di 360 gradi. Messaggi orizzontali in acciaio inox (verde) sono avvitati due estremità della piattaforma. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Schema di chirurgia guardando la superficie dorsale della testa. (A) Fare quattro tagli, nell'ordine indicato, per rimuovere un pezzo rettangolare di pelle (rosso). (B) Estendere l'apertura anteromedialmente per rimuovere un pezzo rettangolare supplementare della pelle (verde). (C) Raschiare eventuali residui di grasso o legamenti daspostando la lama di bisturi come indicato dalla freccia e asciugare completamente la superficie con Kimwipes e aria forzata. (D) Colla un alberino dell'acciaio inossidabile al cranio con Super Glue. Barra di scala in A vale per AD. (E) Utilizzare un trapano dentistico per fare quattro tagli, nell'ordine indicato, per rimuovere un pezzo rettangolare di osso (blu), esponendo i nuclei exterolateral anteriore e posteriore (ELA e ELP, rispettivamente) . Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Marcatura fluorescente nel nucleo exterolateral posteriore 3 ore dopo l'iniezione di destrano coniugato con Alexa Fluor 568. (A) I nuclei exterolateral anteriore e posteriore (ELA e ELP, rispettivamente) visualizzata con illuminazione in campo chiaro dall'alto. Notache l'ampio mielinizzazione entro ELA conferisce un aspetto relativamente brillante che la distingue da ELP. (B) La stessa area visualizzata utilizzando epifluorescenza visto attraverso un filtro TRITC. (C) Una immagine unita usando blu di A (campo chiaro) e rosso per B (TRITC). (D) Esempio di un disegno in scala di ELA e ELP compresi i vasi sanguigni principali (linee rosse) che possono essere utilizzati come punti di riferimento per individuare la posizione esatta del etichettati assoni visibili solo sotto forte ingrandimento (la posizione esatta dei vasi sanguigni varia da pesce a pesce). La linea tratteggiata indica il confine tra ELA e ELP. (E) Esempi di immagini acquisite utilizzando un filtro TRITC da 5 diverse preparazioni che illustrano una serie di modelli di successo in materia di etichettatura di piccoli assoni delle cellule e Somas in ELA.

Figura 4. Singola unità di registrazione extracellulareda un assone etichettato. (A) elettrodo di registrazione (punta di freccia) sotto pressione positiva collocata adiacente ad un piccolo assone cella etichettata in ELA (in alto) registra solo bordo artefatto (punte di freccia), in risposta a un 100 msec 20 mV / cm monofasici, controlaterale-positivo, impulso quadrato trasversale (in basso). (B) Rilasciando pressione verso l'esterno dall'elettrodo (testa di freccia) causa l'assone di spostare leggermente verso l'elettrodo (top) ma ci sono ancora nessuna risposta allo stimolo (in basso). ( C) pressione negativa Lieve tira l'assone in elettrodo (in alto, punta di freccia) e potenziali d'azione in risposta a stimoli esordio sono ora visibili (in basso, asterisco). Porzioni di fondo di tutti e tre i pannelli sono risposte sovrapposti a 20 ripetizioni dello stimolo.

Figura 5. Rappresentante dei risultati con questa tecnica. (A) 5 tracce di esempioche mostra i potenziali d'azione evocati da una 0,1 msec 6 mV / cm monofasici, controlaterale-positivo, trasversale stimolo impulso quadrato. (B) trama raster che mostra gli orari picco nel corso di 20 ripetizioni di una finestra di registrazione di 75 msec per la stessa unità stimolato al tempo 0 con 6 mV / cm stimoli alla gamma di durate elencate a destra. (C) curva di accordatura Durata quantificare le risposte visualizzate nel raster come picchi al stimolo ripetizione.

	Massa (g)	Lunghezza della forcella (cm)	Profondità del corpo (cm)
Significare	2.42	6.20	1.14
Deviazione standard	0.64	0.52	0.18
Gamma	1,2-4,0	5,5-8,4	0,9-1,6

Tabella 1. Ottimaleprofondità peso, lunghezza e profondità compresa corpo per i pesci. peso ottimale, lunghezza della forcella (punta del muso alla forcella di pinna caudale) e corpo (massima distanza dorso-ventrale nel piano trasversale) varia permettendo di pesce per adattarsi alla camera di registrazione illustrata nel figura 1. Pesci che sono troppo piccoli può essere meno probabilità di sopravvivere alla chirurgia e avrà un piccolo ELP, rendendo il posizionamento colorante impegnativo. Pesci che sono troppo grandi avrà un grande, cervelletto più ampio respiro in grado di ridurre l'accesso ai ELA e Elp e può impedire l'abbassamento della potenza, obiettivo di alta acqua-immersion abbastanza vicino a concentrarsi su ELA e Elp.

Applicazione del sito	Dye Tipo	Pesce tentò	Etichetta in ELA	Etichetta in Elp	Unità di tentato	Registrazioni
ELun	Alexa Fluor iniezione	32	26 (81.2%)	19 (59.4%)	50	4 (8,0%)
ELA	Alexa Fluor imbevuto carta da filtro	1	0	0	0	0
ELA	Di-I in DMSO	8	6 (75,0%)	0	0	0
ELA	Di-O cristalli	5	3 (60,0%)	2 (40,0%)	9	0
Elp	Solid Alexa Fluor cristalli	2	0	2 (100%)	0	0
Elp	Alexa Fluor fili di tungsteno rivestiti	43	29 (67,4%)	41 (95,3%)	119	26 (21,8%)

Tabella 2. Le percentuali di successo per ogni metodo di iniezione di colorante. Tassi di successo per ogni metodo di iniezione di colorante. Metodi sono divisi in base ai sito di iniezione e tipo di colorante. Per ogni metodo, il numero totale dei pesci di tentativo e la percentuale di questi esperimenti che ha provocato l'etichettatura successo in ELA e Elp è mostrato. Notare che l'area di registrazione mirata è l'opposto del sito di applicazione (caselle in grassetto). Per il sito di iniezione, l'assorbimento colorante è stato considerato di successo con l'etichettatura di entrambi somas e assoni. In contrasto, nel sito di registrazione, solo preparazioni assoni etichettati stati contati come esperimenti di etichettatura di successo. Vengono visualizzati anche il numero totale di unità di tentativi e la percentuale di queste unità che ha portato in registrazioni di successo.

	# Di iniezione scTES	Volume medio di iniezione (ml)	Gamma di volumi per iniezione (ml)	Volume di iniezione totale media (ml)	Gamma di volumi di iniezione totale (ml)
Microinjector con Hamilton	3 o 4	0.144	,091-0,91	0.516	0,378-0,669
Nanoinjector con pipetta di vetro	2 - 4	0,069 (fisso)	Volume fisso iniettato 1-6 volte	0,621	0,414-0,966
Microiniettore con pipetta di vetro	2-6	0.093	0,058-0,202	0.360	,252-,540

Tabella 3. Quantitativi di tintura usato per ciascuno dei tre metodi usati per iniettare Alexa Fluor in ela quantità di tintura usato per ciascuno dei tre metodi utilizzati per iniettare Alexa Fluor in ELA (primo metodo da tabella 2). Iniezione di mezzo di contrasto in ELA è stata eseguita sia con un nanoinjector e un microinjector utilizzando un 33 gauge siringa Hamilton ago o un bicchiere pipetta capillare tirato. Abbiamo variato il numero di siti di iniezione, il volume per iniezione e il volume totale di iniezione di colorante.

Discussione

Una volta padroneggiata, questa tecnica permetterà uno a bersaglio i neuroni identificati, tra cui i singoli assoni, per registrazioni in vivo in molti sistemi modello. Inoltre, questa tecnica permette di registrare attendibilmente uscita spike da neuroni con caratteristiche anatomiche uniche che rendono tradizionali metodi di registrazione in vivo impegnativo. Abbiamo utilizzato questa tecnica per registrare da Ela "piccole cellule" in mormyrid pesci debolmente elettrico. I precedenti tentativi di studiare le proprietà di sintonia di "piccole celle" non hanno avuto successo a causa di condizioni di ripresa difficili ^{11, 14.} Caratteristiche anatomiche simili creano ostacoli all'ottenimento di registrazioni singola unità da molti uditivo vertebrati diversi e neuroni electrosensory ^8-10. Per superare queste sfide nel nostro sistema, abbiamo approfittato del fatto che "piccole celle" sono le uniche cellule in ELA che proiettano a Elp. Così, trasporto retrogrado di colorante collocato in Elp limita etichettatura in ELA "piccolocellulari "somas e assoni. etichettatura fluorescente degli assoni consentito il posizionamento degli elettrodi preciso vicino al assoni etichettati, effettuare registrazioni singola unità di cellule identificate possibili nonostante somas inaccessibili. Abbiamo tentato registrazioni somatiche, ma non hanno avuto successo, probabilmente a causa delle circostanti sinapsi engulfing ^{11 , 17.} Tuttavia il marchio somatica era chiaramente visibile suggerendo che questa tecnica potrebbe essere utilizzato per mirare registrazioni somatiche in altri tipi cellulari e altri circuiti. etichettatura fluorescente di neuroni attraverso trasporto retrogrado in vivo è stato usato per guidare registrazioni mirate in vitro ^19-21 . Una tecnica simile è stata utilizzata per la mirata in registrazioni dal vivo motoneuroni zebrafish midollo spinale ^22. nostro lavoro rappresenta una nuova espansione di questo approccio, in cui sia l'etichettatura e la registrazione sono fatte in vivo all'interno del cervello. nostro metodo dimostra che in vivo etichettatura delle aree del sistema nervoso centrale con un retrogrado tcorridore può essere ampliato per lo studio di altri circuiti intatti con i neuroni di proiezione allo stesso modo selettivo. Per esempio, in elaborazione uditiva mammiferi, il collicolo inferiore (IC) serve come un centro importante relè per ingressi da più strutture rhombencephalic ^23. Iniezione di colorante nella IC avrebbe etichettare selettivamente le cellule di proiezione da ciascuno di questi nuclei. Il collicolo superiore (SC) ha una funzione simile per la visione ^24. Preparazioni midollo spinale sono particolarmente adatti per questa tecnica, come il midollo spinale è facilmente accessibile, iniezione colorante può verificarsi lontano dal sito di registrazione, e può essere combinato con registrazione intracellulare e riempimento dei neuroni selezionati per acquisire informazioni più dettagliate anatomico ^25. Infine, tratto-tracing è una tecnica ben consolidata utilizzata in tutto il sistema nervoso centrale per mappare circuiteria complessa ^26. Il nostro metodo può essere utilizzato per aggiungere informazioni funzionali a questi studi come è stato fatto wIndicatori di calcio-sensibili esima in gatto corteccia visiva ^27.

L'intervento, che è ben stabilita, affidabile, e regolarmente utilizzati per ciechi in vivo registrazioni ^16, deve essere completato con minimo sanguinamento e nessun danneggiamento della superficie del cervello per consentire l'animale e il tessuto di sopravvivere. Con la pratica, l'applicazione chirurgia e colorante può essere completato in 30-45 minuti. Abbiamo etichettato con successo "piccole cellule" assoni nel 67% dei preparativi. La maggior parte dei preparativi sono solo 1 o 2 assoni etichettati visibili, ma alcuni hanno ben 8. Delle 119 unità etichettati tentato, abbiamo ottenuto le registrazioni singola unità da 26 unità distribuite su 12 preparati (Tabella 2). Pertanto, i dati sono stati raccolti da 41% di preparazioni assoni etichettati per una percentuale di successo del 28%.

L'aspetto critico di applicazione colorante viene etichettando profondità. Inserimento superficiale del filo di tungsteno comporterà il colorante essendo aw lavatoay. Tuttavia, se la penetrazione è troppo profonda, assoni etichettati non saranno visibili per il targeting. Inoltre, alcuni danni meccanici alla cella deve verificarsi per la tintura di essere adeguatamente ripreso ^{25, 28.} Tuttavia, troppi danni uccide le cellule. Abbiamo tentato di etichettatura con altri coloranti e altri metodi (Tabella 2), tra cui l'etichettatura anterograda attraverso iniezione colorante in ELA in coppia con la registrazione da assoni etichettati a Elp (Tabella 3). Ipotizziamo che l'etichettatura anterograda non è riuscita perché l'etichettatura è stata limitata alle cellule con danni somatici, rendendoli insensibili. Inoltre, i terminali presinaptici possono essere stati disturbati. Al contrario, marcatura retrograda minimizza sia di queste preoccupazioni. La quantità e la posizione di applicazione colorante possono essere modificati secondo la particolare circuito studiato. Etichettatura massima si verifica con la maggiore concentrazione di colorante, che abbiamo realizzato con fili di tungsteno rivestiti. Tuttavia, per l'etichettatura di assoni con deproiezioni ep, colorante può venire fuori un ago di tungsteno in quanto è avanzato. In questi casi, la pressione di iniezione sarebbe più appropriato. Assorbimento della tintura e il trasporto sono rapidi, con assoni etichettato la nostra preparazione e sia ben visibile fin da 2 ore dopo l'iniezione e ulteriori assoni etichettati appaiono più tardi sei ore dopo l'iniezione. Pertanto, l'etichettatura e la registrazione può essere realizzato in un solo giorno, eliminando le difficoltà tecniche connesse con la chirurgia sopravvivenza. Timing varierà per ogni applicazione a seconda della distanza necessaria per il trasporto colorante.

Un altro aspetto critico è il posizionamento degli elettrodi. È importante immettere il tessuto vicino al sito dell'assone marcato per evitare l'ostruzione della punta. Per il tessuto denso come in ELA, un lungo, gambo sottile sulla elettrodo di registrazione minimizza eccesso movimento del tessuto circostante. Se una registrazione di successo non si ottiene al primo tentativo, ripetere con elettrodi freschi fino a una registrazione si ottiene o il papue è interrotto al punto in cui l'assone non è più visibile. Tuttavia, è anche importante per velocemente l'elettrodo vicino alla assone per minimizzare la quantità di esposizione fluorescente, che può causare fototossicità, candeggio e possono influenzare le proprietà fisiologiche della cellula ^29-31.

Una volta che un segmento di assone viene aspirato con successo nella elettrodo di registrazione, le registrazioni possono essere ottenuti per diverse ore. Se le unità sono sempre persi in meno di 1 ora, considerare la possibilità di punte degli elettrodi più piccoli per evitare l'assone di scivolare fuori. D'altra parte, troppo piccola di una punta può provocare l'intasamento, bassa segnale-rumore, o danni al assone. Una diminuzione costante nel picco di ampiezza e il 'ritorno' di una unità con l'aggiunta di aspirazione è un'indicazione che la punta è troppo grande. Troppo aspirazione può causare danni irreparabili al assone. Una soluzione è quella di consentire una piccola perdita nella linea aria quindi la pressione lentamente ritorna a zero. Rapidamente equalizzazione Thpressione e si tradurrà in un parente-esteriore 'push' transitoria che può espellere l'assone.

Sebbene questa tecnica rappresenta un grande vantaggio per l'ottenimento di registrazioni mirate di neuroni di proiezione identificati, non sarà utile per distinguere interneuroni locali, come colorante sarebbe assorbito da tutti i tipi di cellule nel sito di iniezione. Teoricamente, l'uso di più fluorofori con siti di iniezione può consentire questo metodo per essere espanso. Per esempio, il confronto di singolo-versus doppia etichettatura potrebbe essere utilizzata per distinguere interneuroni da neuroni di proiezione successivo alla doppia iniezioni in due punti del circuito ^32. Allo stesso modo, traccianti retrogradi può essere combinato con altre tecniche di imaging avanzate, come ad esempio due fotoni di imaging, come è stato fatto recentemente in diamante mandarino Alta centro Vocal (HVC) ^32. Inoltre, le regioni di registrazione sono limitate a quelle vicino alla superficie quando si usano microscopi epifluorescenza, come siamo stati solo in grado di risolvere 1 μ strutture m entro i primi 30 micron di tessuto. Tuttavia, questa profondità potrebbe essere esteso mediante l'uso di altre tecniche di microscopia, come la microscopia a due fotoni ³³ o oggettiva-accoppiato planare illuminazione microscopia ^34. Complessivamente, questa tecnica rappresenta un avanzamento importante nello studio dei circuiti neurali in vivo perché può essere utilizzato per registrare da singoli neuroni in molti circuiti diversi in una varietà di sistemi modello - compresi quelli che sono relativamente inaccessibile.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine Methanesulfonate	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Gallamine Triethiodide	Sigma-Aldrich	G8134	Flaxedil
Lidocaine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	L5647
Hickman’s Ringer Solution	NA	NA	NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)
Peristaltic Pump	Gilson or Rainin	Minipulse 3 Model 312; RP-1	10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter
Dissection Microscope	Nikon	SM2645
Super Glue	Super Glue Corporation	SGH2	2g tube
Omni Drill 35	World Precision Instruments	503-598
Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4	World Precision Instruments	501860	0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm)
Low Temp Cautery Kit	World Precision Instruments	500391
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Dextran Conjugated Alexa Fluor 568	Invitrogen	D-22912	2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings
Epifluorescent Microscope	Nikon	E600 FN	A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths
Low Power Objective	Nikon	93182	CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm
High Power Objective	Nikon	93148	CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm
White Light Source	Dolan-Jenner	Model 190	Fiber Optic Illuminator
Fluorescent Light Source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q
Low-light Level Camera	Photometrics	CoolSnap ES
Digital Manometer	Omega Engineering	HHP-201
Motorized Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Headstage	Molecular Devices	CV-7B	Axon Instruments
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	Axon Instruments
Data Acquisition System	Molecular Devices	Digidata 1322A	Axon Instruments
Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems	2100
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97	Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ’0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament
Pipette Glass	World Precision Instruments	1B100F-4	Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID)