Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Resumo

Este estudo descreve métodos para a co-expressão mediada por T7 de múltiplos genes de um único plasmídeo em Escherichia coli usando o sistema de plasmídeo pMGX.

Resumo

A co-expressão de múltiplas proteínas é cada vez mais essencial para a biologia sintética, estudando complexos proteína-proteína e caracterizando e aproveitando os caminhos biossintéticos. Neste manuscrito, descreve-se o uso de um sistema altamente eficaz para a construção de operões sintéticos multigenes sob o controle de uma polimerase de ARN T7 induzível. Este sistema permite que muitos genes sejam expressos simultaneamente a partir de um plasmídeo. Aqui, um conjunto de quatro vetores relacionados, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K e pMGX-hisK, com o marcador selecionável por resistência à ampicilina ou kanamicina (A e K) e possuindo ou não uma hexahistidina N-terminal A tag (his) é divulgada. São fornecidos protocolos detalhados para a construção de operões sintéticos usando este sistema de vetores juntamente com os dados correspondentes, mostrando que um sistema baseado em pMGX contendo cinco genes pode ser facilmente construído e usado para produzir todas as cinco proteínas codificadas em Escherichia coli . Este sistemaEm e protocolo permite que os pesquisadores rotineiramente expressam módulos complexos de múltiplos componentes e caminhos em E. coli .

Introdução

A co-expressão de múltiplas proteínas é cada vez mais essencial, particularmente em aplicações de biologia sintética, onde vários módulos funcionais devem ser expressos ¹ ; No estudo dos complexos proteína-proteína, onde a expressão e função muitas vezes requerem co-expressão ^{2 , 3} ; E na caracterização e aproveitamento de caminhos biossintéticos, onde cada gene na via deve ser expresso ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Vários sistemas foram desenvolvidos para coexpressão, particularmente no organismo hospedeiro Escherichia coli , o cavalo de trabalho para a expressão de proteína recombinante em laboratório ⁹ . Por exemplo, múltiplos plasmídeos com diferentes marcadores selecionáveis ​​podem ser usados ​​para expressar proteínas individuais usando uma riqueza de diferentes ex Vetores de pressão ^{10 , 11} . Os sistemas plasmídicos únicos para expressão múltipla de proteínas utilizaram múltiplos promotores para controlar a expressão de cada gene ^{10 , 12} ; Operões sintéticos, onde múltiplos genes são codificados em uma única transcrição ^{2 , 13} ; Ou, em alguns casos, um único gene que codifica um polipéptido que é processado de forma proteolítica, produzindo as proteínas desejadas de interesse ¹⁴ .

Figura 1: fluxo de trabalho pMGX que mostra a construção de um vetor policristão. O sistema pMGX fornece uma estratégia flexível e fácil de usar para a construção de operões sintéticos sob o controle de um promotor T7 indutível.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Neste manuscrito, é descrito o uso de um sistema altamente eficaz para a construção de operões sintéticos multigene sob o controle de uma ARN polimerase T7 indutível ( Figura 1 ). Este sistema permite que muitos genes sejam expressos simultaneamente a partir de um plasmídeo. É baseado em um sistema de plasmídeo, originalmente chamado pKH22, que foi utilizado com sucesso para várias aplicações diferentes ^{6 , 7 , 8} . Aqui, este conjunto de plasmídeo é expandido para incluir quatro vetores relacionados: pMGX-A, um vetor de expressão que não possui quaisquer marcas C ou N-terminal e com o marcador de resistência à ampicilina; PMGX-hisA, um vetor de expressão que codifica uma etiqueta de hexahistidina N-terminal e com o marcador de resistência à ampicilina; PMGX-K, um vetor de expressão lObtendo quaisquer tags C ou N-terminal e com o marcador de resistência à kanamicina; E pMGX-hisK, um vetor de expressão que codifica uma etiqueta de hexahistidina N-terminal e com o marcador de resistência à canamicina. Neste estudo, o método para a geração de um vetor policristão contendo cinco genes usando o sistema pMGX, especificamente pMGX-A, é demonstrado juntamente com a produção bem-sucedida de cada proteína individual em Escherichia coli .

Protocolo

1. Obtendo Genes de Interesse

1. Desenhe genes sintéticos.
   1. Otimize uma sequência de genes para a expressão de E. coli .
   2. Remova todos os sites de restrição problemáticos da sequência (AvrII, NdeI, EcoRI e XbaI).
   3. Incorporar sites de restrição para clonagem; É recomendado um site 5 '-NdeI e um site 3'-EcoRI. Outros locais podem ser utilizados, se necessário; Referem-se à região de multiclonagem do plasmídeo selecionado ( Figura S1- S4 ). Se desejado, inclua uma etiqueta de codificação 5 'ou 3' para a detecção Western Blot.
   4. Comercialmente, ordene o gene projetado.
   5. Ou o clone clone o gene em um vetor contundente usando um kit de clonagem contundente, de acordo com as instruções do fabricante; Projete iniciadores para amplificar o gene (então, avance para o passo 1.2.2); Ou adicionar extremidades 5 'e 3' adicionais para a clonagem direta em um plasmídeo pMGX e passar para o Passo 2. Aqui, thOs resultados representativos são da clonagem brusca dos genes de interesse.
2. Amplificar o gene desejado (a partir de um gene sintético projetado e otimizado ou de DNA modelo contendo o gene desejado) ¹⁵ .
   1. Desenhe primers com sites de restrição para clonagem; É recomendado um site 5 '-NdeI e um site 3'-EcoRI. Outros locais podem ser utilizados, se necessário; Referem-se à região de multiclonagem do plasmídeo selecionado ( Figura S1- S4 ). Se desejado, inclua uma etiqueta de codificação de 5 'ou 3' para a detecção de Western Blot.
   2. PCR amplifica o gene desejado ¹⁵ .
   3. Analisar o PCR por eletroforese em gel de agarose ¹⁶ .
   4. Se houver amplificação inespecífica, limpe o gene amplificado por extração de gel. Caso contrário, use um kit de limpeza de enzimas.
   5. Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro, verificando o absorventeE a 260 nm; Em branco com tampão de eluição ¹⁷ .

2. Clonagem de Genes de Interesse em um Vector de Sistema de Expressão Multigênica, pMGX ¹⁸

1. Restrição digerir o gene obtido de interesse e o vetor desejado, pMGX, com NdeI e EcoRI.
   NOTA: Se uma grande quantidade de plasmídeos recircularizados forem obtidos, permita que a reação de NdeI prossiga por 1 h antes de adicionar EcoRI.
   1. Use uma reação de digestão de 40 μL contendo 0,5-1,5 μg de DNA e 1 μL de cada enzima com 4 μL do tampão 10x apropriado.
   2. Para um resumo NdeI e EcoRI, use o tampão EcoRI e primeiro adicione a endonuclease NdeI. Digerir por 1 h a 37 ° C. Em seguida, adicione a endonuclease EcoRI e permita que o resumo continue por uma hora adicional. NdeI é sensível às clivagens próximas ao fim do DNA, então a digestão inicial por EcoRI pode prevenir a digestão efetiva pelo NdeI.
2. ElectrOfora a digestão de restrição em gel de agarose (para um gene de 1 kb, use um gel de agarose a 0,7% a 110 V durante 55 min, para selecionar a porcentagem de gel de agarose para diferentes tamanhos de genes, consulte a referência ¹⁶ .
3. Inserção de impostos e bandas de vetores usando um bisturi limpo ou uma lâmina de barbear e coloque o segmento de gel excisado em um tubo de 1,5 mL.
4. Extrair o DNA do gel de agarose usando um kit de extração de gel de acordo com o protocolo do fabricante.
5. Ligar o gene de interesse para o vector pMGX utilizando uma proporção de inserção para vector de 3: 1; Configurar uma ligação negativa de pMGX digerido sem a inserção.
   1. Configure uma reação de ligação de 20 μL contendo 1 μL de T4 DNA ligase, 0,15-0,5 μg de DNA de vetor (~ 5 μL) e uma quantidade apropriada de inserção com base em uma proporção de inserção a vetor de 3: 1 e do tamanho de O gene que está sendo inserido; Os backbones pMGX estão entre 5,312 e 5,504 pb de tamanho. Inclua uma reação de controle negativo que contenha tudoT o gene que está sendo inserido. Certifique-se de que a quantidade de DNA de vetor é equivalente na ligação de controle negativo e as reações de ligação de inserção vetorial mais.
6. Reagir as reacções de ligação em células de E. coli quimicamente competentes XL1-Blue e plasmídeos ligados pMGX- yfg1 (contendo o gene do interesse 1), pMGX- yfg2 (contendo o gene do interesse 2) ... pMGX- yfgn (contendo o gene do interesse n). Use técnica asséptica (dentro de um gabinete de biossegurança ou sob uma chama).
   1. Destilar alíquotas de 100 μL de XL1-Blue E. coli quimicamente competente em gelo durante 5 min e depois adicionar 5 μL das reações de ligação. Incube durante 30 minutos no gelo.
   2. Choque de calor das células por 45 s em um banho de água a 42 ° C e depois adicione 200 μL de LB frio. Incubar em gelo durante 2 min.
   3. Agite as células a 37 ° C, 220 rpm durante 1 h e, em seguida, aplique a placa 100 μL sobre uma placa de LB-agar contendo uma aprovaçãoMarcador selecionável adequado (ampicilina ou kanamicina).
7. Teste os clones para transformantes positivos.
   1. Compare as contagens de colônias nas placas de controle negativo e ligadura. É desejada uma relação de contagem de colônias maior que 1: 2. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, volte para o Passo 2.1 e reveja a nota.
   2. Selecione 4-8 colônias individuais (dependendo do controle negativo: relação de ligação) de cada reação de ligação dos diferentes genes inseridos para rastreio (1 n) e inocule um LB de 4 mL e uma cultura durante a noite de antibiótico apropriada / colônia individual. Cultive culturas durante a noite com agitação a 37 ° C e 220 rpm.
   3. Isolar o DNA do plasmídeo usando um kit de isolamento do DNA do plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante.
   4. Configure uma reação de 20 μL NdeI + EcoRI digest contendo 150-500 ng de DNA e 1 μL de cada enzima com 2 μL do tampão 10x apropriado. NaoÉ caso, adicione NdeI e EcoRI ao mesmo tempo em que o gene de interesse estará entre os sites de restrição. É recomendado um controle negativo com o vetor pMGX vazio. Digerir durante 2 h a 37 ° C em banho-maria.

3. Inserindo o gene 2 no vetor pMGX contendo o gene 1, pMGX- yfg1

1. Restrição digerir pMGX- yfg1 com AvrII e tratar com fosfatase intestinal de bezerro (CIP).
   1. Use uma reação de digestão de 40 μL contendo 0,5-1,5 μg de DNA vetorial (~ 5-10 μL de DNA isolado) e 1 μL de AvrII com 4 μL do tampão 10x apropriado. Digerir por 1,5 h a 37 ° C e depois adicionar 1,5 μL de CIP. Deixe-o a 37 ° C durante 30 minutos adicionais.
2. Restriction digest pMGX- yfg2 com AvrII e XbaI para libertar o gene de interesse.
   1. Use uma reação de digestão de 40 μL contendo 0,5-1,5 μg de DNA e 1 μ; L de cada enzima com 4 μL do tampão 10x apropriado. Digerir por 2 h a 37 ° C.
3. A restrição de eletroforese digere em um percentual apropriado (0,7%) de gel de agarose e adiciona as inserções e bandas de vetores usando um bisturi limpo / lâmina de barbear (consulte as Etapas 2.2-2.3).
4. Extraia o DNA usando um kit de extração de gel de acordo com o protocolo do fabricante e quantifica o DNA ¹⁷ .
5. Ligate o gene 2 em pMGX- yfg1 usando uma proporção de inserção / vetor 3: 1. Configure uma ligação negativa de pMGX- yfg1 digerido sem a inserção adicional. Configure como acima no Passo 2.5.
6. Transforme 5 μL das reações de ligação em células XL1-Blue quimicamente competentes de E. coli , plasmídeos ligados pMGX- yfg1,2 (contendo o gene de interesse 1 e 2) e controle negativo de pMGX- yfg1 , como visto no Passo 2.6.
7. Compare a contagem de colônias nas placas de controle e ligadura negativas. Uma razão de contagem de colônias gÉ desejável reater do que 1: 2. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, volte para o Passo 3.1 e reveja o tratamento com CIP.
8. Selecione 4-8 colônias individuais (dependendo do controle negativo: relação de ligação) da reação de ligação e inocule 4 mL de LB mais o antibiótico apropriado por colônia individual e cresça durante a noite a 37 ° C e 220 rpm.
9. Isolar DNA de plasmídeo usando um kit de isolamento de DNA plasmídico de acordo com o protocolo do fabricante e quantificar o DNA ¹⁷ .
10. Tira a inserção efetiva do segundo gene, realizando uma digestão de restrição de pMGX- yfg1,2 com EcoRI.
    1. Use uma reação de 20 μL de digestão contendo 150-500 ng de DNA e 1 μL de enzima EcoRI com 2 μL de tampão EcoRI 10x. Digerir por 2 h a 37 ° C.
11. Eletroforese a síntese de restrição em uma porcentagem adequada de gel de agarose; Procure uma banda que correspondaS ao tamanho do gene 2 (ver passo 2.2). Um gene pode inserir no vetor na orientação indesejada e reversa.

4. Adicionando um terceiro gene ao vetor pMGX contendo os genes 1 e 2, pMGX- yfg1,2

1. Restrição digerir pMGX- yfg1,2 com AvrII e tratar com CIP, como visto no Passo 3.1.
2. Restriction digest pMGX- yfg3 com AvrII e XbaI, conforme observado na Etapa 3.2.
3. Eletroforese as digestões de restrição em uma porcentagem apropriada de gel de agarose e inserção de impostos especiais de consumo e bandas de vetores usando uma bisturí limpa / lâmina de barbear; Consulte os Passos 2.2-2.3.
4. Extraia o DNA do gel de agarose usando um kit de extração de gel e quantifica o DNA ¹⁷ .
5. O gene de ligato 3 em pMGX- yfg1,2 utilizando uma relação de inserção a vector de 3: 1 e estabeleceu uma ligação livre de pMGX- yfg1,2 digerido sem inserção adicional, como se observa no Passo 3.5.
6. Transforme 5 μL das reações de ligação em XLCélulas de E. coli quimicamente competentes de 1-azul, plasmídeo ligado pMGX- yfg1,2,3 (contendo genes de interesse 1, 2 e 3) e controle negativo de pMGX- yfg1,2 , como visto na Etapa 2.6.
7. Compare a contagem de colônias nas placas de controle e ligadura negativas. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, volte ao Passo 4.1 e reveja o tratamento com CIP.
8. Selecione 4-8 colônias individuais (dependendo do controle negativo: relação de ligação) da reação de ligação e inocule 4 mL de LB mais o antibiótico apropriado por colônia individual; Crescer durante a noite a 37 ° C e 220 rpm.
9. Isolar o DNA plasmídico usando um kit de isolamento de DNA plasmídico de acordo com o protocolo do fabricante.
10. Tira a inserção efetiva do terceiro gene executando uma síntese de restrição de pMGX- yfg1,2,3 com EcoRI, conforme observado na Etapa 3.10.
11. Eletroforese a síntese de restrição em uma porcentagem adequada de gel de agarose; VejaPara bandas que correspondem aos tamanhos do gene 2 e do gene 3 (ver passo 2.2). Nota: o gene 3 pode inserir no vetor na orientação não desejada, invertida. Se os genes 2 e 3 forem do mesmo tamanho, outro local de restrição de restrição apropriado deve ser selecionado para triagem.
    NOTA: Repita conforme necessário para cada novo gene.

5. Produção de proteínas de interesse usando um sistema de expressão multigênica e avaliação da produção por Western Blot

1. Transforme o clone positivo contendo todos os genes de interesse em quimicamente competente, produção de proteína E. coli , como BL21- (λDE3).
   1. Descongelar alíquotas de 100 μL de E. coli BL21- (λDE3) químicamente competente em gelo durante 5 min e depois adicionar 1 μL do DNA plasmídico clonado positivo; Incubar durante 30 min no gelo.
   2. Choque térmico das células durante 45 s em banho-maria mantido a 42 ° C e depois adicione 200 μL de LB frio. Incubar no gelo durante 2 min.
   3. Agite as células a 37 ° C e 220 rpm durante 1 h e depois aplique a placa 100 μL sobre uma placa de LB-agar contendo o marcador selecionável apropriado (ampicilina ou kanamicina).
2. Expresse a proteína pela indução de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG).
   1. Selecione uma colônia isolada da placa de transformação B21- (λDE3) e inocule 4 mL de LB mais o antibiótico apropriado; Cresça durante a noite, agitando a 37 ° C e 220 rpm.
   2. Inocular 100 mL de LB mais a cultura de antibiótico apropriada utilizando 1 mL de cultura durante a noite.
   3. Crescer a 37 ° C com agitação a 220 rpm para uma DO ₆₀₀ de 0,6.
   4. Induzir a cultura com 100 μM de IPTG e crescer durante 15 h a 25 ° C e 220 rpm.
   5. Remova 1 mL da cultura e centrifugá-la a 13.000 xg durante 1 min; Descarte o sobrenadante.
3. Lyse as células usando solução de lise de acordo com as instruções do fabricanteE preforme uma mancha de Western do lisado celular solúvel para determinar se todas as proteínas foram produzidas com sucesso ¹⁹ .

Resultados

Neste estudo, o objetivo era co-expressar cinco proteínas de um único plasmídeo. Os fragmentos de gene sintético otimizados com cinco codões que codificam as marcas de hexahistidina N- ou C-terminal foram adquiridos comercialmente. Os genes sintéticos foram amplificados por PCR e clonados individualmente em um vetor PCR-blunt e sequenciados. Para gerar o plasmídeo policórónico, os cinco genes de interesse foram primeiro clonados num plasmídeo pMGX adequado, pMGX-A.

Discussão

A co-expressão de múltiplos genes é cada vez mais essencial, particularmente na caracterização e reconstituição das vias metabólicas complexas multigênicas ^{3 , 4 , 5} . O sistema pMGX faz co-expressão multigene na rotina ^{6 , 7 , 8 de} E. coli e acessível a diversos pesquisadores. Neste estudo, mostraram-se cinco prote...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)	New England Biolabs	M0290S
AvrII	New England Biolabs	R0174S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
NdeI	New England Biolabs	R0111S
XbaI	New England Biolabs	R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent Technologies	600677
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
1 kb DNA ladder	New England Biolabs	N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels	Bio-Rad	456-8095
50 x TAE	Fisher Thermo Scientific	BP1332-4
Agar	Fisher Thermo Scientific	BP1423-500
Agarose	Fisher Thermo Scientific	BP160-500
Ampicilin	Sigma-Alrich	A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells			Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent	Fisher Thermo Scientific	PI78243
dNTP mix	Agilent Technologies		Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit	Omega	D2500-02	E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine	Fisher Thermo Scientific	BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse	GenScript	A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	EMD Millipore	WBKLS0100
IPTG	Sigma-Alrich	15502-10G
LB	Fisher Thermo Scientific	BP1426-500
Methanol	Fisher Thermo Scientific	A411-20
Pasteurized instant skim milk powder	Local grocery store		No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane	Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)	10600007	Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit	Omega	D6943-02	E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX	Boddy Lab		Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers	Intergrated DNA Technologies		Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene	Life Technologies		Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper	Bio-Rad	1703932
Tris base	BioShop	TRS001.1
Tween-20	Sigma-Alrich	P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells			Comeptent cell prepared in house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
BioSpectrometer	Eppendorf	RK-83600-07
Gel box - PAGE	Bio-Rad	1658005	Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager	Alpha Innotech		AlphaImager EC
Incubator-oven	Fisher Thermo Scientific	11-690-650D	Isotemp
Incubator-shaker	Fisher Thermo Scientific	SHKE6000-7	MaxQ 6000
Personna Razors	Fisher Thermo Scientific	S04615
Power Pack	Bio-Rad	S65533Q	FB300
Transilluminator	VWR International	M-10E,6W
Thermocylcer	Eppendorf	Z316091	Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield		18-999-4542
Waterbath	Fisher Thermo Scientific	15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus	Bio-Rad	1703935	Mini-Trans Blot Cell