Inducibile T7 RNA Polymerase-mediato sistema di espressione multigene, pMGX

Riepilogo

Questo studio descrive metodi per la coespressione mediata da T7 di geni multipli da un singolo plasmide in Escherichia coli usando il sistema plasmid pMGX.

Abstract

La coespressione di molteplici proteine ​​è sempre più essenziale per la biologia sintetica, studiando complessi proteico-proteici e caratterizzando e sfruttando percorsi biosintetici. In questo manoscritto è descritto l'uso di un sistema altamente efficace per la costruzione di operoni sintetici multigene sotto il controllo di una polimerasi RNA T7 indottabile. Questo sistema permette che molti geni siano espressi simultaneamente da un plasmide. In questo caso, un insieme di quattro vettori correlati, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K e pMGX-hisK, con il marker selettivo di resistenza a ampicillina o kanamycina (A e K) e posseggono o mancano di una esahistidina N-terminale (Il suo) sono divulgati. Sono forniti protocolli dettagliati per la costruzione di operoni sintetici che utilizzano questo sistema vettoriale, insieme ai dati corrispondenti, che dimostrano che un sistema basato su pMGX contenente cinque geni può essere facilmente costruito e utilizzato per produrre tutte e cinque le proteine ​​codificate in Escherichia coli . Questo sistemaEm e il protocollo consentono ai ricercatori di esprimere in modo frequente moduli multipli complessi e percorsi in E. coli .

Introduzione

La coespressione di molteplici proteine ​​è sempre più essenziale, in particolare nelle applicazioni di biologia sintetica, in cui devono essere espressi più moduli funzionali ¹ ; Nello studio dei complessi proteico-proteici, in cui espressione e funzione richiedono spesso co-espressione ^{2 , 3} ; E nel caratterizzare e sfruttare percorsi biosintetici, in cui ogni gene nel percorso deve essere espresso ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Sono stati sviluppati diversi sistemi per la coespressione, in particolare nell'organismo ospitante Escherichia coli , il cavallo da lavoro per l'espressione di proteine ​​ricombinanti di laboratorio ⁹ . Ad esempio, plasmidi multipli con differenti marcatori selectable possono essere utilizzati per esprimere singole proteine ​​usando una ricchezza di diversi es Vettori di pressione ^{10 , 11} . I singoli sistemi plasmidi per l'espressione multipla di proteine ​​hanno utilizzato sia promotori multipli per controllare l'espressione di ciascun gene ^{10 , 12} ; Operoni sintetici, in cui i geni multipli sono codificati su una singola trascrizione ^{2 , 13} ; O, in alcuni casi, un singolo gene che codifica un polipeptide che viene ultimamente elaborato in modo proteolitico, fornendo le proteine ​​desiderate di interesse ¹⁴ .

Figura 1: flusso di lavoro pMGX che mostra la costruzione di un vettore policistronico. Il sistema pMGX fornisce una strategia flessibile e facile da usare per la costruzione di operoni sintetici sotto il controllo di un promotore T7 induttivo.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo manoscritto è descritto l'uso di un sistema altamente efficace per la costruzione di operoni sintetici multigene sotto il controllo di una polimerasi RNA T7 indottabile ( figura 1 ). Questo sistema permette che molti geni siano espressi simultaneamente da un plasmide. È basato su un sistema plasmidico, originariamente chiamato pKH22, che è stato utilizzato con successo per una serie di applicazioni diverse ^{6 , 7 , 8} . Qui, questo set di plasmidi viene ampliato per includere quattro vettori correlati: pMGX-A, un vettore di espressione privo di qualsiasi etichetta C- o N-terminale e con il marker di resistenza dell'ampicillina; PMGX-hisA, un vettore di espressione che codifica un tag di esahistidina N-terminale e con il marker di resistenza dell'ampicillina; PMGX-K, un vettore di espressione lAcking qualsiasi etichetta C- o N-terminale e con il marker di resistenza alla kanamycina; E pMGX-hisK, un vettore di espressione che codifica un tag di hexahistidine N-terminale e con il marker di resistenza alla kanamycina. In questo studio è stato dimostrato il metodo per la generazione di un vettore polistronicico contenente cinque geni usando il sistema pMGX, in particolare pMGX-A, insieme alla produzione di ogni singola proteina in Escherichia coli .

Protocollo

1. Ottenere Geni di Interesse

1. Generi sintetici di progettazione.
   1. Ottimizzare una sequenza genica per l'espressione di E. coli .
   2. Rimuovere tutti i siti di restrizione problematica dalla sequenza (AvrII, NdeI, EcoRI e XbaI).
   3. Incorporare siti di restrizione per la clonazione; Si raccomanda un sito 5'-NdeI e un sito 3'-EcoRI. Altri siti possono essere usati, se necessario; Si riferisce alla regione multicloning del plasmide selezionato ( Figura S1- S4 ). Se si desidera, includere un tag di codifica 5 'o 3' per la rilevazione Western blot.
   4. Ordina commercialmente il gene progettato.
   5. O il clone blunt il gene in un vortice vettore utilizzando un kit di clonazione blunt, come per le istruzioni del produttore; Primer di progettazione per amplificare il gene (quindi procedere al punto 1.2.2); O aggiungere altri 5 'e 3' estremità per la clonazione diretta in un plasmide pMGX e procedere al punto 2. Qui,I risultati rappresentativi sono dalla clonazione sbilanciata dei geni di interesse.
2. Amplificare il gene desiderato (da un gene sintetico progettato e ottimizzato o da un template DNA contenente il gene desiderato) ¹⁵ .
   1. Primer di progettazione con siti di restrizione per la clonazione; Si raccomanda un sito 5'-NdeI e un sito 3'-EcoRI. Altri siti possono essere usati, se necessario; Si riferisce alla regione multicloning del plasmide selezionato ( Figura S1- S4 ). Se si desidera, includere un tag di codifica 5 'o 3' per il rilevamento Western blot.
   2. PCR amplifica il gene desiderato ¹⁵ .
   3. Analizzare la PCR mediante elettroforesi ¹⁶ agarosica.
   4. Se esiste un'amplificazione non specificata, ripulire il gene amplificato mediante l'estrazione del gel. In caso contrario, utilizzare un kit di pulizia enzimatico.
   5. Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro controllando l'assorbimentoE a 260 nm; Vuoto con buffer di eluizione ¹⁷ .

2. Clonazione dei geni di interesse in un vettore del sistema di espressione multigene, pMGX ¹⁸

1. La restrizione digerisce il gene di interesse ottenuto e il vettore desiderato, pMGX, con NdeI e EcoRI.
   NOTA: Se si ottiene una grande quantità di plasmidi ricircolati, lasciare che la reazione NdeI proceda per 1 ora prima di aggiungere EcoRI.
   1. Utilizzare una reazione digestata da 40 μL contenente 0,5-1,5 μg di DNA e 1 μl di ciascun enzima con 4 μl del appropriato tampone 10x.
   2. Per un digerimento di NdeI e EcoRI, utilizzare il tampone EcoRI e aggiungere in primo luogo l'endonucleasi di NdeI. Digestare per 1 h a 37 ° C. Quindi aggiungere l'endonucleasi EcoRI e consentire al digest di procedere per un'ora aggiuntiva. NdeI è sensibile alle fenditure vicine alla fine del DNA, per cui la digestione iniziale da parte di EcoRI può impedire una digestione efficace da NdeI.
2. elettrOforesi la digestione di restrizione sul gel agarosico (per un gene da 1 kb, utilizzare un agarosio di 0,7% a 110 V per 55 minuti; per selezionare il percentuale di gel agarosio per diverse dimensioni del gene, fare riferimento al riferimento ¹⁶ .
3. Inserto per accise e bande vettoriali usando uno scalpello pulito o una lama di rasoio e posizionare il segmento gel gelato in un tubo da 1,5 ml.
4. Estrarre il DNA dal gel agarosico usando un kit di estrazione del gel secondo il protocollo del produttore.
5. Ligare il gene di interesse nel vettore pMGX utilizzando un rapporto 3: 1 inserto-vettore; Impostare una legatura negativa di pMGX digerito senza l'inserto.
   1. Impostare una reazione di ligando di 20 μL contenente 1 μL di ligasi del DNA di T4, 0,15-0,5 μg di DNA vettoriale (~ 5 μL) e una quantità appropriata di inserto basata su un rapporto tra inserto-vettore 3: 1 e dimensione di Il gene che viene inserito; Le spine pMGX sono tra i 5.312 ei 5.504 bp di dimensioni. Includere una reazione di controllo negativo che contiene tutto buIl gene che viene inserito. Assicurarsi che la quantità di DNA vettoriale sia equivalente nella legatura del controllo negativo e nel vettore più le reazioni di legatura dell'inserto.
6. Trasformare le reazioni di legame in cellule E. coli chimicamente competenti XL1-Blue e plasmidi ligati pMGX- yfg1 (contenenti gene di interesse 1), pMGX- yfg2 (contenente gene di interesse 2) ... pMGX- yfgn (contenente gene di interesse n). Utilizzare la tecnica asettica (all'interno di un armadio di biosicurezza o sotto una fiamma).
   1. Mescolare 100 microlitri aliquote di E. coli XL1-Blue E. coli chimicamente competenti per ghiaccio per 5 min e quindi aggiungere 5 μL delle reazioni di legatura. Incubare per 30 minuti in ghiaccio.
   2. Scuotere le cellule per 45 s in un bagno d'acqua tenuto a 42 ° C e quindi aggiungere 200 μL di LB freddo. Incubarli in ghiaccio per 2 min.
   3. Agitare le cellule a 37 ° C a 220 giri / min per 1 h e quindi distribuire la piastra 100 μL su una piastra LB-agar contenente un approfondimentoMarcatore selettivo selezionabile (sia ampicillina che kanamicina).
7. Schermate i cloni per i trasformanti positivi.
   1. Confronti i conti delle colonie sulle piastre di controllo e legatura negative. È desiderato un rapporto di colonia maggiore di 1: 2. Se sul piatto di controllo negativo vi è un gran numero di colonie, tornare al punto 2.1 e rivedere la nota.
   2. Selezionare 4-8 singole colonie (a seconda del controllo negativo: rapporto di legatura) da ciascuna reazione di legatura dei diversi geni inseriti per la screening (1 n) e inoculare 4 ml di LB e la coltura di overnight / colonia individuale adeguata antibiotica. Coltivare le culture durante la notte con agitazione a 37 ° C e 220 giri / min.
   3. Isolare il plasmide DNA usando un kit di isolamento del DNA plasmidico secondo il protocollo del produttore.
   4. Impostare una reazione di 20 μl di digestione NdeI + EcoRI contenente 150-500 ng di DNA e 1 μl di ciascun enzima con 2 μl del appropriato tampone 10x. In thÈ il caso, aggiungere NdeI e EcoRI allo stesso tempo in cui il gene di interesse sarà tra i siti di restrizione. Si consiglia un controllo negativo con il vettore vuoto pMGX. Digestare per 2 ore a 37 ° C in un bagno d'acqua.

3. Inserimento del gene 2 nel vettore pMGX contenente il gene 1, pMGX- yfg1

1. La restrizione digerisce pMGX- yfg1 con AvrII e tratta con fosfatasi intestinale del vitello (CIP).
   1. Utilizzare una reazione di digest di 40 μl contenente 0,5-1,5 μg di DNA vettoriale (~ 5-10 μL di DNA isolato) e 1 μL di AvrII con 4 μl del opportuno tampone da 10x. Digest per 1,5 h a 37 ° C e quindi aggiungere 1,5 μL di CIP. Lasciare a 37 ° C per altri 30 minuti.
2. La restrizione digerisce pMGX- yfg2 con AvrII e XbaI per liberare il gene di interesse.
   1. Utilizzare una reazione digestata da 40 μL contenente 0,5-1,5 μg di DNA e 1 μ; L di ciascun enzima con 4 μl del buffer appropriato10x. Digestare per 2 ore a 37 ° C.
3. Le restrizioni elettroforesi digeriscono su un opportuno gel percentuale (0,7%) di agarosio e esentano le bande di inserti e vettori usando una lama bruciata / rasoio pulita (vedere Punti 2.2-2.3).
4. Estrarre il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo il protocollo del produttore e quantificare il DNA ¹⁷ .
5. Ligate il gene 2 in pMGX- yfg1 utilizzando un rapporto 3: 1 inserto-vettore. Impostare una legatura negativa di pMGX- yfg1 digerito senza l'ulteriore inserto. Impostare come sopra nella fase 2.5.
6. Trasformare 5 μL delle reazioni di legame in cellule E. coli chimicamente competenti XL1-Blue, plasmidi ligati pMGX- yfg1,2 (contenenti gene di interesse 1 e 2) e controllo negativo pMGX- yfg1 , come si vede nel passaggio 2.6.
7. Paragonare il conteggio coloniale sulle piastre di controllo e di legatura negative. Un rapporto di colonia count gSi desidera un reater di 1: 2. Se ci sono un numero elevato di colonie sulla piastra di controllo negativa, tornare al punto 3.1 e rivedere il trattamento CIP.
8. Selezionare 4-8 singole colonie (a seconda del controllo negativo: rapporto di legamento) dalla reazione di legatura e inoculare 4 mL di LB e l'antibiotico appropriato per singola colonia e crescere per una notte a 37 ° C e 220 rpm.
9. Isolare il plasmide DNA usando un kit di isolamento del DNA plasmidico secondo il protocollo del produttore e quantificare il DNA ¹⁷ .
10. Schermate l'efficace inserzione del secondo gene eseguendo una digestione di restrizione di pMGX- yfg1,2 con EcoRI.
    1. Utilizzare una reazione digestata da 20 μL contenente 150-500 ng di DNA e 1 μl di enzima EcoRI con 2 μl di EcoRI 10x buffer. Digestare per 2 ore a 37 ° C.
11. Elettroforesi digerire la restrizione su un opportuno gel percentuale di agarosio; Cercare una banda che corrispondaS alla dimensione del gene 2 (vedere il punto 2.2). Un gene può inserire nel vettore nell'orientamento indesiderato e indesiderato.

4. Aggiunta di un terzo gene nel vettore pMGX contenente i geni 1 e 2, pMGX- yfg1,2

1. La restrizione digerisce pMGX- yfg1,2 con AvrII e trattare con CIP, come si vede al punto 3.1.
2. La restrizione digerisce pMGX- yfg3 con AvrII e XbaI, come si vede al punto 3.2.
3. Gli elettroforesi digestano la restrizione su un opportuno gel percentuale di agarosio e nell'inserto di accisa e nelle bande vettoriali utilizzando una lama bruciata / rasoio pulita; Fare riferimento a Fasi 2.2-2.3.
4. Estrarre il DNA dal gel agarosico usando un kit di estrazione del gel e quantificare il DNA ¹⁷ .
5. Lignare il gene 3 in pMGX- yfg1,2 utilizzando un rapporto 3: 1 di inserto-vettore e impostare una legatura negativa di pMGX- yfg1,2 digerito senza un ulteriore inserto, come si vede al punto 3.5.
6. Trasformare 5 μL delle reazioni di legame in XL1 cellule E. coli chimicamente competenti, plasmide ligati pMGX- yfg1,2,3 (contenenti geni di interesse 1, 2 e 3) e controllo negativo pMGX- yfg1,2 , come si vede al punto 2.6.
7. Paragonare il conteggio coloniale sulle piastre di controllo e di legatura negative. Se sul piatto di controllo negativo vi è un gran numero di colonie, tornare al punto 4.1 e rivedere il trattamento CIP.
8. Selezionare 4-8 singole colonie (a seconda del controllo negativo: rapporto di legatura) dalla reazione di ligation e inoculare 4 mL di LB e l'appropriato antibiotico per singola colonia; Crescono la notte a 37 ° C e 220 giri / min.
9. Isolare il DNA del plasmide usando un kit di isolamento del DNA plasmidico secondo il protocollo del produttore.
10. Schermate l'inserimento effettivo del terzo gene eseguendo una digestione di restrizione di pMGX- yfg1,2,3 con EcoRI, come si vede nel passaggio 3.10.
11. Elettroforesi digerire la restrizione su un opportuno gel percentuale di agarosio; GuardaPer le bande che corrispondono alle dimensioni del gene 2 e del gene 3 (vedi punto 2.2). Nota: il gene 3 può inserire nel vettore nell'orientamento indesiderato e indesiderato. Se i geni 2 e 3 sono le stesse dimensioni, è necessario selezionare un altro sito di digestione appropriato per la screening.
    NOTA: ripetere come necessario per ogni nuovo gene.

5. Produzione di proteine ​​di interesse utilizzando un sistema di espressione multigene e valutazione della produzione da Western Blotting

1. Trasformare il clone positivo contenente tutti i geni di interesse in E. coli , chimicamente competenti, produttrici di proteine, come BL21- (λDE3).
   1. Mescolare 100 μL aliquote di E. coli chimicamente competenti BL21- (λDE3) in ghiaccio per 5 min e quindi aggiungere 1 μL del DNA plasmidico positivo clonato; Incubare per 30 minuti in ghiaccio.
   2. Scongelamento caldo le cellule per 45 s in un bagno d'acqua tenuto a 42 ° C e poi aggiungere 200 μL di LB freddo. Incubare in ghiaccio per 2 min.
   3. Agitare le cellule a 37 ° C e 220 giri / min per 1 h e quindi distribuire la piastra 100 μL su una piastra LB-agar contenente il marcatore selettivo adatto (ampicillina o kanamicina).
2. Esprimere la proteina mediante l'induzione di isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG).
   1. Selezionare una colonia isolata dalla piastra di trasformazione B21- (λDE3) e inoculare 4 ml di LB e l'antibiotico appropriato; Crescono durante la notte, scuotendo a 37 ° C e 220 giri / min.
   2. Inoculare 100 ml di LB e la coltura antibiotica appropriata usando 1 ml di coltura overnight.
   3. Crescere a 37 ° C con agitazione a 220 giri / min ad un OD ₆₀₀ di 0,6.
   4. Indurre la cultura con 100 μM IPTG e crescere per 15 h a 25 ° C e 220 giri / min.
   5. Rimuovere 1 ml della coltura e centrifugare a 13.000 xg per 1 min; Scartare il surnatante.
3. Lyse le cellule utilizzando la soluzione di lisi secondo le istruzioni del produttoreE preformare una macchia Western della lisi cellulare solubile per determinare se tutte le proteine ​​sono state prodotte con successo ¹⁹ .

Risultati

In questo studio, l'obiettivo era quello di co-esprimere cinque proteine ​​da un unico plasmide. I frammenti di gene sintetici ottimizzati a cinque codoni che codificano i tag di esahistidine di N- o C-terminali sono stati acquistati in commercio. I geni sintetici sono stati amplificati mediante PCR e clonati individualmente in un vettore PCR-blunt e sequenziati. Per generare il plasmide policistronico, i cinque geni di interesse sono stati prima clonati in un idoneo plasmide pMG...

Discussione

La coespressione di geni multipli è sempre più essenziale, in particolare per caratterizzare e ricostituire complessi percorsi metabolici multigene ^{3 , 4 , 5} . Il sistema pMGX rende coespressione multigene in routine E. coli ^{6 , 7 , 8} e accessibile a diversi ricercatori. In questo studio sono state dimostrate che cinque prot...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)	New England Biolabs	M0290S
AvrII	New England Biolabs	R0174S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
NdeI	New England Biolabs	R0111S
XbaI	New England Biolabs	R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent Technologies	600677
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
1 kb DNA ladder	New England Biolabs	N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels	Bio-Rad	456-8095
50 x TAE	Fisher Thermo Scientific	BP1332-4
Agar	Fisher Thermo Scientific	BP1423-500
Agarose	Fisher Thermo Scientific	BP160-500
Ampicilin	Sigma-Alrich	A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells			Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent	Fisher Thermo Scientific	PI78243
dNTP mix	Agilent Technologies		Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit	Omega	D2500-02	E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine	Fisher Thermo Scientific	BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse	GenScript	A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	EMD Millipore	WBKLS0100
IPTG	Sigma-Alrich	15502-10G
LB	Fisher Thermo Scientific	BP1426-500
Methanol	Fisher Thermo Scientific	A411-20
Pasteurized instant skim milk powder	Local grocery store		No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane	Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)	10600007	Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit	Omega	D6943-02	E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX	Boddy Lab		Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers	Intergrated DNA Technologies		Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene	Life Technologies		Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper	Bio-Rad	1703932
Tris base	BioShop	TRS001.1
Tween-20	Sigma-Alrich	P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells			Comeptent cell prepared in house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
BioSpectrometer	Eppendorf	RK-83600-07
Gel box - PAGE	Bio-Rad	1658005	Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager	Alpha Innotech		AlphaImager EC
Incubator-oven	Fisher Thermo Scientific	11-690-650D	Isotemp
Incubator-shaker	Fisher Thermo Scientific	SHKE6000-7	MaxQ 6000
Personna Razors	Fisher Thermo Scientific	S04615
Power Pack	Bio-Rad	S65533Q	FB300
Transilluminator	VWR International	M-10E,6W
Thermocylcer	Eppendorf	Z316091	Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield		18-999-4542
Waterbath	Fisher Thermo Scientific	15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus	Bio-Rad	1703935	Mini-Trans Blot Cell