Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un'opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.

Abstract

Le trappole extracellulari Neutrophil (NET) sono strutture antimicrobiche simili a reti formiche di proteine antimicrobiche derivate dal DNA e dal granulo. La microscopia dell'immunofluorescenza e i metodi di quantificazione basati sull'immagine rimangono strumenti importanti per quantificare la formazione di trape extracellulari di neutrofili. Tuttavia, esistono limitazioni chiave ai metodi basati sull'immunofluorescenza che sono attualmente disponibili per quantificare i NET. I metodi manuali di quantificazione NET basata su immagini sono spesso soggettivi, soggetti a errori e noiosi per gli utenti, in particolare gli utenti non esperti. Inoltre, le opzioni software attualmente disponibili per la quantificazione sono semi-automatiche o richiedono una formazione prima del funzionamento. Qui, dimostriamo l'implementazione di un metodo automatizzato di quantificazione delle immagini basato sull'immunofluorescenza per valutare la formazione della rete chiamata NETQUANT. Il software è facile da usare e ha un'interfaccia utente grafica (GUI) intuitiva. Considera parametri biologicamente rilevanti come un aumento della superficie e il rapporto di proteina del marcatore DNA:NET e la deformazione nucleare per definire la formazione della rete. Inoltre, questo strumento è costruito come un'applicazione liberamente disponibile, e consente la quantificazione e l'analisi di risoluzione singola.

Introduzione

Neutrophils sono mediatori cruciali delle risposte innate alla difesa dell'ospite contro un'ampia varietà di patogeni microbici¹. Essi eseguono le loro funzioni antimicrobiche rilasciando i loro granuli contenenti una vasta gamma di proteine antimicrobiche², producendo specie reattive dell'ossigeno (ROS) e ipocloriterite¹, e attraverso la fagocitosi³. Inoltre, Brinkmann et al. ⁴ ha descritto le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) come un nuovo meccanismo con il quale i neutrofili intrappolano ed eliminano gli agenti patogeni invasori. Dalla loro scoperta poco più di un decennio fa⁴, NETs sono stati implicati in una vasta gamma di infettive^5,6 e non-infettivo⁷ morbilità. La formazione della rete è un processo attivo e si traduce nell'estrusione del DNA della cromatina rivestito con proteine antimicrobiche derivate dai granuli⁸. Alcuni dei cambiamenti chiave nella morfologia cellulare e nucleare associata alla formazione di NET includono la perdita di morfologia nucleare, decondensazione della cromatina, mobilitazione delle proteine granule dal citoplasma al nucleo e un aumento del diametro nucleare e cellulare^8,9.

I NET simili al web, che possono apparire come strutture diffuse leggermente più grandi della cellula o come strutture diverse volte più grandi di un singolo neutrofilo sono considerati indicatori di NETosis^5,10. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, i NET possono essere rilevati sondando il DNA con una sonda fluorescente come la fenomenazione 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e la colorazione dell'immunofluorescenza contro le proteine del limite di rete come l'elastasi neutrofila. La quantificazione delle aree sovrapposte di colorazione per il DNA e le proteine del NET determina l'area totale sotto i NET nell'immagine¹¹.

Sono disponibili diverse opzioni di analisi delle immagini per eseguire la quantificazione basata sull'immagine a fluorescenza dei NET^11,12. Ma queste opzioni software presentano limitazioni nel non essere user-friendly e/ o completamente automatizzato. In questo articolo viene illustrato il funzionamento di NETQUANT¹³, un'app liberamente disponibile in grado di eseguire una microscopia a microscopia completamente automatizzata non imparziale. L'applicazione ha un'interfaccia grafica intuitiva (GUI) e può eseguire l'analisi a cella singola. Il software quantifica NETosis in un'immagine rilevando i cambiamenti morfologici nell'area del marcatore legato al DNA-NET, la decondensazione della cromatina associata alla deformazione del nucleo e l'aumento del rapporto proteico DNA:NET. Nel loro insieme, i criteri di definizione NET multipli consentono una rigorosa quantificazione NET in diversi set di dati in modo imparziale.

Protocollo

Il comitato etico dell'Università di Lund ha approvato la raccolta di sangue venoso da volontari sani in conformità con la Dichiarazione di Helsinki (2013/728). Tutti i volontari hanno fornito il loro consenso informato scritto.

1. Isolamento dei neutrofili del sangue periferico usando la centrifugazione densità-gradiente

1. Raccogliere il sangue venoso umano in tubi contenenti eparina e consentire ai tubi di raggiungere la temperatura ambiente.
   Nota: È necessario un minimo di 16 mL di sangue da un donatore sano per produrre un pellet cellulare sufficientemente grande.
2. Mescolare il sangue con un volume del 2% dextran in salina (0,9% NaCl) e lasciare sedimentare a temperatura ambiente per 30 min in un sterile tubo di centrifuga conical 50 mL.
3. Aspirare il supernatante in uno sterile tubo di centrifuga zione conica da 50 mL e centrifugare a 200 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
4. Da questo passo in poi continuare l'isolamento a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio.
5. Risospendere il pellet in 5 mL di ghiaccio freddo salina e strato superiore a 5 mL di gradiente di isolamento leucocito (9,1% diatrizoate di sodio con 5,7% dextran, w/v) in un tubo conico centrifuga sterile da 15 ml.
6. Centrifuga per 30 min a 400 x g a 4 gradi centigradi.
7. Aspirare il supernatante e scartarlo.
8. Liscile globuli rossi risuspendendo il pellet in 3 mL di acqua ghiacciata per 30 s. Aggiungere immediatamente 1 mL di 3,6% NaCl e poi riempire con 10 mL di ghiaccio salina fredda.
9. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 350 x g.
10. Rimuovere il supernatante, raccogliere il pellet cellulare e respenderlo in 1 mL di salina. Mettere da parte 10 L in un tubo di microcentrifuga per la valutazione del numero di cellule e la vitalità utilizzando il blu trypan in una camera di Bérker.
11. Aggiungere 10 litri di sospensione cellulare a 90 ,l dello 0,4% di soluzione blu trypan. Prendere 10 l della sospensione cellulare in una camera di B-rker. Contare le celle nei 4 quadrati delimitati da 3 linee in ogni angolo della camera. Le celle che appaiono blu scuro all'assorbimento del coloranti non sono vitali, escludile dal numero totale di celle.
12. Esprimi il numero di cella come celle /mL come definito dall'equazione sottostante.
    
    Nota: Qui il fattore camera era 10.000, il fattore di diluizione era 10 e il numero totale di quadrati era 4.
13. Diluire la sospensione rimanente per le celle a 10 mL per una fase di lavaggio finale.
14. Centrifuga per 5 min a 200 x g.
15. Risospendere i neutrofili in RPMI-1640 con 2 mg/mL di albumina del siero umano inattivato dal calore (HSA) ad una concentrazione di 5 x 10⁵ cellule/mL.

2. Preparazione di coverlips e stimolazione dei neutrofili

1. Mettere un coperchio (10 mm, #1) in ogni pozzetto di una piastra da 12 pozzetti e ricoprire il coperchio aggiungendo 200 -L di 0,01% soluzione poli-lisina e lasciarlo a 37 gradi durante la notte.
2. Lavare i coperchi con 300 tamponamenti (PBS) con 300 gradi (PBS) una volta e lasciare asciugare.
3. Aggiungete 400 ll di 5 x 10⁵ neutrofili/mL ad ogni pozzo e incubate a temperatura ambiente per 15 min.
4. Spostare la piastra contenente neutrofili in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂ per 15 min.
5. Togliete il super-acletterante. Aggiungere 400 l di preriscaldato RPMI-1640 medio con 2 mg/mL HSA ai controlli. Aggiungere per la stimolazione 300 RPMI preriscaldati con 20 nM phorbol 12-myristate 13 acetati (PMA).
6. Stimolare i neutrofili per 150 min a 37 gradi centigradi con 5% DI CO₂.

3. Visualizzazione di NET

1. Rimuovere il supernatante e lavare i campioni 2x con 200 gradi l di PBS.
2. Fissare i campioni aggiungendo 200 - L del 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS per 20 min a 37 gradi centigradi.
   Nota: l'PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.
3. Lavare i campioni 3x con 200 luna di PBS.
4. Permeabilizzare i campioni aggiungendo 50 -L di 0,5% Triton X-100 per 30 s.
5. Lavare i campioni 3x con 200 L di PBS.
6. Bloccare i campioni con il siero di capra del 5% in PBS per 1 h a 37 gradi centigradi.
7. Aggiungere 300 l di coniglio primario anti-umano neutrofilo elastassi in soluzione di blocco ad una diluizione di 1:500 per 90 min a 37 .
8. Lavare i campioni 3x con 300 - L di PBS.
9. Aggiungere 300 l di anticorpo fluorescente di capra anti-coniglio secondario con una diluizione di 1:1000 per 90 min a 37 .
10. Lavare i coperchi 3x con 300 gradi di PBS.
11. Togliere i copricapi dai pozzi e montare il coperchio con un supporto di montaggio di 10 gradi contenente DAPI. Conservare per tutta la notte a temperatura ambiente al buio per asciugare i campioni.
    Nota: La colorazione del DNA con DAPI è certamente un passo critico nel metodo. Gli utenti possono anche risolvere i problemi con l'aggiunta di soluzione DAPI esogena ad un intervallo di concentrazione finale di 0,1 -u20120.5 g/mL per 2,u20123 min, seguito da 3 passaggi di lavaggio con 300 L PBS.
12. Acquisire immagini con un microscopio a fluorescenza a campo largo utilizzando un obiettivo 20X.

4. Analisi e quantificazione dei NETT utilizzando NETQUANT

Nota: NETQUANT può essere scaricato facendo clic sul file di installazione presente nell'archivio Github o sul sito Web Nordenfelt Lab (https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).

1. Importazione di set di dati per l'analisi, la denominazione dei canali e la conversione delle immagini
   1. Aprire la scheda Configurazione in NETQUANT.
   2. Scegliete la cartella di origine per l'analisi facendo clic sull'opzione Ottieni percorso nel menu di origine e selezionate la cartella contenente le sequenze di immagini da analizzare.
   3. Fare clic sull'opzione Ottieni percorso nel menu di destinazione e selezionare la cartella per il salvataggio dei dati dopo l'analisi dell'immagine.
   4. Assegnare un nome ai canali in modo che "Canale DNA" corrisponda alla colorazione del DNA(ad esempio,DNA o DAPI) e "NET-channel" ritragga la colorazione proteica associata alla rete(ad esempio,NET, elastasi neutrofili) nelle immagini. Per il funzionamento fluido del software, (consigliato) denominare la cartella contenente i file di immagine del controllo come "controllo".
      Nota: Il canale NET si riferisce solo alla colorazione del marcatore della proteina granulosa associata a NET.
   5. Inserire i metadati dell'immagine nel software facendo clic sul pulsante Carica informazioni immagine nel sottomenu Informazioni immagine.
   6. Selezionare l'ordine dei canali corretto contenuto nelle immagini nel sottomenu Ordine canali. Questa opzione è stata inclusa come fail-safe per evitare mancate corrispondenze accidentali.
   7. Acquisire le proprietà dell'immagine primaria dai dati non elaborati e convertire le immagini facendo clic sul pulsante Prepara dati. Le immagini convertite vengono visualizzate nel sottomenu Tipo di esempio. Fare clic sul menu Tipo di esempio per visualizzare e selezionare tutti i set di dati acquisiti per l'analisi.
   8. Selezionare un'immagine dal sottomenu Tipo di esempio e fare clic sul pulsante Visualizza dati immagine per visualizzare rispettivamente le immagini suddivise nel DNA e nel canale NET.
2. Segmentazione delle cellule nel canale DNA e nel canale NET
   1. Selezionare il metodo di segmentazione facendo clic sul sottomenu Metodo sia nel canale DNA che nel canale NET.
      Nota: Il metodo di segmentazione di default è impostato adattivo ed è l'impostazione consigliata. Sono disponibili anche altre opzioni, tra cui globale, edge e Chan-Vese. Un'opzione spartiacque è inclusa anche per aiutare a distinguere tra celle strettamente posizionate o NET.
   2. Immettere la scheda Segmentazione per segmentare prima le celle di controllo in entrambi i canali facendo clic sull'opzione Campioni di controllo Segmento.
   3. Selezionare PMA dal sottomenu del tipo di esempio e fare clic sull'opzione Batch (scelta consigliata) per iniziare la segmentazione di tutte le immagini incluse nel set di dati. Selezionare le immagini nel menu del tipo di esempio e fare clic sul pulsante Visualizza dati immagine per visualizzare e convalidare le maschere di immagine binarie (maschera DNA e maschera NET) generate dopo la segmentazione.
3. Analisi a cella singola delle proprietà identificabili
   1. Immettere la scheda di analisi e analizzare i campioni di controllo facendo clic sul pulsante Determina soglia.
   2. Modificare il tipo di campione in PMA e fare clic sul pulsante Ottieni proprietà cella per completare l'analisi dei campioni stimolati.
   3. Selezionare un'immagine dal sottomenu Tipo di esempio e fare clic sul pulsante Visualizza dati immagine per visualizzare la sovrapposizione e il numero di celle e LE celle di formazione NET nell'immagine.
4. Confronto delle proprietà Cell per identificare le celle che formano NET
   1. Selezionare il campione dal sottomenu del tipo di esempio e fare clic sul pulsante Analizza NET per completare l'analisi. Le singole immagini possono essere selezionate dal sottomenu del tipo di esempio per l'analisi oppure l'intero batch di immagini può essere analizzato selezionando l'opzione batch (scelta consigliata).
   2. Modificare manualmente i criteri NET per ottenere risultati ottimali per un determinato campione. Confrontare i NET identificati con le immagini originali per valutare la qualità dell'identificazione.
      Nota: I criteri NET possono quindi essere utilizzati in tutte le immagini nel set di dati. Tutte le modifiche nei criteri NET vengono applicate contemporaneamente a tutti gli esempi di controllo. Ciò limita la possibilità di potenziali differenze che possono sorgere a causa di over-fitting dei parametri NET. Le impostazioni nei criteri NET possono essere regolate in base alle esigenze dell'utente. La relazione tra i tassi di individuazione falsi e NETQUANT è stata esplorata in precedenza¹³. Gli intervalli tipici per l'aumento dell'area sono 2-u20124, la circolarità è 0,7 -u20120.9 e il rapporto DNA/NET è 0,6–2,0.
   3. Esaminare il riepilogo dei dati nel sottomenu Dati cella in cui vengono visualizzati il numero di immagini, il numero di celle per immagine e la percentuale di NET per immagine.
      Nota: la percentuale totale di NET nell'intero set di dati viene visualizzata dal "NET-gauge". Il numero totale di immagini, il numero di celle, la percentuale di NET nel campione (NET) e NET% nell'esempio di controllo vengono visualizzati nella tabella delle statistiche di riepilogo sotto il NET-gauge. È consigliabile che i dati di controllo siano riportati insieme ai dati ottenuti da campioni stimolati.
5. Uscite dei risultati
   1. Immettere la scheda Output per selezionare e visualizzare gli output dei risultati.
   2. Esplorare e confrontare i vari output di dati generati dall'analisi del controllo e PMA selezionando la forma dell'output e facendo clic sul pulsante Risultati output.
      Nota: tutti i dati generati dopo l'analisi per i controlli e le stimolazioni vengono salvati nella cartella di analisi scelta nel sottomenu di destinazione. I dati vengono salvati in formato .csv o .pdf.
   3. Avviare il file del metodo per ottenere la versione del software e i criteri NET utilizzati per l'analisi (da includere nella sezione dei metodi a scopo di pubblicazione).
   4. Fare clic sulla tabella dati Risultati per visualizzare i singoli punti dati in un determinato campione.
   5. Visualizzare la distribuzione dell'area NET e il rapporto DNA:NET nei campioni. La linea rossa indica il valore di soglia nei grafici.
   6. Determinare l'area NET rispetto alla forma del DNA facendo clic sul file di distribuzione Bivariate.
6. Caricamento dell'analisi precedente e batch di tutti i passaggi
   1. Caricare le impostazioni di analisi riuscite in precedenza in NETQUANT utilizzando il pulsante Carica analisi precedente.
   2. Utilizzare il pulsante Batch di tutti i passaggi incluso nel menu di configurazione per eseguire i passaggi 5-u201212 (Figura 1, Figura 2, Figura 4, Figura 5) direttamente per ottenere l'output finale.

Risultati

5 x 10⁵ neutrofili/mL sono stati seminati su copricapi posizionati in una piastra di 12 pozze e stimolati con 20 nM di PMA o lasciati non stimolati per 150 min. I campioni sono stati poi macchiati utilizzando anticorpi contro il controcatena di controilofilo contro l'uomo del coniglio primario, anticorpi coniugati per i dettagli della tavola dei materiali anti-coniglio anti-coniglio e DAPI - un colorante fluorescente etichettato con DNA (vedi la tabella dei mat...

Discussione

La formazione della rete è un'aggiunta relativamente recente all'armamentario neutrofilo variegato⁴ e c'è stato un notevole aumento di interesse per studiare l'implicazione di NET in una vasta gamma di aree di ricerca^5,7,14,15. L'acquisizione di immagini mediante la microscopia immunofluorescenza e la successiva quantificazione basata sulle immagini è un metodo ampiam...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Heparinised plastic tubes	BD Biosciences	367885
Lymphoprep	Axis-Shield	114547
RPMI-1640 with L-Glutamine	Gibco	11835-030
50mL conical flasks	Sarstedt	62.547.004
15mL conical flasks	Sarstedt	62.554.002
12-well Tissue culture plates	Falcon	10626491
#1 Coverslips 10mm	Menzel Glaser	CS10100
Glass slides	Menzel Glaser	631-0098
Primary anti-human elastase	DAKO	DAKO rabbit 1373, contract immunization
Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit	Life technologies	A-11072, A-11070
PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI	Life technologies	P36930	Mounting medium
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	79346
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Nikon Ti-E Epifluorescence microscope	Nikon
CCD camera	Andor Zyla
Plan Apochromat 20x, 40x objectives	Nikon
Windows 10	Microsoft		Operating system
macOS Sierra 10.12	Apple		Operating system
MATLAB	Mathworks