Un modello di Piglet neonatale Hypoxic-ischemica Encefalopatia

Riepilogo

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Abstract

L'asfissia di nascita, che provoca ipossico-ischemica encefalopatia (HIE), incide per 0,66 milioni di morti nel mondo ogni anno, circa un quarto dei 2,9 milioni di morti neonatali nel mondo. Modelli animali di HIE hanno contribuito alla comprensione della fisiopatologia di HIE, e hanno messo in evidenza il processo dinamico che si verificano lesioni cerebrali a causa di asfissia perinatale. Così, studi su animali hanno suggerito una finestra di tempo per strategie di trattamento post-insulto. L'ipotermia è stato testato come trattamento per Holiday Inn Express in modelli pdiglet e successivamente dimostrato efficace in studi clinici. Varianti del modello sono stati applicati nello studio di metodi neuroprotettive adiuvanti e studi suinetti di xeno e melatonina hanno portato alla fase clinica I e II della sperimentazione ^1,2. Il modello porcellino HIE è ulteriormente utilizzato per studi resuscitation- e emodinamici neonatali nonché in ricerche di anossia cerebrale a livello cellulare. Tuttavia, è tecnicamente difficileModello e variazioni nel protocollo può provocare o lesione cerebrale troppo lieve o troppo severa. In questo articolo, abbiamo dimostrato le procedure tecniche necessarie per la creazione di un modello stabile di maialino neonatale HIE. In primo luogo, il maialino neonato (<24 ore vecchio, mediano peso 1500 g) è anestetizzato, intubato, e monitorato in una configurazione paragonabile a quella che si trova in una terapia intensiva neonatale. Globale ipossia-ischemia è indotta abbassando la frazione di ossigeno inspiratorio per raggiungere ipossia globale, ischemia attraverso l'ipotensione e un EEG ampiezza linea piatta integrata (AEEG) indicativa di ipossia cerebrale. La sopravvivenza è promosso regolando l'ossigenazione in base alla risposta aEEG e la pressione sanguigna. Lesione cerebrale è quantificato istopatologia e la risonanza magnetica dopo 72 ore.

Introduzione

L'asfissia perinatale è una condizione grave e spesso imprevisti associati con ipossico-ischemica encefalopatia (HIE). L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare un modello di sopravvivenza dei suinetti di encefalopatia ipossico-perinatale ischemica. Questo modello può essere utilizzato per studiare l'effetto di vari gradi di ipossia-ischemia sul cervello neonatale e di trattamenti sperimentali in neuropatologia, la risonanza magnetica e spettroscopia (MRI e MRS) e biomarcatori nei fluidi corporei come sangue, liquido cerebrospinale e nelle urine . Il modello è anche dimostrato utile per studiare il sistema cardiovascolare, respiratorio, fegato e rene, i quali sono interessati in globale ipossia-ischemia.

L'asfissia perinatale è il risultato di compromessi intrapartum apporto di ossigeno o nel periodo immediatamente successivo al parto. Intrapartum eventi ipossia rappresentano 0.660.000 di morti nel mondo ogni anno, circa un quarto dei 2,9 mulino del mondosono stati stimati morti neonatali ioni nel 2012 ^3. Nel 2010 1.150.000 bambini per aver sviluppato encefalopatia neonatale seguente asfissia neonatale ^4. HIE definito come encefalopatia nei bambini nati dopo 34 settimane di gestazione avviene in 1-3 / 1000 nati vivi ⁵ nel mondo industrializzato e fino a 8,5 / 1000 nati vivi nei paesi in via di sviluppo ^4. Il rischio di morte è 10-60%, e il rischio di disabilità neurologica nei sopravvissuti 30-100% ^6,7. 50,2 milioni di anni di vita adattati alla disabilità (DALY) sono attribuiti a eventi di ipossia intrapartum ^4. Attualmente l'unico trattamento diverso da quello di sostegno per HIE è ipotermia post-ipossica. Così, i progressi nelle procedure diagnostiche e strategie di trattamento sono essenziali per migliorare la gestione di HIE ^8.

Il miglioramento della prognosi dopo l'asfissia e la gestione del danno cerebrale perinatale neonatale si basano sulle ampliare la conoscenza dei meccanismi della malattia sottostante und trattamenti possibili. Modelli animali di HIE sono particolarmente utili come diversi eventi clinici possono portare a HIE e l'incidenza in ogni singolo centro di nascita è basso ^5. Un apparato sperimentale in cui l'influenza di variabilità biologica può essere minimizzato, è essenziale quando il test di nuovi strumenti prognostici e diagnostici e strategie di trattamento. Un modello animale dovrebbe approssimare la situazione clinica più vicino possibile, contribuendo così alla comprensione dei meccanismi patologici sottostanti il danno indotto e il processo dinamico coinvolto nella malattia e IT'S esito ^9. Modelli animali di neonatale HIE hanno incluso un numero di specie, tra cui i roditori, agnello, e suini. In confronto, il maialino neonato ha maggiore somiglianza con un neonato umano rispetto alle dimensioni, sistema cardiovascolare ¹⁰ e la maturità cervello al momento della consegna ^11,12. Monitoraggio, strumentazione e valutazione dei risultati del modello maialino è simile a that, impiegate nella cura clinica dei bambini con HIE. Di conseguenza, vi è un elevato grado di traduzione in assistenza neonatale da questo modello.

Suinetti modelli di ipossia perinatale e HIE sono utilizzati da molti gruppi e variano in una serie di settori ^13. Secondo lo scopo dell'esperimento, attenzione deve essere posta nella scelta dei farmaci, metodo per indurre ipossia-ischemia, metodo di controllo della durata insulto e la gravità, post-insulto rianimazione e cure, e valutazione dei risultati. Per evitare distorsioni di un disegno randomizzato dovrebbe sempre essere usato negli studi interventistici.

Il metodo applicato quando si induce il danno ipossico-ischemica è importante. Ipossia globale portando a HIE spesso si traduce in insufficienza multiorgano che coinvolgono il cervello, cuore, polmoni, reni e fegato. A seconda dei risultati valutati, modelli di HIE dovrebbero basarsi su ipossia globale e ischemia piuttosto che contare su ischemia focale, ad es., Per la legatura di autoarterie otid ^14. Un recente applicata una combinazione di ipossia (FiO ₂ 12%) e l'arteria carotidea compressione mantenendo pressione arteriosa media> 40 mm Hg ^2. Un altro gruppo indotta ipossia globale dell'8% O ₂ fino a base negativa in eccesso> 20 mmol / L o la pressione arteriosa media arteriosa (MABP) <15 mm Hg, e sacrificato gli animali a 4 ore ^15. L'ipossia è stato anche titolata per gittata cardiaca (al 30-40% del valore basale), MABP (a 30-35 mm Hg) e pH arterioso (6,95-7,05) ^16.

Tutti i modelli di global ipossia-ischemia titolati dalla soppressione aEEG simile a quella presentata in questo rapporto, hanno dimostrato encefalopatia nel trattamento clinico, elettrofisiologicamente, e neuropatologicamente paragonabile alla condizione trovata nel neonato asfittico termine ^17,18.

Il grado di HIE indotta è essenziale. Un modello utile di HIE animale deve anche permettere la sperimentazione di nuovi diale procedure e le opzioni di trattamento gnostico. A tal fine, i modelli dovrebbero indurre HIE moderato dove c'è un potenziale trattamento gravi lesioni cerebrali con poco o nessun potenziale trattamento sarebbe meno rilevante in sede di valutazione di nuovi trattamenti. La tolleranza all'ipossia varia considerevolmente tra gli animali di prova. Precedenti studi hanno dimostrato che una lesione cerebrale più coerente può essere raggiunto e che più animali di sopravvivere ^17,19 per individualizzare l'ipossia indotta in base alla risposta cerebrale di ogni maialino valutate dalla ampiezza integrata elettroencefalografia (AEEG) piuttosto che utilizzare un set FiO valore di ₂ per tutta la evento ipossico. La durata della soppressione aEEG correlato al grado di lesione cerebrale, con poche modifiche istopatologiche a <20 min soppressione aEEG e sequestri gravi aumentando a> 45 minuti di soppressione dall'AEEG. Una recente revisione dei trattamenti neuroprotettivi per HIE ha individuato la necessità di modelli di sopravvivenza consentire meas comportamentali risultatoUres in modelli animali ^20.

Ci sono numerosi vantaggi del modello porcellino HIE presentato. Si basa su una specie in cui i risultati sono altamente suscettibili di tradurre alla fisiologia umana. Modelli globali ipossia-ischemia insufficienza multiorgano e titolazione di ipossia-ischemia dall'AEEG induce un grado coerente di lesioni cerebrali con la sopravvivenza cliniche esiti rilevanti in modo tale che i biomarcatori, risonanza magnetica e il comportamento possono essere valutati a importanti punti di tempo.

Modelli Piglet di asfissia perinatale e HIE non solo hanno contribuito significativamente alla comprensione corrente in HIE fisiopatologia, ma hanno anche preceduto con successo studi clinici, che si traduce in nuovi trattamenti negli esseri umani. Studi su modelli Piglet giocato un ruolo chiave nella creazione di ipotermia come trattamento per HIE ^21, e sono utilizzati per la ricerca di rianimazione neonatale ^22. Diversi gruppi hanno utilizzato modelli di suinetti quando si esegue la ricerca all'interno di asfissia e HIE, und studi comprendono ipotermia ^{23-alfa-melanocita} stimolante ^24, arresto cardiaco ^25, tirosina idrossilasi attività ^26, esposizione ripetuta ipossica ^27, attività del recettore NMDA ^14, e nel vicino infrarosso spettroscopia ^28.

Il maialino modello HIE presentata in questa relazione è tecnicamente impegnativo con cui lavorare, come piccoli aggiustamenti durante il corso della procedura può comportare o lesione cerebrale troppo lieve o troppo severa ^29,2. Abbiamo scoperto che la letteratura esistente mancava dettagli sufficienti a riprodurre modelli precedentemente pubblicati. Così, abbiamo qui dimostriamo ogni passo le procedure tecniche necessarie per la creazione di un maialino 72 ore modello sopravvivenza in questo rapporto, consentendo ai ricercatori di stabilire questo modello avanzato per lo studio della HIE.

Protocollo

Il presente protocollo è stato approvato dal danese esperimenti con gli animali. Tutti gli animali sono stati anestetizzati prova durante tutta la procedura. La riproduzione di questo protocollo deve essere effettuata in conformità con l'etica nazionali e le linee guida sul benessere degli animali, e approvato dai comitati etici locali.

1. Gli animali

1. Suinetti Landrace Danese <24 ore vecchio peso di circa 1.500 - 2.000 g.

2. Anestesia e manutenzione Fluidi

1. Preparare le attrezzature necessarie per l'anestesia (Figura 1): una maschera per l'amministrazione sevoflurano, tamponi imbevuti di alcool, catetere endovenoso periferico, elastico, siringhe con soluzione fisiologica, propofol (5 mg / kg), fentanyl (10 mg / kg), e procaina benzilpenicillina (15.000 UI / kg).
2. Indurre l'anestesia consegnando 1-2% di sevoflurano attraverso una maschera di respirazione.
   1. Valutare la profondità dell'anestesia valutando per palpebrale e il ritiro riflexes. Quando certi che il maialino è profondamente anestetizzati, percutanea inserire un catetere endovenoso periferico nella vena dell'orecchio.
   2. Per confermare la pervietà del catetere endovenoso periferico, irrigare il catetere con 1-2 ml di sterile salina allo 0,9%. Somministrare iniezioni in bolo di propofol (5 mg / kg) e fentanyl (10 mg / kg). In seguito alla somministrazione in bolo sciacquare il catetere endovenoso per la seconda volta con 1-2 ml di soluzione sterile salina allo 0,9%.
   3. Posizionare siringhe con propofol (10 mg / ml) e fentanyl (10 mcg / ml) in due pompe siringa di infusione separata. Collegare iv tubi da due pompe a siringa ad una valvola a tre vie che unisce infusi in una singola linea collegata al catetere endovenoso. Inizia iv infusione continua di propofol (4-12 mg / kg / ora) e fentanyl (10 mg / kg / ora). Una volta continue infusioni sono in esecuzione, non dare ulteriori iniezioni in bolo di propofol e fentanyl.
   4. Interrompere la somministrazione del gas Anest sevofluranohesia.
   5. Iniettare procaina benzilpenicillina (15.000 UI / kg) per via sottocutanea o intramuscolare come da linee guida locali per la profilassi antibiotica. Ripetere ogni giorno. Il video mostra somministrazione sc, che in maialini ha dimostrato di causare concentrazione plasmatica superiore e maggiore emivita rispetto alla somministrazione im.
   6. Applicare occhio lubrificante pomata per evitare l'essiccazione degli occhi. Tirare la palpebra inferiore con delicatezza per formare una apertura tasca-like. Spremere una piccola quantità di unguento all'interno della tasca. Chiudi gli occhi per distribuire pomata. Verificare la presenza di secchezza oraria e riapplicare se necessario.
   7. Avviare una velocità di infusione continua di 5% di destrosio / 0,45% NaCl iv a 10 ml / kg / ora. Ridurre la velocità di 5 ml / kg / ora durante e dopo l'ipossia. Regolare la velocità di infusione di mantenere i livelli di glucosio nel sangue tra 2-10 mmol / L.

Figure 1. apparecchiature per l'anestesia e l'intubazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. intubazione e ventilazione

1. Preparare l'attrezzatura necessaria per intubazione (Figura 1): bromuro rocuronio (1 mg / kg) per il rilassamento muscolare, un'imbracatura (legare due estremità della stessa corda di nylon 4 millimetri insieme per formare un cerchio, come illustrato nella figura 1) di apertura la bocca, un batuffolo di cotone punta tampone e laringoscopio veterinario con lama dritta, spruzzo xylocaine (100 mg / ml), vari tubi di dimensioni endotracheali con polsino (dimensioni 3,0 millimetri, 2,5 millimetri, 2,0 millimetri), 500 ml di borsa autogonfiabile (valvola bag maschera) per la ventilazione, 2 ml siringa per l'inflazione del bracciale e stetoscopio.
2. Intubare seguendo la procedura riportata di seguito:
   1. Posizionare maialino in posizione supina sostenere il collo da entrambi i lati per garantire un rettilineo pas laringeisalvia per l'intubazione.
   2. Stima la lunghezza del tubo endotracheale misurando dalla punta del muso alla tacca sternale (tipicamente circa 13 cm).
   3. Luogo fionda corda intorno alla mascella superiore (verso il basso) e tenere mandibola e la lingua verso l'alto per mantenere la bocca aperta.
   4. Somministrare rocuronio bromuro (1 mg / kg) iv per indurre il rilassamento muscolare.
   5. Utilizzare laringoscopio per sollevare la linguetta verso l'alto.
   6. Utilizzare il cotone punta tampone per liberare lungo epiglottis del maialino, che può essere o retroverso nell'esofago o catturati dietro il palato molle.
   7. Anticipo laringoscopio a mantenere l'epiglottide sollevato contro la base della lingua che consente piena vista delle cartilagini aritenoideo e corde vocali.
   8. Applicare spruzzo xylocaine (100 mg / ml) per via topica nella laringe per prevenire gli spasmi della laringe.
   9. Anticipo tubo endotracheale attraverso le corde vocali. Utilizzare un movimento di rotazione per aiutare il passaggio delle cartilagini tracheali stretti. Advance tubo according alla distanza predosata e connettersi a una borsa autogonfiabile (pallone autoespandibile) per la ventilazione manuale. Per contribuire a ridurre l'attrito durante l'intubazione spruzzare il distale 1/3 del tubo endotracheale con xylocaina spruzzo.
   10. Per confermare il corretto posizionamento del tubo endotracheale: osservare l'eventuale presenza di difficoltà di respirazione, ausculate il petto d'ascolto per l'ingresso dell'aria bilaterale in entrambi i polmoni, verificare visivamente la presenza di condensa sotto l'aspetto prossimale del tubo endotracheale, e verificare la presenza di carbonio fine di marea anidride con un rilevatore di anidride carbonica colorimetrico o espiratorio CO ₂ lettura sul ventilatore meccanico se disponibile. Fine normale di anidride carbonica di marea è intorno al 5%. Un valore superiore al 2% con una forma d'onda di aspetto normale confermerà che il tubo endotracheale è nella trachea.
   11. Gonfiare la cuffia del tubo endotracheale per impedire l'aspirazione. Pressione di gonfiaggio bracciale deve essere inferiore a 25 cm H ₂ O per evitare il danno ischemico al tessuto circostante. Tenendo il tubo endotracheale a posto, avvolgere un pezzo di nastro intorno al tubo, chiudere la mascella e continuare taping intorno al muso per fissare il tubo in posizione. Tirare delicatamente sul tubo per assicurarsi che rimanga al suo posto.
   12. Collegare tubo endotracheale a ventilatore meccanico.
3. Regolare le impostazioni del ventilatore: ventilazione a volume controllato, volume corrente (TV): 10 ml / kg [o pressione inspiratoria di picco (PIP) 15 centimetri con ventilazione a pressione controllata]. Pressione di fine espirazione positiva (PEEP): 5 centimetri. I: E ratio 1: 2. Frequenza respiratoria: 35 (regolare la velocità per mantenere la end-tidal CO ₂ tra 4,5-5,5 kPa).

4. Monitoraggio e Corpo di campionamento del fluido

Figura 2. apparecchiature per il monitoraggio.ank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1. Preparare le apparecchiature necessarie per il monitoraggio (Figura 2): nastro adesivo, lubrificante sterile, sonda per la misura continua della temperatura rettale, elettrocardiogramma (ECG) elettrodi, elettrodi pulsossimetro, rasoio, e EEG.
   1. Posizionare la sonda di saturazione su una zampa posteriore, lubrificare sonda di temperatura rettale e inserire 6 cm nel retto, posizionare riscaldatore sospeso radiante e / o aria materasso gonfiabile riscaldata per mantenere la temperatura rettale a livello fisiologico di 38,5-39 ° C, e posto ECG elettrodi.
   2. Mettere maialino in posizione prona a radere aree di 1 cm x 1 cm per il posizionamento di elettrodi EEG ago sottocutaneo; uno di fronte a ciascun orecchio e l'elettrodo di riferimento sulla linea mediana appena dietro gli occhi. Pulire il sito elettrodo con un tampone imbevuto di alcool, quindi inserire il sottocutanea elettrodo ad ago. Elettrodi sicuri con nastro adesivo e ritorno maialino al Po supinasizione.
   3. Accendere il monitor dall'AEEG.
      NOTA: L'ampiezza integrata EEG consiste di una traccia denso con margini superiore e inferiore. I margini inferiore e superiore di questo modello sono in genere 15-50 mV, spesso superiore a quello visto in neonati. Durante l'ipossia è importante notare che artefatto dalla ECG può falsamente elevare la traccia dall'AEEG. Farmaci bolo di propofol (o fentanil) possono sopprimere transitoriamente la traccia aEEG e dovrebbero essere evitati, se possibile, durante l'esperimento. La somministrazione di farmaci e eventi clinici deve essere contrassegnato per facilitare l'interpretazione del tracciato dell'AEEG.
2. Preparare le attrezzature necessarie per l'immissione cateteri ombelicali per arteriosa centrale monitoraggio della pressione arteriosa e il prelievo di sangue (Figura 3): guanti sterili, drappeggi sterili, bisturi, tamponi imbevuti di alcool, salviette sterili, catetere vena ombelicale (5 Fr), catetere arterioso ombelicale (3,5 Fr ), suturare set con una pinza, curve micro pinze, forbici, porta aghi e suture (ad esempio, le dimensioni 3-0), cerotto adesivo trasparente, 5 ml siringhe per il prelievo di sangue.

Figura 3. Dispositivi per la linea ombelicale e il prelievo di sangue. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Sterilizzare ed attaccare la zona intorno all'ombelico. Utilizzare un bisturi per tagliare il cordone ombelicale più vicino alla pelle possibile. Se questo non espone i vasi ombelicali nel maialino anestetizzato, tagliare la pelle ombelicale due millimetri al di sotto del cordone ombelicale per esporre i vasi. Identificare le due piccole arterie ombelicali e quello più grande vena ombelicale (Figura 4).
4. Usare curve micro pinze per dilatare l'arteria (Figura 4) e inserire il catetere arterioso ombelicale(3,5 Fr). Stima lunghezza di inserimento in cm a 3 x peso (kg) + 10 (formula empirica basata su corretto posizionamento in aorta discendente sopra arterie renali su autopsia).
5. Inserire un secondo 5 Fr catetere 5 centimetri nella vena ombelicale (Figura 4). Verificare il posizionamento del catetere intravascolare dal ritorno del sangue. Cateteri sicuri con posizionando una sutura a borsa di intorno all'ombelico, passano la sutura si conclude intorno a ciascuno dei cateteri ombelicali e fare un nodo. Coprire cateteri con dressing adesivo trasparente.
6. Raccogliere campioni di sangue a tempi prestabiliti: 1) immediatamente prima ipossia, 2) 30 min in insulto ipossico 3) alla fine del 45 min ipossico insulto 4) 2 ore dopo insulto ipossico. A seconda dello scopo dell'esperimento altri punti temporali per campioni di sangue può essere scelto.
7. Utilizzare emogasanalisi da campioni di sangue prelevati durante ipossia verificare cambiamenti emogasanalisi causate da ipossia-ischemia (Tabella 1). Si noti che i suinetti hanno una bassa emoglobina unt nascita (circa 8 g / dL) e può diventare anemico di frequenti prelievi di sangue. Ritirare meno di 2 ml di sangue / kg di peso corporeo al pareggio, a meno di 5 ml di sangue / kg di peso corporeo entro 24 ore e di aderire alle linee guida locali per il prelievo di sangue. Segni di anemia includono diminuzione dell'ematocrito e tachicardia.
8. Collegare la linea arteriosa ad un monitor per il monitoraggio della pressione arteriosa continua intra-arteriosa (MABP). Utilizzare linea venosa per la somministrazione di liquidi e farmaci.

Figura 4. vasi ombelicali. Vena ombelicale (a destra) e una delle due arterie ombelicali (a sinistra). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. ipossia

1. Attendere 60 min dopo aver completato il monitoraggio. Indurre ipossia passando a un O 4% ₂ / 96% N ₂ miscela di gas. Monitorare i parametri vitali e aEEG vicino e continuare a ipossia per 45 min.
2. Una volta che la traccia aEEG è piatta (margine superiore <7 mV), regolare l'ossigenazione alterando la frazione di ossigeno inspirato _(FiO2) e della pressione delle vie aeree al più alto livello FiO ₂ mantenere traccia piatta aEEG secondo il diagramma di flusso mostrato in Figura 5. Obiettivo per MABP di sotto del 70% del valore basale per almeno 10 minuti e, se necessario, più basso FiO ₂ per garantire l'ipotensione e ischemia. Il livello indicato di ipotensione è già stato dimostrato da altri ^19,13,30 per la produzione di rilevante danno cerebrale ipossico-ischemica.
3. In caso di grave ipotensione (MABP <25 mm Hg) trattare secondo i seguenti passaggi: aumentare brevemente FiO ₂ da 1-5%, bolo salina (10 ml / kg), infusione di dopamina (5-20 mg / kg / min), e infusione di noradrenalina (20 ng-1 mg / kg / min).
4. In caso di crisi di durata> 10 min (cloniche, tonico or miocloniche, tipicamente focale o come indicato da sbalzi aEEG ampiezza) trattano stepwise con (permettendo 30 min prima di procedere alla successiva iniezione): lenta bolo di fenobarbital iv 20 mg / kg, ripetere fenobarbital iv 20 mg / kg, e midazolam iv 0,5 mg / kg.
   1. Se le crisi si sviluppano e sono non risponde alla terapia farmacologica è indicata l'eutanasia.

Figura 5. ipossia-ischemia diagramma di flusso. Diagramma di flusso che mostra le regolazioni dell'ossigenazione (F _i O ₂ e P _aw) in base alla risposta aEEG. Media pressione delle vie aeree (P _aw) è stato regolato cambiando PIP / TV (inferiore PIP dà inferiore P _aw) e la frequenza respiratoria (RR inferiore dà inferiore P _aw). Obiettivo aEEG = margine superiore traccia <5 mV e basso margine di tracce> 3 mV (media 4 mV). Bersagliola frequenza cardiaca (HR) => 80. Obiettivo significano pressione arteriosa (MABP) = MABP> 25. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Sopravvivenza 6. 72 ore

1. Monitorare il maialino da vicino dopo l'insulto ipossico, e gradualmente ridurre i tassi di infusione di propofol e fentanyl. Estubare nel punto in cui l'animale sta respirando volontariamente.
2. Durante il periodo di sopravvivenza, tenere suinetti presso una struttura animale con la vigilanza 24 ore da personale specializzato in terapia intensiva e monitoraggio. Somministrare le infusioni di glucosio iv 20 ml / kg 2-3 ogni ora. In 26-48 ore dopo ipossia-ischemia biberon parziale può essere avviata. Aspirazione alla trachea e polmoni può verificarsi da biberon se il riflesso gag non è presente.
3. Se rilevante per l'esperimento, valutare lo stato neurologico utilizzando sistema di punteggio sviluppato da Thoresen et al., Descritto indettaglio nella pubblicazione originale ^17.

Valutazione 7. Esito

1. Dopo 72 ore, anestetizzare e ventilare nuovo come descritto al punto 2 e 3. Eseguire MRI con modalità di imaging rilevanti come descritto da Munkeby et al ³¹ e altri ^2.
2. Alla fine dell'esperimento eutanasia maialini con una dose letale di pentobarbital (5 g / kg iv).
3. Preparare il cervello per l'esame secondo l'obiettivo dell'esperimento.
   1. Per l'istologia cervello su tessuto fissato in formalina:.. Utilizzare perfusione cardiaca con 4% paraformaldeide in PBS, seguita da dissezione e post-fissazione in paraformaldeide come descritto da Robertson et al ^2, Chakkarapani et al ¹ o Liu et al ¹⁸ o rimuovere il cervello ed immergere in paraformaldeide al 4% come descritto da Andresen et al. ³²
   2. Per l'analisi che richiedono tessuto scatto congelato (ad esempio, RNAanalisi o enzimatici saggi di attività ^33):. Rimuovere il cervello, sezionare le regioni cerebrali di interesse ea scatto congelamento blocchi di tessuto di massimo 1 cm x 1 cm di azoto liquido come descritto da Munkeby et al ³³

Risultati

Gli effetti dell'ipossia-ischemia sul cervello che si verificano durante l'insulto indotto sono documentate registrando la traccia dall'AEEG. Un aEEG traccia rappresentativa è mostrato in Figura 6.

Figura 6. Rappresentante traccia aEEG. Bassa ampiezza a causa di ipossia-ischemia.

Discussione

A causa della sua complessità, il modello descritto può essere attuata solo in strutture accreditate e con esperienza nella ricerca animale. L'approvazione da parte dei comitati etici locali deve essere ottenuto prima dell'inizio degli esperimenti, ed ottimale del benessere degli animali deve essere garantita in ogni momento. Poiché il modello è basato sulla sopravvivenza degli animali sperimentali, è importante che un ambiente sterile viene mantenuta durante procedure invasive per prevenire le infezioni. <...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Warm-touch-pediatric blanket	Covidien	5030840
Adhesive Apertrue Drape	Barrier	915447
Utility Drape (sterile) 75x80 cm	Barrier	800530
Neoflon	BD - Luer	391350
Laryngoscope	Miller	85-0045
Endotracheal tube 2.5 mm	Covidien	111-25
Endotracheal tube 3.0 mm with cuff	Unomedical	MM61110030
Endotracheal tube 3.5 mm with cuff	Unomedical	MM61110035
Anesthesia machine	GE Healthcare	1009-9002-000
EEG - electrodes/disposable subdermal needle electrode	Cephalon	ACCE120550
ECG - electrodes	medtronic	3010107-003
ECG-electrodes for MR	philips	ACCE120550
Arterial blood sampler - aspirator	Radiometer medical ApS	956552
Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch)	Covidien	8888160341
Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch)	Covidien	8888160333
Suture set (size 3-0)	Covidien	8886 623341
BD Spinal needle 0.7x38mm	BD needles	405254
Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen	Air Liquide	made on order
NeuroMonitor (CFM) system	Natus Medical Incorporated	OBM70002