Determinazione del livello di espressione della proteina in cellule coltivate di immunocitochimica su blocchi di paraffina celle

Riepilogo

Attualmente, macchiatura immunofluorescente su celle fisse è il metodo di scelta per la determinazione dei livelli di espressione della proteina quando informazioni morfologiche sono anche necessari. Questo protocollo presentato qui fornisce un metodo alternativo di immunocitochimica su blocchi di paraffina delle cellule.

Abstract

Macchiatura immunofluorescente è attualmente il metodo di scelta per la determinazione dei livelli di espressione della proteina nei sistemi di coltura cellulare quando informazioni morfologiche sono anche necessari. Il protocollo di colorazione su blocchi di paraffina celle, presentati qui, immunocitochimica è un'ottima alternativa alla macchiatura immunofluorescente su celle fisse-paraffina-incastonato. In questo protocollo, un blocco di celle di paraffina da cellule HeLa è stato preparato utilizzando il metodo di tromboplastina-plasma e immunocitochimica è stata eseguita per la valutazione di due marcatori di proliferazione, CKAP2 e Ki-67. I nuclei e citoplasma morfologia delle cellule HeLa sono stati conservati bene nelle diapositive blocchetto delle cellule. Allo stesso tempo, il pattern di colorazione CKAP2 e Ki-67 nell'immunocitochimica erano abbastanza simili a quelle in immunoistochimica in tessuti di cancro di paraffina. Con condizioni di coltura delle cellule modificate, tra cui pre-incubazione delle cellule HeLa in condizioni privo di siero, l'effetto potrebbe essere valutato, preservando le informazioni dell'architettura. In conclusione, immunocitochimica su blocchi di paraffina celle è un'ottima alternativa alla macchiatura immunofluorescente.

Introduzione

Nella maggior parte dei laboratori, blocchi di paraffina celle non sono comunemente utilizzati. Piuttosto, fissa cellule coltivate, cellule non paraffina, sono impiegati negli studi di localizzazione subcellulare. Per quelli fissi cellule coltivate, è stato utilizzato fluorescenza invece di cromogeno. Di conseguenza, macchiatura immunofluorescente è attualmente il metodo di scelta per la determinazione dei livelli di espressione della proteina nella ricerca che impiegano cell culture¹. Vetrini preparati per la macchiatura immunofluorescente, tuttavia, possono essere osservate solo nell'ambito di microscopia immunofluorescente, che potrebbe mostrare immagini abbastanza diverse da quelle indicate sotto aereo microscopia². Inoltre, conservazione delle diapositive per la macchiatura immunofluorescente richiede protezione dalla luce brillante e segnali fluorescenti diventano più deboli con l'esposizione ripetuta per l'imaging a causa della perdita del segnale fluorescente³. Risultati da immunocitochimica su blocchi di paraffina celle sono molto simili a quelli di immunoistochimica su tessuti paraffina-incastonati⁴, ed essi possono essere facilmente tradotti in informazioni cliniche. Di conseguenza, immunocitochimica può essere un'ottima alternativa. Tuttavia, la preparazione del blocchetto delle cellule non è stato popolare in laboratori di ricerca di base. In questo protocollo, quindi, preparazione del blocchetto delle cellule e la macchiatura immunocytochemical sono disponibili per promuovere l'uso di questo metodo nel campo degli studi della coltura cellulare.

Immunocitochimica e preparazione del blocco di celle non sono metodi univoci, e sono già state applicate dalla diagnosi clinica alla ricerca di base^4,5. Anche se la preparazione di blocco di celle vari metodi sono stati riportati^4,6 tromboplastina-plasma metodo è semplice, economica e facilmente adattabile. Pertanto, nel protocollo presentato in questa carta, la tromboplastina-plasma metodo^4,5,6,7,8 viene utilizzato per la preparazione di blocchi di celle di paraffina.

Nel presente studio, sono state dimostrate le procedure dettagliate per la preparazione di blocchi di celle di tromboplastina-plasma e il metodo di immunocitochimica impiegando due marcatori di proliferazione. Un marker è proteina citoscheletrica associata 2 (CKAP2), che recentemente è stata segnalata come un marcatore mitotica^9,10,11; l'altro è Ki-67, che è il più noto di marcatore di proliferazione¹². Lo schema rappresentativo è illustrato nella Figura 1.

Protocollo

Il protocollo di studio è stato approvato dal istituzionale Review Board della National Cancer Center, Corea (NCCNCS-12-630).

1. preparazione del campione (30 min)

1. Per la coltura delle cellule HeLa (CCL-2, ATCC), è possibile utilizzare 10 mL liquido di DMEM completo (10% di siero fetale bovino, 1% penna-strep) in una piastra di coltura di 100 mm. Per preparare il siero-affamate cellule HeLa, incubare le cellule HeLa confluenti in DMEM senza siero bovino fetale per 48 ore, come descritto in un precedente studio¹¹.
2. Per staccare le cellule, lavarli con soluzione tampone fosfato (PBS) e 2 mL e aggiungere tripsina EDTA di 2 mL 0,25% per ogni piatto di cultura di 100 mm. Quindi, incubare per 2-3 min in incubatore a CO₂ a 37 ° C.
3. Aggiungere 5 mL di terreno DMEM completo di piastra di coltura per disattivare tripsina e trasferire le cellule indipendente per un tubo da 15 mL. Poi, centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min formare una pallina.
4. Rimuovere il surnatante e lavare la pallina due volte con 2 mL di PBS freddo mediante centrifugazione a 300 x g per 10 min.
5. Dopo la rimozione del surnatante, aggiungere 1 mL di etanolo al 95% per il pellet cellulare e miscelare il pellet cellulare con etanolo nel Vortex. Mantenere le cellule fisse sul ghiaccio sino alla preparazione del blocchetto delle cellule.

2. cell-block preparazione (1h 30 min)

1. Per la preparazione di plasma congelato aliquote, raccogliere plasma EDTA da sangue di donatore sano e centrifugare a 13.000 x g per 10 min. raccogliere il plasma surnatante aliquota 200-400 µ l ciascuna in microfuge tubes. Conservare le aliquote a-80 ° C fino all'utilizzo. Quando le aliquote di plasma congelato sono pronte, recuperarli e scongelare il plasma di incubazione a 37 ° C per 5 min.
2. Centrifugare le cellule fisse a 700 x g per 10 min, poi scartare il surnatante.
3. Miscelare il pellet cellulare con 2 gocce (circa 200 µ l) di plasma, 2 gocce di tromboplastina e 2 gocce di cloruro di calcio 0,025 M. Quindi, mescolare pipettando.
4. Lasciare il composto formare un coagulo di cella a temperatura ambiente per 10 min, come mostrato nella Figura 2A. Poi, lavare il grumo di cellule con PBS due volte versando e rimuovendo PBS mediante pipetta. Il coagulo rappresentativo delle cellule bianche è mostrato nella Figura 2B.
5. Inumidire un pezzo di carta da filtro con formalina e avvolgere il coagulo di cellulare con la carta da filtro pre-umidificata. Quindi, mettere il composto coagulato con un pincette in una cassetta di tessuto come mostrato in Figura 2.
6. Posto la cassetta di tessuto in un vaso di vetro contenente 50 mL di formalina tamponata (formalina al 10% in PBS) durante la notte a 4 ° C per la fissazione in formalina.

3. tessuto lavorazione e inclusione in paraffina (una notte)

1. La cassetta di tessuto contenente il coagulo di formalina cella di carico in un processatore di tessuti durante la notte come descritto in precedenza¹¹. La lavorazione del tessuto è per la rimozione di acqua e condizionamento delle celle fisse prima dell'inclusione in paraffina. Per la ricerca senza lavorazione del tessuto, eseguire il procedura di lavorazione come indicato nella tabella 1del tessuto.
2. Attivare il riscaldata incorporamento stazione e 60 minuti più tardi, controlla che non c'è paraffina fusa nello stampo metallo ivi (Figura 2D).
3. Prendere il coagulo formato cella dal cassetto del tessuto e inserirlo nella paraffina fusa all'interno dello stampo in metallo.
4. Posto la nuova cassetta di tessuto senza il coperchio in metallo stampo contenente la cella coagularsi in mezzo la paraffina fusa e versare più paraffina fusa nel cassetto del tessuto e su stampo in metallo. Quindi, lasciate che la paraffina solidificare nel piatto freddo per 30-60 secondi.
5. Separare la cassetta di tessuto dallo stampo in metallo. Quindi, il blocco di cella di paraffina è pronto per immunocitochimica. Il coagulo di cella incorporata nel blocco paraffina cella è indicato dalla freccia nella Figura 2E.

4. preparazione dei vetrini per immunocitochimica (1h)

1. Controllare l'area per il coagulo di cella nel blocchetto delle cellule di paraffina e tagliato a fette con spessori di 3-4 µm utilizzando un microtomo blocchetto delle cellule. Mettere le sezioni di paraffina sulle lastre di vetro rivestite con Silano, come mostrato nella Figura 2F.
2. Porre i vetrini di sezione in un forno a 37 ° C per 30 min rendere le sezioni di aderire alle diapositive.

5. immunocitochimica di blocchi di celle (6h)

Nota: Per la colorazione su sezioni di blocco di celle di immunocitochimica, vari kit può essere utilizzato (Vedi Tabella materiali). Tutti questi kit hanno varie sensibilità e specificità a seconda delle loro modifiche.

1. Incubare le sezioni in 50 mL di xilene per 4 min a-paraffinize.
2. Incubare i vetrini in etanolo al 100% per 2 min per disidratazione e due volte in etanolo al 95% e 80% etanolo 2 min. Quindi, rimuovere l'etanolo in acqua corrente per 10 min.
3. Per ricupero dell'antigene, porre i vetrini in un barattolo contenente 40 mL Tris-EDTA recupero tampone, pH 9.0 e far bollire in una pentola per 30 min.
4. Lavare i vetrini in acqua corrente e li Incubare in etanolo al 95% per 10 min a 4 ° C. Quindi, segnare la zona di macchiatura delle cellule nelle diapositive con una penna di Pap per una facile identificazione.
5. Lavare i vetrini in soluzione fisiologica tamponata contenente 0,2% Tween 20 (TBS-T) e incubare nel blocco di perossido di idrogeno (Vedi Tabella materiali) a temperatura ambiente per 15 minuti rimuovere qualsiasi residuo perossidasi attività. Quindi, lavare i vetrini in TBS-T tre volte per 2 minuti ciascuno.
6. Preparare la soluzione di anticorpo diluito diluendo anticorpo primario nel blocco della proteina (Vedi Tabella materiali). Ad esempio, il CKAP2 anticorpo primario può essere diluito 1: 100 e l'anticorpo Ki-67 1: 500. Quindi, incubare i vetrini in 100 µ l di soluzione di anticorpo diluito per 1 h.
7. Dopo il lavaggio in TBS-T cinque volte per 2 minuti ciascuno, incubare i vetrini nel rinforzatore di anticorpo primario nel kit per 15 min a temperatura ambiente al buio.
8. Dopo il lavaggio in TBS-T quattro volte per 2 minuti ciascuno, aggiungere 2 gocce di polimero HRP (un anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano) e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 30 min.
9. Dopo il lavaggio in TBS-T cinque volte per 2 minuti ciascuno, aggiungere 100 µ l di soluzione diaminobenzidina (DAB) (Vedi Tabella materiali) e incubare i vetrini per 3 min.
10. Dopo il lavaggio in TBS-T due volte, aggiungere 100 µ l di soluzione di ematossilina (la miscela di 100 µ l di ematossilina e 600 µ l di acqua distillata) e incubare i vetrini per 1 min.
11. Dopo aver lavato le diapositive in TBS-T una volta, disidratare incubando in etanolo al 95% per 2 min, immersione in etanolo al 95% una volta, e fare un tuffo in etanolo 100% due volte. Quindi, incubare i vetrini in xilene 40 mL in un vaso di vetro per 5 min.
12. Quando le diapositive sono asciutte da xilene, montare i vetrini coprioggetti rispettivi.
13. Osservare il pattern di colorazione mediante microscopia chiara.

Risultati

In una diapositiva di hematoxylin-e-eosina-macchiate dal blocco di paraffina delle cellule (Figura 3AB), la maggior parte dei nuclei e citoplasma delle cellule sono intatte, suggerendo che la conservazione morfologica è eccellente con l'attuale protocollo ( Figura 3A). Nella macchiatura immunocytochemical, CKAP2 la macchiatura positiva è stata osservata in cromatina condensata, fuso mitotico e citoplasma (Figura 4), come precedentemente segnalato¹⁰. Ki-67 macchiatura è stata osservata nei nuclei delle cellule, come previsto (Figura 4). Solo le celle con CKAP2 colorazione in cromatina condensata (vedere le frecce in Figura 4AB) erano cellule mitotiche. Molte cellule CKAP2-positive sono state indicate nelle cellule HeLa altamente mitotiche che erano state preparate dopo un'incubazione in terreno completo (Figura 4A). In confronto, c'erano poche cellule CKAP2-positive nelle cellule HeLa siero-affamate (Figura 4B). La maggior parte delle cellule HeLa altamente mitotiche erano Ki-67 positivo (Figura 4). Confermarsi, il tasso di Ki-67-positive nelle cellule HeLa siero-affamate è rimasto alto come ~ 50% (Figura 4). Questi risultati sono abbastanza paragonabili a quelli di un precedente rapporto^11, che suggerisce che il CKAP2 è un più affidabile indicatore di proliferazione in cellule di cancro che è Ki-67.

In blocchi di celle mal preparata, i nuclei sono separati dal citoplasma, e c'è anche, resultantly, povera conservazione morfologica. Più di pernottamento incubazione delle cellule fissate in frigorifero potrebbe causare tali scarsi risultati. Un altro problema importante è che le cellule non sono colorate bene da immunocitochimica, nonostante la morfologia eccellente. Questo problema si verifica più spesso quando il coagulo di cella è piccolo. In genere, l'intensità di colorazione è irregolare come illustrato in Figura 3B; ma quando il coagulo di cella è più grande, c'è molto meno probabilità di macchiatura irregolare. Pertanto, nel presente protocollo, abbiamo aumentato i volumi di plasma, cloruro di calcio e della tromboplastina al fine di formare un coagulo di grandi cellule.

Figura 1: schema di preparazione Cell-block. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: illustrazione di preparazione delle cellule-blocco di paraffina. (A) coagulo di cella della tromboplastina-plasma nel tubo. (B) coagulo di TP Cell dopo il lavaggio PBS. Coagulo di cella (C) su carta da filtro inumidito. (D) stazione inclusione di tessuti con cera fusa. Stampo in metallo (freccia) contiene cera fusa per solidificazione. (E) coagulo di cella paraffina-incastonati (freccia) incorporato in paraffina o paraffina celle del blocco. (F) sezione di paraffina sottile sulla parte centrale di una diapositiva rivestita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: preparazione Cell-block e la conferma della qualità di ematossilina ed eosina e immunostaining. (A) hematoxylin-e-eosina-macchiate immagine delle cellule HeLa in una sezione di paraffina blocchetto delle cellule. (B) irregolare macchiatura di Ki-67 in immunocitochimica su un mal preparato paraffina cella-blocco sezione. Barre della scala sono (A) 100 e (B) 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: macchiatura Immunocytochemical sul blocchetto di paraffina cellule per cellule HeLa. (A) CKAP2 colorazione in condizioni altamente mitotiche. (B) CKAP2 colorazione in condizioni di siero-affamate. (C) Ki-67 che macchia in condizioni altamente mitotiche. (D) colorazione in condizioni di siero-affamate di Ki-67. Vengono visualizzate barre di scala 100 μm. Le frecce indicano le cellule CKAP2-positive. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Procedura	Passaggi	Soluzione	Tempo/temperatura
Disidratazione	1	alcool al 70%	15 min/RT
	2	80% di alcol	15 min/RT
	3	alcol al 95%	15 min/RT
	4	100% di alcol	15 min/RT
Schiarimento	1	Xilene	60 min/4 ° C
	2	Xilene	10 min/RT
	3	Xilene	10 min/RT
	4	Xilene	10 min/RT
* RT, temperatura ambiente

Tabella 1. Procedura di elaborazione del tessuto.

Discussione

Macchiatura immunofluorescente su cellule in coltura fisse è attualmente il metodo di scelta per la determinazione del livello di espressione della proteina in cellule mantenendo informazioni morfologiche¹. Tuttavia, immunocitochimica su blocchi di paraffina delle cellule può essere un'ottima alternativa. Le procedure dettagliate per la preparazione di blocchi di celle di paraffina e immunocitochimica sono stati descritti nel presente protocollo, e speriamo che può facilitare l'applicazione di immunocitochimica in studi delle cellule.

Immunocitochimica presenta parecchi vantaggi sopra macchiatura immunofluorescente. Macchiatura immunofluorescente per cellule solitamente richiede celle appena colture, ma blocchi di celle di paraffina possono essere mantenuti a temperatura ambiente per diversi anni¹³. Inoltre, immunocitochimica su blocchi di celle possibile esplorare modelli di espressione intracellulare impiegando lo stesso anticorpo utilizzato in routine immunoistochimica su tessuti umani⁴. Inoltre, possono esplorare i cambiamenti nei livelli di proteina o modifiche di posttranslational sia pre-incubando le cellule con le varie droghe o sotto varie condizioni di cultura¹¹.

In contrasto con i vantaggi di macchiatura immunocytochemical, la preparazione di blocchi di celle paraffina richiede tempo ed è costosa¹⁴. Inoltre, maggior parte dei laboratori di ricerca mancano di esperienza in questa tecnica, ed errori tecnici in tali circostanze sono comuni. Gli errori più comuni sono povera conservazione della morfologia delle cellule e colorazione sulle sezioni di blocco di paraffina cella di immunocitochimica scarsa o irregolare. Questi e molti altri utenti può essere evitati effettuando blocchi di celle sotto le migliori condizioni di cella e con soluzione abbastanza per formare coaguli di cella.

Come una dimostrazione del presente protocollo, blocchetti delle cellule sono state preparate per cellule HeLa e macchiatura immunocytochemical è stata effettuata per i due marcatori di proliferazione, CKAP2 e Ki-67, come precedentemente segnalato¹¹. Per immunocitochimica, le cellule sono state manipolate tramite incubazione in media con e senza siero bovino fetale, e l'effetto di deprivazione di siero potrebbe essere osservato. Questi blocchi di celle di paraffina preparato possono essere impiegati per un gran numero di anticorpi, perché molte diapositive possono essere preparate da un blocco di celle utilizzando solo una sezione di blocco di celle µm di spessore di 4-5 per ogni diapositiva. Pertanto, i modelli di espressione corrispondente a due diverse condizioni possono essere valutati con diversi anticorpi differenti. Modelli di immunostaining per CKAP2 e Ki-67 nel carcinoma tessuti sono già stati segnalati^9,10,11,12, e i risultati di macchiatura immunocytochemical potrebbe essere facilmente valutato, perché il pattern di colorazione erano abbastanza simili a quelli da immunohistochemistry.

In conclusione, immunocytochemical che macchia su blocchetti di paraffina delle cellule può essere un'ottima alternativa alla macchiatura immunofluorescente; Inoltre, esso può essere facilmente e in modo affidabile impiegato nella ricerca di base per l'espressione genica in linee cellulari mantenendo informazioni morfologiche.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa Cells	ATCC	HeLa (ATCC CCL-2)
Ki-67 Antibody	Thermo Fisher Scientific	RM-9106-S1
Paraffin	Leica	39601006
Xylene	Fisher SCientific	1330-20-7,100-41-4
Ethenol	GD Chem	DJ16016
Hematoxylin	Agilent	10118581
DAB Quanto Kit	Thermo Fisher Scientific	TA-125-QHDX, QHCX 170405
Ultravision LP detection Kit	Thermo Fisher Scientific	PBQ141209, LPB141209, LPH141210	Kit for immunocytochemistry; contains protein block
TintoRetriever Pressure Cooker	Bio SB Corporation	BSB 7008
Tris-buffered saline	iNtRON Biotechnology	IBS-BT008
Tween 20	USB Corporation	115106
Thromboplastin	Neoplastin Cl Plus	NC0591432
Tris-EDTA retrival Buffer	Dignostic Biosystem	E625-A
Trypsin EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone Laboratories Inc	SH30910.03
DMEM	Hyclone Laboratories Inc	SH30243.01
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Thermo Fisher Scientific	15240062
Ultra vision peroxide block H2O2	Thermo Fisher Scientific	02Q141212
Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific	363313
Pap-Pen	Vector Laboratories	H-4000
Filter Paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-0155
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	21115-100ml
Phosphate-buffered saline	PAA Laboratories	H21-002
Formalin	Daejung	50-00-0
15 ml tube	SPL Life Sciences	50015
tissue processing cassette	Simport	M492-5
100 mm culture dishes	BD Biosciences	08-772E
Glass Slide	Muto Pure Chemicals	140712
Cover Glass	Marienfeld	2262817
Glass Zar	Hyunil Lab-Mate	HIP-1027
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Class II Laminar Flow Hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series A2
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	Series A2
Tissue Processor	Leica BioSystem	TP1020
Microtome	Thermo Fisher Scientific	HM340E
Microscope	Olympus	CX-21
Paraffin embedding station	Thermo Fisher Scientific	EC 350-1, EC 350-2
Tissue Section Bath (Round)	CellPath	HCP-JAW-0100-00AEU
Fume Hood	Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd.	FH-150