Immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 의해 경작된 한 세포에 단백질 표정 수준 결정

요약

현재, 고정된 셀에 immunofluorescent 얼룩 때 단백질 식 레벨의 결정에 대 한 선택의 방법 형태학 정보도 필요 하다. 여기에 소개이 프로토콜 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry의 다른 방법을 제공 합니다.

초록

Immunofluorescent 얼룩 때 현재 단백질 표정 수준 결정에 대 한 선택의 방법 세포 배양 시스템에 형태학 정보도 필요 하다. Immunocytochemical 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록, 여기 제시에 얼룩의 프로토콜 파라핀 포함 된 고정된 셀에 immunofluorescent 얼룩에 우수한 대안 이다. 이 프로토콜에서 HeLa 세포에서 파라핀 셀 블록 thromboplastin 플라즈마 메서드를 사용 하 여 준비 하 고 immunocytochemistry 두 확산 마커, CKAP2 및 기-67의 평가 위해 수행 되었다. 핵 및 HeLa 세포의 세포질 형태학 셀 블록 슬라이드에서 잘 보존 했다. 같은 시간에는 immunocytochemistry에서 CKAP2와 기-67 얼룩 패턴 immunohistochemical 파라핀 암 조직에 얼룩에 아주 유사 했다. 혈 청 무료 조건 HeLa 세포의 사전 부 화를 포함 하 여 수정된 세포-배양 조건, 효과 아키텍처 정보를 유지 하면서 평가 수 있습니다. 결론적으로, 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry immunofluorescent 얼룩에 우수한 대안 이다.

서문

대부분 실험실에서 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 하지 일반적으로 사용 됩니다. 오히려, 배양된 세포를 고정, 파라핀 포함 되지 셀 subcellular 지 방화 연구에서 채택 된다. 그 배양된 세포를 고정, 형광 chromogen 대신 사용 되었습니다. 따라서, immunofluorescent 얼룩 현재 셀 문화¹을 채용 하는 연구에서 단백질 식 레벨의 결정에 대 한 선택의 방법입니다. 그러나 슬라이드, immunofluorescent 얼룩이 지기에 대 한 준비는, 비행기 현미경²아래 표시 된 아주 다른 이미지를 표시할 수 있습니다 immunofluorescent 현미경 검사 법에만 관찰할 수 있습니다. 또한, immunofluorescent 얼룩에 대 한 슬라이드의 보존 밝은 빛 으로부터 보호를 요구 하 고 형광 신호 약한 이미징 형광 신호³의 손실로 인해 반복 노출 되. 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry의 결과 매우 비슷합니다 immunohistochemistry 파라핀 끼워 넣어진 조직⁴에서 그리고 그들은 쉽게 임상 정보로 번역 될 수 있다. 따라서, immunocytochemistry는 우수한 대안을 수 있습니다. 그러나, 셀 블록 준비 되지 않았습니다 인기 기초 연구 실험실에서. 이 프로토콜에서 다음, 셀 블록 준비 및 immunocytochemical 얼룩 제공 됩니다 셀-문화 연구의 분야에서이 방법의 사용을 촉진.

셀 블록 준비 및 immunocytochemistry는 독특한 방법, 하지 그리고 그들은 이미 기본 연구^4,5임상 진단에서 적용 된. 다양 한 셀 블록 준비 방법 되었습니다 보고^4,, 비용 효율적인, 간단 하 고 쉽게 적응할 수 있는⁶ thromboplastin 플라즈마 방법이입니다. 따라서,이 문서, thromboplastin 플라즈마 방법^4,,56,7,에 소개 된 프로토콜⁸ 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록의 준비에 사용 됩니다.

현재 연구에서 두 확산 마커를 사용 하는 immunocytochemistry 메서드 및 thromboplastin 플라즈마 셀 블록의 준비에 대 한 자세한 절차 시연 했다. 한 표시는 골격 관련 단백질 2 (CKAP2), 최근에는 mitotic 마커^9,,1011;으로 보고 되었습니다. 다른 하나는 가장 유명한 확산 마커¹²기-67. 대표적인 구조는 그림 1에 표시 됩니다.

프로토콜

연구 프로토콜은 기관 검토 위원회의 국립 암 센터, 한국 (NCCNCS-12-630)에 의해 승인 되었다.

1. 샘플 준비 (30 분)

1. HeLa 세포 (CCL 2, ATCC)의 문화에 대 한 100 m m 문화 접시에 10 mL 전체 DMEM 매체 (10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 펜-strep)를 사용 합니다. 혈 청에 굶주린 HeLa 세포를 준비 하려면 품 어 소 태아 혈 청 하지 않고 DMEM에 confluent HeLa 세포 48 시간에 대 한 이전 연구¹¹에 설명 된 대로.
2. 세포를 분리 하려면 2 mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께 그들을 씻어 하 고 100 m m 문화 접시 당 0.25 %EDTA 트립 신 2 mL를 추가 합니다. 그런 다음 37 ° c.에 CO₂ 배양 기에서 2-3 분 동안 품 어
3. 트립 신, 비활성화 문화 접시에 완전 한 DMEM 매체의 5 mL을 추가 하 고 15 mL 튜브를 분리 된 세포를 전송. 그런 다음에 펠 릿을 형성 하기 위하여 10 분에 대 한 300 x g에서 셀 원심.
4. 상쾌한, 제거 하 고 10 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 두 번 2 mL 차가운 PBS 가진 펠 릿을 세척.
5. 상쾌한의 제거 후, 셀 펠 릿을 95% 에탄올의 1 mL을 추가 하 고 vortexing에 의해 셀 펠 릿 에탄올과 혼합 합니다. 셀 블록 준비까지 얼음에 고정된 셀을 계속.

2. 셀 블록 준비 (1 시간 30 분)

1. 냉동된 플라즈마의 준비에 대 한 aliquots, 건강 한 기증자 혈액에서 EDTA 플라즈마를 수집 하 고 표면에 뜨는 플라즈마를 수집 하는 13000 x g에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 약 200-400 수 µ L 각에 microfuge 관. 사용까지-80 ° C에서 aliquots를 저장 합니다. 냉동된 플라즈마 aliquots 준비가 되 면, 그들을 검색 하 고 5 분 동안 37 ° C에 외피에 의해 플라즈마를 녹여.
2. 10 분 동안 700 x g에 고정 된 세포를 원심 다음 삭제는 상쾌한.
3. 플라즈마, thromboplastin, 2 방울 및 0.025 M 염화 칼슘 2 방울 2 방울 (약 200 µ L) 셀 펠 릿 믹스. 그런 다음 pipetting으로 그들을 믹스.
4. 그림 2A와 같이 10 분 동안 실내 온도에 셀 응고를 형성 하기 위하여 혼합물을 허용 한다. 그런 다음 세척 PBS와 셀 응고 두 번 붓는 피 펫으로 PBS를 제거 하 여. 대표적인 화이트 셀 응고는 그림 2B에 표시 됩니다.
5. 포 르 말린와 필터 종이 축 축 하 게을 미리 moistened 필터 종이 셀 응고를 포장. 그런 다음 그림 2C와 같이 조직 카세트에는 pincette와 응고 혼합물을 놓습니다.
6. 포 르 말린 고정을 위한 4 ° C에서 하룻밤 버퍼링 된 포 르 말린 (10% 포 르 말린 PBS에) 50 mL를 포함 하는 유리 항아리에 조직 카세트 장소.

3. 조직 처리 및 파라핀 포함 (하룻밤)

1. 포함 하는 포 르 말린 고정 셀 응고 조직 카세트 로드 조직 프로세서에서 앞에서 설명한¹¹하룻밤. 조직 처리 물 제거 및 파라핀 포함 이전에 고정 된 세포의 조절입니다. 조직 처리 없이 연구를 위한 조직 표 1에 표시 된 것 처럼 절차를 처리를 수행 합니다.
2. (그림 2D) 온수 포함 역, 및 60 분 후, 검사는 녹은 파라핀 금속 금형에 거기에 설정.
3. 조직 카세트에서 형성된 된 셀 응고 하 고 금속 금형 내에서 녹은 파라핀에.
4. 장소는 셀을 포함 하는 금속 금형에 뚜껑 없이 새로운 조직 카세트 녹은 파라핀 중간 응고와 조직 카세트에 그리고 금속 금형에 더 많은 녹은 파라핀을 부 어. 그런 다음 30-60 초에 대 한 차가운 접시에 공고히 파라핀 하자.
5. 금속 금형에서 조직 카세트를 분리 합니다. 그런 다음 파라핀 셀 블록은 immunocytochemistry에 대 한 준비. 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 포함 된 셀 응고 그림 2E에서 화살표로 표시 됩니다.

4. Immunocytochemistry (1 시간)에 대 한 슬라이드의 준비

1. 파라핀 셀 블록에 셀 응고에 대 한 영역을 확인 하 고는 톰을 사용 하 여 3-4 µ m의 두께와 조각으로 셀 블록을 잘라. 그림 2 층에서 보는 바와 같이 실 란 코팅 된 유리 슬라이드에 파라핀 섹션을 넣어.
2. 슬라이드에 고착 하는 섹션을 30 분 동안 37 ° C 오븐에 섹션 슬라이드를 놓습니다.

5. 셀 블록 (6 h) Immunocytochemistry

참고: immunocytochemical 셀 블록 섹션에 얼룩, 다양 한 키트 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 이러한 키트는 다양 한 감도 특이성 그들의 수정에 따라 있다.

1. 크 실 렌 드 paraffinize 4 분의 50 mL에 섹션을 품 어.
2. 100% 에탄올 탈수에 대 일 분에 두 번 95% 에탄올, 및 2 분 80% 에탄올에 슬라이드를 품 어. 그런 다음, 실행 10 분 동안 물에 에탄올을 제거 합니다.
3. 항 원 복구에 대 한 병 포함 40 mL 트리 스-EDTA 검색 버퍼, pH 9.0, 슬라이드를 놓고 30 분 동안 솥에 삶아.
4. 실행 물, 아래 슬라이드를 세척 하 고 95% 에탄올 4 ° c.에서 10 분 동안에 그들을 품 어 다음, 슬라이드에 세포 얼룩 지역 Pap 펜 쉽게 식별을 표시 합니다.
5. Tris 버퍼 식 염 수 0.2%를 포함 하는 슬라이드 워시 트윈 20 (TBS-T), 그리고 과산화 수소 블록에서 품 어 ( 재료의 표참조) 모든 나머지 과산화 효소 활동을 제거 하려면 15 분 동안 실내 온도에. 그런 다음 2 분에 대 한 세 번 TBS T에 슬라이드를 씻어.
6. 1 차적인 항 체 단백질 블록에서을 diluting 하 여 희석된 항 체 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조). 예를 들어 기본 항 체 수 CKAP2 희석 배율을 사용, 그리고 기-67 항 체 1: 500. 다음, 1 시간에 대 한 항 체 희석된 솔루션의 100 µ L에서 슬라이드를 품 어.
7. 5 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척, 후 어둠 속에서 실 온에서 15 분 동안 키트에 기본 항 체 증강에 슬라이드를 품 어.
8. 4 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척 후 HRP 폴리머 (이차 항 체 양 고추냉이 과산화 효소와 함께 표시)의 2 방울을 추가 하 고 30 분 동안 실내 온도에 슬라이드를 품 어.
9. 5 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척, 후 추가 diaminobenzidine (DAB) 솔루션의 100 µ L ( 재료의 표참조), 그리고 3 분에 대 한 슬라이드를 품 어.
10. 씻은 후 TBS T에 두 번, 되며 솔루션 (100 µ L 되며의와 600 µ L의 증류수의 혼합물), 100 µ L을 추가 하 고 1 분에 대 한 슬라이드를 품 어.
11. TBS-T에서 슬라이드를 한 번 세척 후 2 분에 대 한 95% 에탄올에 잠복기, 95% 에탄올에 담그고 한 번, 그리고 두 번 100% 에탄올에 담그고 탈수. 그런 다음 5 분 동안 유리 항아리 자일 렌 40 mL에에서 슬라이드를 품 어.
12. 슬라이드는 크 실 렌에서 건조, 각 coverslips를 탑재 합니다.
13. 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 얼룩 패턴을 관찰 합니다.

결과

파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 (그림 3AB)에서 되며 후 오신 스테인드 슬라이드, 세포의 세포질과 핵의 대부분은 그대로, 형태 보존은 현재 프로토콜 (우수 제안 그림 3A)입니다. Immunocytochemical 얼룩에 긍정적인 CKAP2 얼룩이 관찰 되었다 압축된 chromatin, mitotic 스핀 들 및 세포질 (그림 4)에서 이전에 보고 된¹⁰. 기-67 얼룩 예상된 (그림 4)로 세포 핵에서 관찰 되었다. 만 셀 CKAP2 압축된 chromatin에서 얼룩 mitotic 세포 했다 ( 그림 4AB화살표 참조). 많은 CKAP2 양성 세포는 완전 한 매체 (그림 4A)에서 부 화 후 준비 된 했다 높은 mitotic HeLa 세포에 표시 했다. 비교에서는, 혈 청에 굶주린 HeLa 세포 (그림 4B)에서 몇 CKAP2-긍정적인 세포 있었습니다. 높은 mitotic는 HeLa 세포의 대부분이 기-67 긍정적인 (그림 4C). 반면, 혈 청에 굶주린 HeLa 세포에서 기 67 양성 율 50% (그림 4D)로 높은 유지. 이러한 결과 매우 그는 이전 보고서^11, CKAP2은 보다 안정적인 확산 마커 암 세포에서 보다 기-67의 비교.

제대로 준비 된 셀 블록, 핵, 세포질에서 분리 하 고이 또한, 릴리스할, 불 쌍 한 형태 론 적. 냉장고에 고정된 셀의 하룻밤 보다 더 이상 보육 같은 가난한 결과 발생할 수 있습니다. 또 다른 중요 한 문제는 셀은 우수한 형태에도 불구 하 고 immunocytochemistry에 의해 잘 스테인드 하지. 이 문제는 셀 응고 작을 때 더 자주 발생 합니다. 일반적으로, 착 색 강도 그림 3B;에서 같이 일반 하지만 셀 응고 크면, 불규칙 한 얼룩의 더 적은 기회. 따라서,이 프로토콜에 우리는 큰 셀 응고를 형성 하기 위하여 플라즈마, thromboplastin, 및 염화 칼슘의 볼륨 증가.

그림 1: 셀 블록 준비 계획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 파라핀 셀 블록 준비의 그림. (A) thromboplastin 플라즈마 튜브에서 셀 병. (B) TP 셀 응고 PBS 세척 후. (C) 셀 moistened 필터 종이에 응고. (D) 조직을 포함 한 녹은 왁 스로 역. 금속 몰드 (화살표)에 녹은 왁 스 응고에 대 한 보유 하고있다. (E) 파라핀 포함 셀 응고 (화살표) 파라핀 또는 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 포함 된. (F) 얇은 파라핀 코팅된 슬라이드의 중간 부분에 섹션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 셀 블록 준비 및 확인 되며 오신 및 immunostaining 품질. (A) 되며-및-오신-스테인드 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 섹션에 HeLa 세포의 이미지. (B) 불규칙 착 색 기-67의 저조한에 immunocytochemistry에 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 섹션 준비. 스케일 바는 (A) 100 및 (B) 200 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: Immunocytochemical 헬러 셀 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 얼룩. (A) CKAP2 높은 mitotic 조건 하에서 얼룩. (B) CKAP2 혈 청 공 복 상태에서 얼룩. (C) 기-67 높은 mitotic 조건 하에서 얼룩. (D) 기-67 혈 청 공 복 상태에서 얼룩. 100 μ m 스케일 바 표시 됩니다. 화살촉 표시 CKAP2-긍정적인 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

절차	단계	솔루션	시간/온도
탈수	1	70% 알코올	15 분/실시간
	2	80% 알코올	15 분/실시간
	3	95% 알콜	15 분/실시간
	4	100% 알코올	15 분/실시간
지우기	1	크 실 렌	60 분/4 ° C
	2	크 실 렌	10 분/실시간
	3	크 실 렌	10 분/실시간
	4	크 실 렌	10 분/실시간
* RT, 실내 온도

표 1입니다. 조직 처리 절차입니다.

토론

Immunofluorescent 고정된 경작된 한 세포에 얼룩 현재 형태학 정보¹을 유지 하면서 단백질 표정 수준 셀에서의 결정에 대 한 선택의 방법입니다. 그러나, immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 우수한 대안을 수 있습니다. 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록와 immunocytochemistry의 준비에 대 한 자세한 절차는이 프로토콜에서 설명 되었습니다 그리고 우리 immunocytochemistry 셀 연구에의 응용을 촉진할 수 있다 바랍니다.

Immunocytochemistry immunofluorescent 얼룩 위에 몇 가지 장점이 있습니다. 하지만 갓 배양된 세포, 필요 immunofluorescent 일반적으로 셀에 대 한 얼룩 파라핀 셀 블록 몇 년¹³실 온에서 보관 하실 수 있습니다. 또한, immunocytochemistry 셀 블록에 일상적인 immunohistochemistry 인간의 조직⁴에 사용 된 동일한 항 체를 채용 하 여 세포내 식 패턴을 탐색할 수 있습니다. 또한, 그것은 단백질 수준 또는 posttranslational 수정 미리 다양 한 약물 또는 다양 한 문화 조건¹¹세포 배양 하 여 변화를 탐색할 수 있습니다.

Immunocytochemical 얼룩의 장점, 달리 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록의 준비 시간이 걸립니다 그리고 비용이 많이 드는¹⁴. 또한, 대부분 연구소가이 기법에서 경험이 부족 하 고 이러한 상황에서 기술적 오류는 일반적. 가장 일반적인 오류는 세포 형태학의 가난한 보존과 가난한 또는 불규칙 한 immunocytochemical 파라핀 셀 블록 섹션에 얼룩. 이들과 대부분의 다른 최고의 셀 조건 셀 블록을 만들고 충분 한 솔루션을 사용 하 여 셀 혈전을 형성 하 여 피할 수 있습니다.

현재 프로토콜의 데모, 셀 블록 HeLa 세포에 대 한 준비 하 고 두 확산 마커, CKAP2 및 이전에 보고 된¹¹기-67에 대 한 수행 했다 immunocytochemical 얼룩. Immunocytochemistry, 세포가 외피와 소 태아 혈 청 하지 않고 미디어에 의해 조작 및 혈 청 기아의 효과 관찰 될 수 있었다. 많은 슬라이드만 슬라이드 당 4-5 µ m 두께 셀 블록 섹션을 사용 하 여 셀 블록에서 준비 될 수 있다 때문에 항 체의 많은 수에 대 한 이러한 준비 파라핀 포함 된 셀 블록을 사용할 수 있습니다. 따라서, 두 개의 서로 다른 조건에 해당 하는 식이 패턴은 여러 다른 항 체와 평가할 수 있습니다. immunostaining CKAP2에 대 한 패턴 및 조직 이미 되어 암에 기-67 보고^9,10,,1112, 그리고 얼룩 결과 immunocytochemical 계산 될 수 쉽게, 때문에 얼룩 패턴 immunohistochemistry에서 그들과 아주 유사 했다.

끝으로, immunocytochemical 파라핀 셀 블록에 얼룩 immunofluorescent 얼룩;에 훌륭한 대안이 될 수 있습니다. 또한, 그것은 사용할 수 있습니다 쉽고 안정적으로 식 형태학 정보를 유지 하면서 셀 라인에서 프로 파일링에 대 한 기초 연구에.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa Cells	ATCC	HeLa (ATCC CCL-2)
Ki-67 Antibody	Thermo Fisher Scientific	RM-9106-S1
Paraffin	Leica	39601006
Xylene	Fisher SCientific	1330-20-7,100-41-4
Ethenol	GD Chem	DJ16016
Hematoxylin	Agilent	10118581
DAB Quanto Kit	Thermo Fisher Scientific	TA-125-QHDX, QHCX 170405
Ultravision LP detection Kit	Thermo Fisher Scientific	PBQ141209, LPB141209, LPH141210	Kit for immunocytochemistry; contains protein block
TintoRetriever Pressure Cooker	Bio SB Corporation	BSB 7008
Tris-buffered saline	iNtRON Biotechnology	IBS-BT008
Tween 20	USB Corporation	115106
Thromboplastin	Neoplastin Cl Plus	NC0591432
Tris-EDTA retrival Buffer	Dignostic Biosystem	E625-A
Trypsin EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone Laboratories Inc	SH30910.03
DMEM	Hyclone Laboratories Inc	SH30243.01
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Thermo Fisher Scientific	15240062
Ultra vision peroxide block H2O2	Thermo Fisher Scientific	02Q141212
Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific	363313
Pap-Pen	Vector Laboratories	H-4000
Filter Paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-0155
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	21115-100ml
Phosphate-buffered saline	PAA Laboratories	H21-002
Formalin	Daejung	50-00-0
15 ml tube	SPL Life Sciences	50015
tissue processing cassette	Simport	M492-5
100 mm culture dishes	BD Biosciences	08-772E
Glass Slide	Muto Pure Chemicals	140712
Cover Glass	Marienfeld	2262817
Glass Zar	Hyunil Lab-Mate	HIP-1027
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Class II Laminar Flow Hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series A2
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	Series A2
Tissue Processor	Leica BioSystem	TP1020
Microtome	Thermo Fisher Scientific	HM340E
Microscope	Olympus	CX-21
Paraffin embedding station	Thermo Fisher Scientific	EC 350-1, EC 350-2
Tissue Section Bath (Round)	CellPath	HCP-JAW-0100-00AEU
Fume Hood	Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd.	FH-150