Una piattaforma telemetrica e gravimetrica per la fenotipizzazione fisiologica in tempo reale delle interazioni pianta-ambiente

Riepilogo

Questo metodo di fenotipizzazione gravitazionale ad alta produttività, telemetrico e dell'intera pianta consente misurazioni dirette e simultanee in tempo reale, nonché l'analisi di più tratti fisiologici legati alla resa coinvolti nelle interazioni dinamico tra piante e ambiente.

Abstract

La sicurezza alimentare per la crescente popolazione globale è una delle principali preoccupazioni. I dati forniti dagli strumenti genomici superano di gran lunga la fornitura di dati fenotipi, creando un divario di conoscenza. Per affrontare la sfida di migliorare le colture per nutrire la crescente popolazione globale, questo divario deve essere colmato.

I tratti fisiologici sono considerati tratti funzionali chiave nel contesto della reattività o della sensibilità alle condizioni ambientali. Molte tecniche di fenotipazione ad alta velocità (HTP) introdotte di recente si basano sul telerilevamento o sull'imaging e sono in grado di misurare direttamente i tratti morfologici, ma misurare i parametri fisiologici principalmente indirettamente.

Questo documento descrive un metodo per la fenotipizzazione fisiologica diretta che presenta diversi vantaggi per la fenotipizzazione funzionale delle interazioni pianta-ambiente. Aiuta gli utenti a superare le numerose sfide incontrate nell'uso di sistemi gravimetrici a cellule di carico ed esperimenti in vaso. Le tecniche suggerite consentiranno agli utenti di distinguere tra peso del suolo, peso delle piante e contenuto di acqua del suolo, fornendo un metodo per la misurazione continua e simultanea delle condizioni dinamiche del suolo, delle piante e dell'atmosfera, insieme alla misurazione dei tratti fisiologici chiave. Questo metodo consente ai ricercatori di imitare da vicino gli scenari di stress sul campo tenendo conto degli effetti dell'ambiente sulla fisiologia delle piante. Questo metodo riduce anche al minimo gli effetti del vaso, che sono uno dei principali problemi nella fenotipazione pre-campo. Include un sistema di fertigazione feed-back che consente un progetto sperimentale veramente randomizzato a densità di pianta simile a quella del campo. Questo sistema rileva la soglia di limitazione del contenuto di acqua del suolo (θ) e consente la traduzione dei dati nella conoscenza attraverso l'uso di uno strumento analitico in tempo reale e di una risorsa statistica online. Questo metodo per la misurazione rapida e diretta delle risposte fisiologiche di più piante a un ambiente dinamico ha un grande potenziale per l'uso nello screening per tratti benefici associati alle risposte allo stress abiotico, nel contesto dell'allevamento pre-campo e del miglioramento delle colture.

Introduzione

Garantire la sicurezza alimentare per una popolazione globale in crescita in condizioni ambientali in peggioramento è attualmente uno dei principali obiettivi della ricerca^{agricola 1,2,3}. La disponibilità di nuovi strumenti molecolari ha notevolmente migliorato i programmi di miglioramento delle colture. Tuttavia, mentre gli strumenti genomici forniscono una quantità enorme di dati, la comprensione limitata dei tratti fenotipi effettivi crea un significativo divario di conoscenza. Colmare questo divario è una delle maggiori sfide che la scienza vegetale moderna deve^{affrontare 4,5,6}. Per affrontare le sfide che sorgono nel processo di miglioramento delle colture e ridurre al minimo il divario di conoscenza genotipo-fenotipo, dobbiamo bilanciare l'approccio genotipico con un fenocentrico^{uno 7,8}.

Recentemente, varie piattaforme di fenotipizzazione ad alto rendimento (HTP) hanno reso possibile il fenotipizzazione non distruttiva di grandi popolazioni vegetali nel tempo e queste piattaforme possono aiutarci a ridurre il divario di conoscenza genotipo-fenotipo^6,8,9,10. Le tecniche di screening HTP consentono di misurazione dei tratti in un numero enorme di piante in un periodo di tempo relativamente breve, grazie alla robotica e ai nastri trasportatori o gantries utilizzati per spostare le piante o i sensori (rispettivamente), al contrario delle tecniche azionate a mano basate sullo scambio di gas o sulla fotografia. Tuttavia, le enormi quantità di dati prodotte dai sistemi HTP presentano ulteriori sfide di gestione dei dati e di analisi^11,12.

La maggior parte di queste piattaforme HTP comportano la valutazione di tratti fenotipici attraverso sensori elettronici o l'acquisizione automatica^{di immagini 13,14}. La fenomico sul campo avanzata prevede l'installazione di sensori prossimali e tecnologie di imaging sul campo, nonché una scala di misurazione ad alta risoluzione, precisa e su^{larga popolazione 15.} I dati dei sensori e delle immagini devono essere integrati con altri dati multi-omici per creare un approccio fenomico olistico di seconda^{generazione 16}. Tuttavia, i progressi metodologici nell'acquisizione, nella gestione e nell'elaborazione dei dati stanno diventando sempre più importanti, poiché le sfide della traduzione delle informazioni dei sensori in conoscenze sono state grossolanamente sottovalutate durante i primi anni di ricerca sulla fenomica^{vegetale 13}. Tuttavia, l'affidabilità e l'accuratezza delle tecniche di imaging attualmente disponibili per la fenotipizzazione approfondita delle interazioni dinamico genotipo-ambiente e le risposte allo stress delle piante sono^{discutibili 17,18}. Inoltre, i risultati di ambienti controllati sono spesso molto diversi da quelli osservati sul campo, soprattutto quando si tratta di fenotipazione da stress da siccità. Ciò è dovuto alle differenze nella situazione che le piante sperimentano in termini di volume del suolo, ambiente del suolo e impedimento meccanico a causa del calo dell'umidità del suolo durante lo stress da siccità. Pertanto, i risultati da ambienti controllati sono difficili da estrapolare al campo¹⁹. Infine, il prezzo di ingresso dei sistemi HTP basati sull'immagine è molto elevato, non solo a causa del prezzo dei sensori, ma anche a causa della robotica, dei nastri trasportatori e delle gantries, che richiedono anche standard più elevati di infrastruttura di crescita-impianto e manutenzione significativa (molte parti in movimento che lavorano in un ambiente serra).

In questo articolo, presentiamo una piattaforma di fenotipazione telemetrica HTP progettata per risolvere molti dei problemi di cui sopra. La tecnologia di telemetria consente la misurazione e la trasmissione automatiche dei dati da origini remote a una stazione ricevente per la registrazione e l'analisi. Qui, dimostriamo una piattaforma non distruttiva HTP-telemetrica che include più lysimetri di pesatura (un sistema gravimetrico) e sensori ambientali. Questo sistema può essere utilizzato per la raccolta e il calcolo immediato (l'analisi delle immagini non è necessaria) di un'ampia gamma di dati, come il guadagno di biomassa di un'intera pianta, i tassi di traspirazione, la conduttanza stomata, i flussi delle radici e l'efficienza nell'uso dell'acqua (WUE). L'analisi in tempo reale dei big data che vengono direttamente alimentati al software dal controllore nel sistema rappresenta un passo importante nella traduzione dei dati nella^{conoscenza 14} che ha un grande valore per il processo decisionale pratico, estendendo sostanzialmente le conoscenze che possono essere acquisite da esperimenti di fenotipazione dell'ambiente controllato, in generale, e studi in serra di stress da siccità, in particolare.

Altri vantaggi della piattaforma di telemetria sono la sua scalabilità e facilità di installazione e i suoi requisiti minimi di infrastruttura di crescita-facility (cioè, può essere facilmente installato nella maggior parte delle strutture di crescita). Inoltre, poiché questo sistema basato su sensori non ha parti in movimento, i costi di manutenzione sono relativamente bassi, inclusi sia il prezzo di ingresso che i costi di manutenzione a lungo termine. Ad esempio, il prezzo di un sistema gravimetrico di 20 unità, compreso il sistema di fertigazione di feedback per ogni impianto, stazione meteorologica e software, sarà simile al prezzo di un sistema portatile di scambio di gas di un marchio leader.

Il riso (Oryza sativa L.) è stato utilizzato come coltura modello e la siccità è stata il trattamento esaminato. Il riso è stato scelto in quanto è una delle principali colture cerealicole con un'ampia diversità genetica ed è il cibo di base per oltre la metà della popolazione mondiale²⁰. La siccità è un importante fattore di stress abiotico ambientale che può compromettere la crescita e lo sviluppo delle piante, portando a una riduzione della resa delle^{colture 21}. Questa combinazione di trattamento delle colture è stata utilizzata per dimostrare le capacità della piattaforma e la quantità e la qualità dei dati che può produrre. Per ulteriori informazioni sulla base teorica di questo metodo, vedere ²².

Protocollo

In questo protocollo, abbiamo fatto riferimento a vasi da 4 L caricati su bilance da 20 cm x 20 cm, con ogni vaso contenente una pianta. Lo stesso protocollo è facilmente scalabile e può essere utilizzato con vasi molto più grandi (fino a 25 L caricati su scale 40 cm x 40 cm, con solo un adattamento lineare alle misure di protocollo) e diverse piante per vaso. Così il protocollo può essere facilmente adattato per piante di molti tipi e dimensioni. Fare riferimento alla Figura 1 e alla Figura 2 per i componenti di sistema.

1. Preparare i vasi per l'esperimento

1. Inserire il filtro del terreno. Stendere la maglia di nylon (netto) sulla parte superiore dell'intero piatto e posizionare il supporto netto sulla parte superiore della rete. Con una mano, spingere lentamente il supporto netto a metà strada verso il basso l'interno dell'intero piatto. Assicurarsi che la rete rimanga uniformemente diffusa mentre viene spinta verso il basso tra le due pentole.
2. Inserire il bastone in fibra di vetro (polo) tra le due pentole e spingerlo fino al fondo dell'intera pentola, assicurandosi che sia anche sul lato esterno della rete e non spinga la rete.
3. Prima di spingere il supporto netto fino in fondo, spingere la rete a mano dall'interno del piatto e regolarlo in modo che sia diffuso uniformemente e strettamente sul fondo del piatto una volta che il supporto netto è stato completamente inserito (Figura 2CI).
4. Far scorrere l'anello di guarnizione dal fondo del set-up pentola descritto sopra, un terzo della strada fino al lato della pentola. Assicurarsi che le fessure dell'anello si apro verso la parte inferiore del vaso (Figura 2CII).
5. Ripetere i passaggi 1.1-1.4 per tutti i vasi sperimentali prima di continuare con il passaggio successivo. Randomizzare la posizione delle piante (Figura 2D; in una progettazione a blocchi randomizzata o in una progettazione completamente casuale) utilizzando l'applicazione Array Randomizer.
   NOTA: Per scaricare il programma gratuito e per ulteriori informazioni, si prega di consultare il link: https://drive.google.com/open?id=1y4QbTpxRK5Lx430xzu1RFdrlcL8pz_1q).
6. Etichettare i vasi in base alle loro posizioni nella matrice all'interno della serra. Ad esempio, l'etichetta "B10D" corrisponde a un vaso situato nella tabella B nella colonna 10 e nella riga D. Preparare tre vasi aggiuntivi per ogni tabella per le misurazioni del contenuto di acqua del suolo (vedere la sezione 7.1).

2. Coltivare le piante

1. Scegli il mezzo di coltivazione (potting) che meglio si adatta all'esperimento. Scegliere il mezzo giusto per l'esperimento è fondamentale e la scelta corretta dipende da diversi fattori (vedere Discussione). Per gli utenti per la prima volta, si consiglia vivamente di utilizzare un poroso, ceramica, piccolo-formato medio. Fare riferimento alla Tabella 1 e alla Tabella 2 per ulteriori informazioni sulla scelta del supporto giusto per l'esperimento.
2. Germinare i semi in vassoi di cavità con il mezzo di potting desiderato. Se possibile, farlo all'interno della stessa serra da utilizzare per la parte principale dell'esperimento, al fine di acclimatare le piante alle condizioni ambientali all'interno di tale serra.
3. Se le piantine non sono state germinate in vassoi, trapiantarle in vassoi di cavità contenenti il mezzo di vaso. Piantare una piantine in ogni cavità e lasciarla crescere fino a quando le sue radici sono abbastanza dense da assumere la forma della cavità (spina radice-suolo).
4. Lasciare 5-7 cavità senza piantine per le misurazioni del peso del suolo (solo mezzo di potting; (Figura 3). Per ulteriori informazioni, vedere la Sezione 5.9.

3. Migliorare il livello di segnale-rumore

NOTA: I seguenti passaggi migliorano la qualità delle misurazioni e riducono i livelli di rumore.

1. Calibrare il lysimetro.
   1. Utilizzare un livello di spirito per verificare che tutti i lysimetri siano livellati e quindi avviare il processo di calibrazione del peso. Utilizzare due pesi standard (1-10 kg). Eseguire la calibrazione mentre il contenitore verde, comprese tutte le spine, si trova sulla cella di carico.
   2. Mettere il primo peso di calibrazione (più leggero) su ogni cella di carico.
   3. Nel software operativo, vai alla scheda Calibrazione e scegli il peso per il primo punto. Selezionare quindi la posizione della cella di carico in cui è stato posizionato il peso e fare clic su Ottieni punto1 ( Figura 1A ). Questo passaggio può essere applicato su più celle di carico contemporaneamente.
   4. Ripetere l'operazione per il secondo peso e fare clic su Ottieni punto2.
   5. Fare clic su Applica calibrazione.
2. Garantire una quantità sufficiente di piante con una dimensione adeguata per l'esperimento
   NOTA: Più piccola è la pianta, più debole sarà il suo segnale (ad esempio, il peso dell'acqua traspare in un giorno rispetto al peso della pentola). I seguenti passaggi aiuteranno a migliorare il rapporto segnale-rumore.
   1. Avviare l'esperimento quando l'impianto traspare circa il 10% della capacità massima dell'acqua di vaso.
      NOTA: Ad esempio, se si lavora con un mezzo sabbioso che contiene circa 1 L di acqua alla capacità del vaso (c'è la tabella 2), avviare l'esperimento quando le piante si trasfiano di circa 100 mL al giorno. Se si lavora con un mezzo a base di torba che contiene circa 2 L di acqua alla capacità del vaso (c'è la tabella 2), avviare le misurazioni quando le piante traslono circa 200 mL al giorno.
   2. Stimare la traspirazione giornaliera dell'impianto iniziale prima di caricarla sul sistema misurando (manualmente) le differenze di peso mattina rispetto alla sera in alcune piantine.
   3. Quando si lavora con piccole piante, mettere diverse piante in ogni vaso (ad esempio, sei piante di Arabidopsis in un vaso^{23 da 3,9}L , per raggiungere il livello minimo raccomandato di traspirazione) .

4. Impostazione dell'esperimento

NOTA: Il processo di creazione dell'esperimento è progettato per tenere conto del peso di tutte le parti del sistema, vale a dire il peso del mezzo di potting (compreso il peso dell'acqua del suolo alla capacità del vaso) e il peso iniziale delle piantine. Attenersi alla seguente procedura:

1. Se possibile, lavorare con componenti statici simili con pesi simili. I componenti a peso statico includono set di vasi, sonde per il suolo e altre parti in plastica.
2. Per avviare un nuovo esperimento, aprire il software operativo. Apri la scheda Esperimenti nel menu sul lato sinistro dello schermo. Fare clic su Crea nuovo o duplicare le proprietà dell'esperimento da un esperimento precedente facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'esperimento desiderato e scegliendo Duplica. Rinominare l'esperimento ( Figura 1B ).
3. Assicurarsi che nessuna unità venga utilizzata in un esperimento diverso attualmente in esecuzione nel sistema. Verificare che tutte le piante nella tabella Piante corrispondano al progetto sperimentale. In caso contrario, modificare la tabella in base al progetto (vedere le sezioni 5.18, 6 e la figura supplementare 1C).
4. Avviare l'esperimento facendo clic sul nome dell'esperimento e quindi scegliendo Avvia.
5. Prendere le misure manuali dei vasi vuoti pre-preparati (doppio vaso, rete, bastone e anello di guarnizione nera). Se si utilizzano parti simili tra loro, il peso medio di 10 di esse sarà sufficiente.
6. Mescolare accuratamente il mezzo di vaso con un po' d'acqua, per almeno 1 h, in modo che si scompoggi in particelle omogenee ed è saturo, per garantire uniformità e omogeneità. Per gli utenti per la prima volta, si consiglia vivamente di utilizzare un mezzo poroso, ceramico e di piccole dimensioni (vedere la tabella 1 e la tabella 2). Come seconda opzione, utilizzare sabbia grossolana.
   1. Utilizzare un mixer meccanico (ad esempio, un miscelatore di calcestruzzo).
   2. Quando si utilizza un mezzo altamente omogeneo (cioè sabbia industriale), saltare il punto 4.6.1.
7. Riempire uniformemente tutti i vasi per l'esperimento con il mezzo di potting appropriato (ad esempio, sabbia, suolo o torba).
8. Inserire un getto di uno stampo di cavità (Figura 3B) che sia simile per forma e dimensione al plug root-soil delle piantine (dal vassoio della cavità) nel mezzo del mezzo di vaso. Spingere in completamente. Toccare il fondo della pentola contro il pavimento un paio di volte per assicurarsi che il mezzo in vaso sia ben distribuito nella pentola. Ripetere l'operazione per tutti i vasi.
9. Innaffiare bene le pentole e risciacquare l'esterno delle pentole. Lasciare scolare le pentole per 30 minuti prima di proseguire fino al passaggio successivo. Assicurarsi che le pentole scolare liberamente. Se il mezzo di vaso si scarica troppo lentamente (ad esempio, torba densa), premiscela con un substrato arioso (ad esempio, perlite; si prega di consultare anche la Tabella 1 e la Tabella 2) per garantire un drenaggio più rapido.
10. Dopo che il drenaggio si è completamente fermato, posizionare tutti i vasi riempiti al centro della matrice di lysimeter (nei contenitori verdi che sono già lì) secondo il progetto sperimentale (Figura 2A).
11. Verificare che i contenitori verdi siano correttamente montati nel coperchio della cella di carico e non si tocchino l'un l'altro.
12. Nel software operativo, aprire la scheda Esperimento e selezionare la scheda Misura componenti. Fare clic su Misura oggetto. Denominare la misura "1^st measurement" (Supplementary Figure 1D).
13. Posizionare i gocciolatori di irrigazione, sonde e coperture in vaso su ogni vaso. Assicurarsi che le linee per i gocciolatori multi-outlet e i cavi della sonda siano supportati dai rispettivi supporti (attaccati alle unità per ogni scala di lysimetro; Figura 1E) prima di metterli nelle pentole. Assicurarsi che tutti i gocciolatori, le sonde e le coperture siano posizionati in modo sicuro.
14. Attendi fino a 3 minuti per effettuare una nuova misurazione (i dati vengono raccolti automaticamente ogni 3 minuti) e quindi apri la scheda Esperimento. Selezionare la scheda Esperimento e fare clic su Esperimento. Meta-tag questa misura per la "misura 1^st" presa e denonirlo "Componenti statici" (Figura supplementare 1E). I meta-tag vengono utilizzati quando si desidera registrare un valore di peso determinato sottraendo un valore misurato da un altro.
15. Dopo aver apportato le modifiche necessarie al sistema, attendere che venga registrato un nuovo punto dati (ogni 3 minuti) prima di effettuare la misurazione successiva.
16. Controllare la colonna Componenti statici per verificare che i valori registrati nella tabella Plants non includano outlier. Se uno dei pesi registrati è troppo basso o troppo alto, verificare la presenza di eventuali interferenze con la cella di carico (ad esempio, assicurarsi che nulla lo tocchi) e quindi prendere una nuova misurazione (dopo che il sistema era ancora per 3 min).
17. Fare clic sulla scheda Piante. Esportare la tabella Plants come foglio di calcolo, aggiungere il peso medio del vaso (dal punto 4.5) alla misurazione dei componenti statici - "Peso Tare". Salvare e caricare il file (scheda Importa).
18. Assicurarsi che tutti i gocciolatori siano inseriti in modo sicuro nel supporto di vaso e nel tubo proveniente dal controller. Nel software operativo, nella scheda Esperimento, selezionare Scenari di trattamento. Fare clic su Crea nuovo per creare un nuovo "Piano".
19. Nel piano scegliere il primo passaggio (creare un nuovo passaggio, se necessario) e aprirlo. Scegliere "Test" per il trattamento e "Mai" per Terminazione. Nell'opzione del passaggio, scegliere qualsiasi trattamento elencato nella scheda Trattamenti di irrigazione sopra Esperimenti (Figura supplementare 1F; vedere anche il passaggio 4.21). Premere la scheda Applica.
20. Estrarre la tabella Plants come foglio di calcolo, aggiungere "Plan" alla colonna Treatment e aggiungere "1" alla colonna Step. Salvare e caricare il file.
21. Nella scheda Trattamenti di irrigazione, scegliere il trattamento "Test" e impostarlo su un tempo di irrigazione di 4-5 min [con l'esatta quantità di tempo a seconda del contenuto di acqua volumetrica (VWC) del suolo utilizzato] per consentire il drenaggio. Impostare il tempo 2 minuti avanti e andare ai vasi nella serra. Possono anche essere creati altri trattamenti. (Vedere la spiegazione dettagliata nel passaggio 7.4.)
22. Controllare visivamente che tutti i gocciolatori funzionino e che l'acqua fuoriebosi dal vano di scarico perforato del contenitore verde.
23. Nell'esperimento, modificare il trattamento di irrigazione sul piano "X", Fase 1 (vedere il punto 4.19-4.20) per il trattamento di irrigazione desiderato. Assicurarsi che ogni irrigazione notturna (con fertigazione; vedi tabella 3 per i componenti di fertigazione utilizzati) sia divisa in diversi brevi impulsi (eventi) con pause sostanziali tra di loro (almeno tre eventi ogni notte), per garantire che il suolo raggiunga la sua capacità di campo prima dell'alba.
24. Lasciare che il programma di irrigazione sia eseguito per 1 o 2 giorni per consentire al suolo di raggiungere la sua capacità di campo e continuare con la fase successiva.

5. Avvio dell'esperimento

NOTA: i dati raccolti in questa fase verranno utilizzati come valori di riferimento per il resto dell'esperimento. Pertanto, è importante seguire attentamente i passaggi successivi.

1. Ripetere i passaggi da 4.18 a 4.20. In alternativa, avviare il processo al mattino presto, non molto tempo dopo l'ultima fase di irrigazione.
2. Controllare visivamente che tutti i vasi sono irrigati e che il liquido di irrigazione in eccesso gocciola dal vano di scarico perforato del bagno verde.
3. Rimuovere la spina verde e non perforata (dall'orifizio più basso) del contenitore verde e lasciare che l'acqua scorendisca completamente. Quindi, rimettere la spina al suo posto (Figura 1D). Se si lavora su "drenaggio 0" (cioè, con il foro inferiore aperto / la spina di drenaggio cavo collegato sul foro più basso), saltare questo passaggio.
4. Nel software operativo aprire la scheda dell'esperimento e passare a Misura componenti. Fare clic su Misura oggetto e denominare la misura come "Cast-pre". Rimuovere delicatamente tutti i getti dai vasi e quindi attendere 3 min per registrare una nuova misurazione (Figura supplementare 1D).
5. Fare clic su Misuraoggetto , denottarlo "Cast-post" e meta-tag la misura a "Cast-pre". L'opzione calcolerà automaticamente la differenza tra i due valori misurati e darà il peso del lancio per verificare la sensibilità al peso.
6. Controllare i valori di peso nella tabella Piante. La differenza tra le misure "Cast-post" non deve essere superiore a 20 o 30 g.
7. Per misurare il peso del terreno bagnato, nel software operativo, vai alla scheda Misura componenti nell'esperimento e seleziona l'opzione Misura peso bagnato del suolo. Prendere la misura facendo clic su OK quando richiesto. Controllare le misurazioni del peso umido del suolo nella tabella Piante dell'esperimento yotheur. Il peso verrà visualizzato nella colonna "Peso umido del suolo"(Figura supplementare 1D,G).
8. Se alcune misurazioni sembrano fluttuare in modo inappropriato, eseguire le operazioni seguenti:
   1. Verificare che ogni vaso sia posizionato correttamente e non tocchi alcun vaso/i vicino/i.
   2. Scollegare il primo controller sul tavolo dall'elettricità (il resto dei controller sono collegati in serie tra loro e quindi si spegnerà pure) per 2 min e poi ricollegarlo.
9. Misurare manualmente il peso medio di poche cavità (5-10) con mezzo di vaso (dal punto 2.3) senza piantine (spina del suolo). [Assicurarsi che le spine del terreno siano ben irrigate (cioè alla capacità del campo dopo il drenaggio) prima delle misurazioni manuali.] Nella scheda Misura componenti, premere Imposta peso del suolo di massa e immettere il peso medio ( Figura 1D ).
10. Fare clic su Misura peso iniziale impianto. Questa prima misurazione è un punto di riferimento prima della semodi pianta (Figura supplementare 1D).
11. Assicurarsi che le piantine nei vassoi di cavità siano ben irrigate (cioè alla capacità di campo dopo il drenaggio). Tirare delicatamente le piantine con la loro spina radice-terreno dalle cavità, assicurandosi di non ferirle, e metterli con attenzione nelle cavità fatte da calcamenti nei vasi, secondo il design dell'esperimento. È preferibile trasferire le piante all'alba o al tramonto, al fine di ridurre al minimo lo stress per le piante (cioè, per ridurre al minimo l'appassimento).
12. Attendere 3 min. Fare di nuovo clic su Misura peso iniziale impianto. Questa seconda misura è il peso iniziale della pianta. Meta-tag la misura al primo (il punto di riferimento). Il software calcolerà la differenza tra le due misure e sottrarrà il peso del suolo di pianto. Il risultato è il peso iniziale della pianta.
13. Controllare i valori misurati nella tabella Plants dell'esperimento per assicurarsi che riesovano un intervallo ragionevole e logico ( Figura 1C ).
14. Saturare il terreno ripetendo i punti da 4.18 a 4.20.
15. Assicurarsi che tutti i vasi siano drenante correttamente. In caso contrario, ripetere il processo di saturazione. Attendere 30 min per il drenaggio a cessare. (Vedere anche tabella 1 per quanto riguarda la scelta corretta del mezzo di potting.)
16. Nella scheda Misura componenti fare clic su Misura peso dell'acqua riservato ( Figura supplementare 1D).
17. Estrarre la tabella Piante come foglio di calcolo, sottrarre il peso iniziale della pianta misurato e il peso del suolo di pianto dalla misura riservata del peso dell'acqua (la colonna "Riserva inventario dell'acqua"). Caricare il file ( Figura 1C ).
18. Verificare che il periodo di tempo durante il quale verrà registrata la traspirazione giornaliera sia appropriato per gli obiettivi dell'esperimento. Compilare i valori nella scheda Generale in base alle esigenze del progetto ( Figura 1H ).
    1. Compilare l'ora zero: l'ora in cui il software assegno se deve passare alla fase successiva dello scenario di trattamento.
    2. Compilare i valori di traspirazione giornaliera: la traspirazione giornaliera viene calcolata come differenza tra due finestre di peso durante il giorno, per tutti i giorni. L'ora di inizio della traspirazione giornaliera è l'ora in cui il software inizierà a misurare il peso medio.
19. Monitora le piante per 1-2 giorni prima di iniziare un nuovo esperimento (duplica e rinomina l'esperimento).

6. Modificare la tabella delle piante

1. Estrarre la tabella Plants come foglio di calcolo e modificare la tabella in base alle esigenze. Non modificare gli ID impianto, i nomi o le posizioni. Salvare e caricare il file.
2. Colonne di etichettatura (raggruppamento): per presentare o analizzare (si prega di vedere Il passaggio 8) piante raggruppate in base alle etichette comuni (ad esempio, trattamento, linea), aggiungere una nuova colonna ed etichetta che inizia con il simbolo di sezione (ad esempio, #Treatment). In questa colonna, fare una notazione per ogni pianta (ad esempio, per l'etichetta "#Treatment", contrassegnare le piante come siccità, controllo, ecc.; Figura supplementare 2).
   NOTA: il protocollo presentato in precedenza è il protocollo più avanzato e completo per questo sistema. Tuttavia, gli utenti per la prima volta potrebbero voler iniziare con il protocollo semplificato (vedere MS supplementare). Il protocollo semplificato produce informazioni su un minor numero di tratti e può portare a livelli di rumore più elevati. Ma, allo stesso tempo, fornisce un modo per acquisire più facilmente familiarità e familiarità con le più importanti procedure sperimentali, hardware e software.

7. Eseguire l'esperimento

1. Calcolare il contenuto di acqua gravimetrica del suolo/contenuto di acqua del suolo (valore SWC).
   NOTA: il contenuto di acqua del suolo gravimetrico è diverso dal contenuto volumetrico di acqua del suolo (VWC).
   1. Il valore SWC è il rapporto tra il peso secco del terreno e il peso umido del terreno. Per calcolare SWC, utilizzare i tre vasi extra pieni di suolo (fase 1.3) senza piante precedentemente preparate e poste su un tavolo laterale all'interno della serra per alcuni giorni e irrigate regolarmente. Pesare il terreno umido in un vassoio di alluminio al mattino presto, il più presto possibile dopo l'ultimo evento di irrigazione.
   2. Asciugare il vassoio di alluminio con il terreno in forno (a 105 gradi centigradi) per 4-5 giorni. Verificare che il terreno sia completamente asciutto prendendo due misurazioni di peso consecutive ad almeno 60 minuti di distanza. Se i pesi sono identici, il terreno è effettivamente asciutto e l'ultima misura può essere registrata come il peso secco del suolo.
   3. Nel software operativo, andare a Misurare i componenti e fare clic sulla scheda Calcola peso secco del suolo. Riempire i pesi bagnati e asciutti del terreno per ogni campione, fare clic su Applica e fini (Figura supplementare 3).
2. In alternativa, calcola manualmente SWC utilizzando l'equazione mostrata di seguito.
   
3. Media delle due misurazioni SWC prese manualemente da almeno tre vasi. Selezionare la scheda Misura componenti e fare clic su Calcola peso a secco del suolo θg valore [g/g], fare clic su Applica e fini . I pesi secchi del suolo di tutti i vasi dell'esperimento saranno calcolati automaticamente dal software (supponendo che tutti i vasi dell'esperimento contengano lo stesso mezzo; Figura supplementare 1D e Figura supplementare 3).
4. Applicare i trattamenti di irrigazione. Gli scenari di irrigazione possono essere applicati componendo un piano di trattamento passo-passo.
   1. Per comporre un nuovo piano di trattamento di irrigazione, andare a Trattamento diirrigazione , fare clic su Creanuovo e denominare il nuovo trattamento. Aprire il trattamento specifico nell'elenco dei trattamenti di irrigazione e fare clic sul sul sul valore predefinito "00:00".
      NOTA: Nella finestra principale (Figura supplementare 4A), "Time" indica l'ora in cui la valvola si aprirà (cioè l'inizio del trattamento di irrigazione). "Valve" è la valvola da aprire (A o B, a seconda della valvola collegata alla soluzione desiderata). "Tipo di comando" indica il tipo di dati che verranno utilizzati per determinare quando la valvola verrà chiusa:
      1. Per tempo – Quanti secondi la valvola sarà aperta.
      2. Per peso – L'aumento di peso / acqua (in grammi) da aggiungere al piatto tramite irrigazione.
      3. Per traspirazione – L'irrigazione può essere applicata in modo differenziale a ogni vaso in base alla traspirazione di ogni singola pianta nel corso del giorno precedente. L'utente può decidere quale percentuale del giorno precedente traspirazione verrà applicata durante l'irrigazione. (Sotto la condizione ben irrigata, si suggerisce di dare alla pianta più del 100%, al fine di lavare il terreno e compensare la crescita delle piante.) Alle piante trattate con siccità dovrebbe essere data meno acqua, con volumi esatti basati sul tasso di stress da siccità desiderato.
      4. Per sensori – L'irrigazione può essere applicata in base a una lettura del sensore, come l'apparente consensibilità dielettrica (che può essere utilizzata per determinare il VWC). Selezionare il tipo di sensore, il parametro desiderato e il valore del parametro desiderato.
   2. Tutte le possibilità includono un'opzione di timeout che chiuderà il rubinetto anche se le condizioni impostate non sono state raggiunte. Impostare il timeout per un periodo più lungo rispetto alle condizioni impostate.
   3. Dopo aver definito i trattamenti di irrigazione per l'esperimento, aprire l'esperimento desiderato nell'elenco degli esperimenti, aprire Scenario ditrattamento , aprire il piano predefinito e selezionare il primo passaggio ( Figura 4B ).
   4. In Trattamento scegliereun trattamento di irrigazione dall'elenco. Quindi, in Terminazione, scegliere la condizione appropriata per arrestare il passaggio corrente e passare a quello successivo.
   5. Dopo aver selezionato uno scenario di irrigazione, aprire la tabella Piante dell'esperimento (Figura supplementare 2) e inserire il "Trattamento" e "Passo" per ogni pianta. "Trattamento" è il nome dello scenario di trattamento e "Passo" è il numero di evento all'interno dello scenario di trattamento.
5. Pianifica un trattamento per la siccità.
   1. Ogni singola pianta ha un tasso di traspirazione unico in base alle sue dimensioni e posizione nella serra. Per consentire un trattamento standard per la siccità (ad esempio, un tasso di essiccazione simile per tutti i vasi durante il trattamento), pianificare uno scenario di siccità e controllarlo tramite lo strumento di irrigazione di feedback del sistema ( Figura 5 ).

8. Analizzare i dati utilizzando il software di analisi dei dati

1. Aprire il software di analisi dei dati (ad esempio, SPAC Analytics). Fare clic nell'angolo in alto a destra per selezionare Sistema di controllo e il nome dell'esperimento ( Figura 6A ). Nella colonna del lato sinistro dello schermo selezionare Esperimenti ( Figura 6B ) e digitare il nome dell'esperimento nella barra Nome della sezione Cerca. Il nome dell'esperimento verrà visualizzato sotto la sezione Cerca, nella sezione Esperimenti(Figura supplementare 6C). Fare clic sull'esperimento per aprire le sezioni Info e Piante( Figura supplementare 6D).
2. Nella sezione Info modificare le date di inizio e di fine WUE per un periodo di almeno 3 (preferibilmente più) giorni prima dell'inizio del trattamento siccità e quindi fare clic su Aggiorna. Il valore WUE e R² per ogni vaso appariranno nella sezione Piante. Scegliere di escludere qualsiasi scala con un valore WUE negativo o un valore R² inferiore a 0,5 facendo clic sul simbolo "occhio" sotto la colonna Attivo, che diventerà quindi rosso. Ciò escluderà la scala selezionata (pianta) da tutti gli ulteriori calcoli. I dati possono essere esportati facendo clic sul pulsante Esporta dati nella sezione Piante ( Figura 6D ).
3. Nella colonna sul lato sinistro del ghiaia, fare clic su Analisi. Verranno quindi visualizzate diverse sottosezioni: Visualizzatore grafico, Istogramma, Test T, ANOVA e Curva lineare a schermo intero.
4. Fare clic su Visualizzatore grafico. Nella sezione Filtri, imposta le date per l'esperimento.
   1. Fare clic su Etichette (vedere Il passaggio 6) per selezionare la combinazione di gruppi sperimentali (genotipo) e trattamenti). Automaticamente, tutti i vasi del gruppo selezionato verranno visualizzati nella sottosezione Pianta. In tale sottosezione, deselezionare tutti i vasi (piante) facendo clic su di essi. È possibile selezionare contemporaneamente fino a due diversi parametri di scelta come "parametro Y1" e "parametro Y2". Infine, fare clic su Mostra grafico ( Figurasupplementare 5).
   2. Un grafico a linee dei valori del parametro selezionato verrà visualizzato nella finestra Visualizzatore grafico per ogni pianta. Rimuovere i dati dalle singole piante o aggiungerli al grafico facendo clic sui relativi simboli di legenda a destra del grafico. Nell'angolo in alto a destra, ci sono anche opzioni per esportare i dati come un foglio di calcolo e per l'ingrandimento della finestra del visualizzatore di grafici per riempire l'intero schermo (questa funzione di download dei dati grezzi è rilevante per tutte le altre finestre). Ulteriori opzioni per modificare il grafico verranno visualizzate se il cursore viene spostato nell'angolo superiore destro dello schermo ( Figura 5 ).
5. Il modulo dell'istogramma presenta la distribuzione di un singolo tratto all'interno e tra le popolazioni per un determinato periodo di tempo. Per utilizzare questo modulo, fare clic su Istogramma.
   1. Nella sezione Filtri impostare la data e l'ora, il parametro, le etichette e le piante come illustrato al punto 8.4.1. Selezionare più etichette (gruppi) facendo clic sul simbolo . Infine, fare clic su Mostra grafico( Figura 7 ).
   2. L'istogramma apparirà nella sezione Istogramma, in cui c'è la possibilità di cambiare i "Bins" e "Date" nella parte superiore dello schermo. Nell'angolo in alto a destra sono disponibili varie opzioni descritte nel passaggio 8.4.2. Nella sezione Diagramma della posizione, è possibile visualizzare la posizione effettiva delle piante sulla tabella sperimentale e i rispettivi valori di tratto ( Figura 7 ).
6. Fare clic su T-test. Per confrontare statisticamente i mezzi di qualsiasi tratto misurato di due gruppi, inserire le date, le etichette, le piante e i parametri nella sezione "Parametri di prova t", come spiegato al punto 8.4.1.
   1. Impostare l'intervallo di ore per calcolare i valori medi dei punti dati entro il periodo di tempo di interesse (il valore predefinito è una presentazione continua di 24 ore). Infine, fare clic su Mostra grafico ( Figurasupplementare 8).
   2. Sul lato destro dello schermo verranno visualizzate due finestre. La parte superiore è la sezione Visualizzatore grafico per tutte le piante selezionate da entrambi i gruppi. Sotto quella finestra si trova la sezione T-test, in cui apparirà il confronto dei due gruppi come t-test del parametro fisiologico selezionato. I livelli di significatività possono essere regolati modificando α valore nell'angolo superiore sinistro della sezione T-test. Sotto i valori significativamente diversi verrà visualizzato un punto rosso. Nell'angolo in alto a destra, visualizzare varie opzioni, come descritto nel passaggio 8.4.2 ( Figura 8 ).
7. Fare clic su ANOVA. Per confrontare statisticamente i mezzi di qualsiasi tratto misurato in più di due gruppi, immettere le date, le etichette, le piante e i parametri nella sezione "Filtri", come spiegato al punto 8.5.1.
   1. Selezionare più etichette (gruppi) facendo clic sul simbolo , come nel punto 8.5. Impostare l'intervallo di ore. Infine, fare clic su "SHOW GRAPH"( Figura 9 ).
   2. Nella sezione ANOVA, utilizzare un test ANOVA (HSD di Tukey) per confrontare i parametri fisiologici dei diversi gruppi. Le barre rappresentano gli errori standard (±SE). Nell'angolo in alto a destra dello schermo sono disponibili varie opzioni, come descritto nel passaggio 8.4.2. Fare clic sul grafico a linee per visualizzare un confronto a barre per un determinato giorno. Lettere diverse indicano gruppi significativamente diversi l'uno dall'altro ( Figura 9A ).
8. Presentare la relazione tra la cinetica della traspirazione di tutta la pianta o la conduttanza stomatica e la VWC è un modo più accurato per confrontare le risposte fisiologiche di diverse piante con la siccità, rispetto a un approccio basato sul tempo. Presentare questa relazione utilizzando la funzione "Curva lineare a forma di pezzo".
   1. Fare clic su Curva lineare a pezzi. Immettere le date, le etichette, le piante e i parametri (sia l'asse x che l'asse y) e quindi impostare l'intervallo di ore nella sezione "Filtri", come spiegato in precedenza.
      NOTA: la data "da" deve essere il più vicino possibile alla data di inizio del trattamento.
   2. Impostare il parametro dell'asse x su VWC e il parametro dell'asse y come parametro fisiologico di scelta (ad esempio, tasso di traspirazione, conduttanza stomata, ecc.). Infine, fare clic su Mostra grafico. Nella sezione "Filtro", fare clic su Seleziona tutte le raccomandazioni e quindi fare clic su Mostra grafico ( Figurasupplementare 10).
      NOTA: Altri parametri fisiologici (ad esempio, traspirazione normalizzata, tasso di traspirazione, peso iniziale dell'impianto, conduttanza stomata, flusso di radice, ecc.) e parametri ambientali (ad esempio, temperatura, umidità relativa, ecc.) sono facilmente ottenuti tramite il software SPAC (ad esempio Figura supplementare 9C). Per ulteriori informazioni sul background teorico dei loro calcoli, si prega di consultare Halperin et al. (2017).

Risultati

La durata dell'esperimento è stata di 29 giorni. L'esperimento è stato condotto nel mese di agosto, quando il clima locale è caldo e stabile e le giornate sono lunghe. Due diversi scenari di irrigazione sono stati utilizzati per dimostrare la capacità della piattaforma di fenotipazione per confrontare il comportamento fisiologico di tre diverse varietà di riso (ad esempio, Indica, Karla e Risotto) in presenza di stress da siccità. Ci sono stati due trattamenti per lo stress da siccità: (i) l'irrigazione ottimale [fino a quando ogni vaso ha raggiunto la sua capacità di vaso di notte dopo l'irrigazione (controllo)] e (ii) una siccità che è iniziata 5 giorni dopo l'inizio dell'esperimento, è durata per 14 giorni, ed è stata seguita da un periodo di recupero di 10 giorni (irrigazione ottimale, giorni 19–29). Per semplicità, non tutte le varietà e i gruppi sono mostrati nelle figure qui presentate. I risultati hanno mostrato che il sistema HTP-telemetrico è in grado di misurare in modo efficiente i cambiamenti nelle condizioni atmosferiche, nel suolo e nella fisiologia delle piante.

Condizioni ambientali

Le condizioni ambientali [radiazioni fotosinteticamente attive (PAR) e deficit di pressione di vapore (VPD)] sono state monitorate durante l'esperimento da una sonda atmosferica. I dati raccolti indicano che PAR e VPD sono rimasti simili nei diversi giorni e nel corso della giornata (Figura 4).

Il VWC dei vasi trattati con siccità è stato misurato dalle sonde del suolo durante tutto il periodo sperimentale. I dati VWC raccolti da un cv trattato in caso di siccità. L'impianto Indica è tracciato nella Figura 5.

Parametri fisiologici

La traspirazione giornaliera è gradualmente aumentata in tutti e quattro i trattamenti (Karla-control, Karla-drought, Risotto-control e Risotto-drought) durante la prima fase dell'esperimento, durante la quale tutte le piante sono state ben irrigate. Più tardi, c'è stata una riduzione della traspirazione che è stata associata al periodo di siccità (giorno 5 al giorno 18) nei due trattamenti privi di acqua. Successivamente, durante il periodo di recupero (dal giorno 18 in poi), la traspirazione giornaliera è aumentata di nuovo nei due gruppi privi d'acqua, ma ad un livello molto inferiore a quello osservato prima del trattamento della siccità (Figura supplementare 9B).

Il peso medio calcolato della pianta (cioè il tasso di aumento di peso delle piante) è aumentato costantemente sia tra il Karla-controllo e i trattamenti Karla-drought durante la prima fase dell'esperimento, quando tutte le piante hanno ricevuto irrigazione simile (Giorni 1-5). Quando il trattamento di siccità è stato applicato al cv. Impianti Karla (giorni 5-18), quelle piante hanno smesso di aumentare di peso e non hanno ripreso ad aumentare di peso fino alla fase di recupero. A quel punto, c'è stato un aumento di peso che ha proceduto più lentamente di quello che è stato osservato per il controllo. Al contrario, i pesi degli impianti di controllo Karlasonoaumentati continuamente per tutto il periodo sperimentale (Figura 6).

Figura 1: Componenti e configurazione del sistema di fenotipazione gravimetrica.
(A) Lysimetro di pesatura. Il lysimeter include la cella di carico, che converte il carico meccanico di un oggetto in una carica elettrica, e una piattaforma metallica che copre le parti superiore e inferiore della cella di carico, in modo che il peso dell'oggetto possa essere misurato correttamente. (B) Il lysimetro è coperto da un blocco di polistirolo e un coperchio in plastica per l'isolamento termico. (C) Scalare le parti. Un serbatoio d'acqua (contenitore verde) viene posto sul coperchio del lysimetro per raccogliere il liquido che drena dal vaso. Il contenitore verde è accoppiato ad una copertura verde, che ha una grande apertura rotonda attraverso la quale viene inserita la pentola. Un anello di guarnizione di gomma nera è attaccato a un lato del coperchio verde e la pentola è attaccata all'altro lato, per ridurre al minimo la perdita di acqua tramite evaporazione dal contenitore. Il coperchio verde ha due fori di campionamento (piccoli e grandi) sopra l'estensione di drenaggio, che sono sigillati con tappi di gomma. (D) Spine. Il contenitore ha un'estensione di drenaggio con quattro fori (con spine) ad altezze diverse, che possono essere utilizzati per regolare il livello dell'acqua nel contenitore dopo il drenaggio attraverso un particolare foro si ferma (il volume dell'acqua di riserva). Il volume d'acqua desiderato dipenderà dalle specie vegetali, dal tipo di mezzo di produzione utilizzato e dal fabbisogno idrico delle piante (cioè dal volume di traspirazione giornaliero stimato). (E) L'unità di controllo è costituita da una scatola rettangolare verde che contiene il controller elettronico e le valvole solenoidi. Ci sono fori attraverso i quali la soluzione di fertigazione può entrare ed uscire dai vasi, così come le prese per collegare la cella di carico e diversi sensori. Diversi trattamenti, come diversi livelli di salinità o diverse composizioni minerali, possono essere applicati tramite la soluzione di fertigazione. Un supporto metallico è collegato al controller, per tenere i tubi e i cavi e impedire loro di toccare le pentole e aggiungerepeso. Gli altri componenti necessari sono (F) sonde del suolo (ad esempio, umidità, temperatura e sensori EC - 5TE), gocciolatori a presa multi-outlet(perapplicazioni di fertigazione e/o trattamento) e (H) sonde atmosferiche [per la misurazione del deficit di pressione del vapore (VPD) e delle radiazioni]. (I) Matrice singola completamente attrezzata. (J) Matrice completamente attrezzata nella serra, frecce gialle che puntano le sonde atmosferiche che consente la normalizzazione della conduttanza stomata in base alle condizioni atmosferiche locali. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Parti necessarie per un singolo set-up di pentole.
(A–C) Sono necessari i seguenti componenti: un vaso da 4 L, un vaso da 4 L senza fondo per servire come supporto netto, un pezzo circolare di maglia di nylon (dimensioni del poro - 60 maglie) con un diametro doppio rispetto al fondo della pentola, una copertura con fori designati per gocciolatori vegetali e di irrigazione, un bastone di fibra di vetro bianco (palo) e un anello di guarnizione nera. (D) Esempio di un piano di tabella in cui i vasi sono stati randomizzati. Nella serra, ogni tabella aveva 1-18 colonne e quattro righe, qui abbiamo usato 24 posizioni. Tuttavia, la struttura della matrice può essere facilmente regolata a qualsiasi forma in base alle dimensioni della serra. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Configurazione del pot.
(A) Piante che crescono in vassoi di cavità. (Le piantine di pomodoro qui mostrate sono solo un esempio; molte altre specie vegetali potrebbero essere coltivate allo stesso modo). (B) Cast di stampi per (C) che creano cavità nel mezzo di vaso che (D) si adattano strettamente ai tappi radice-suolo delle piantine, per garantire il trapianto di (E) le piantine nei vasi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Condizioni atmosferiche nel corso dell'esperimento.
L'asse y a destra mostra il deficit giornaliero di pressione del vapore (VPD) e l'asse y a sinistra mostra la radiazione fotosinteticamente attiva (PAR) nei 29 giorni consecutivi dell'esperimento. Questo grafico è stato prodotto dal software di analisi dei dati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Contenuto di acqua volumetrica (VWC) misurato da una sonda del suolo nel corso dell'esperimento.
I dati rappresentano i valori VWC per un cv. Impianto Indica che è stato sottoposto al trattamento della siccità per l'intero periodo dell'esperimento, compreso il recupero. Questo grafico è stato prodotto dal software di analisi dei dati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: pesi vegetali interi (mezzi ± SE) per l'intero periodo sperimentale per cv. Karla in condizioni di ben irrigato (controllo) e siccità.
I gruppi sono stati confrontati utilizzando ANOVA (HSD di Tukey; p < 0.05). Ogni media ± SE rappresenta almeno quattro piante. Il grafico e l'analisi statistica sono stati prodotti dal software di analisi dei dati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Finestre software operative per l'impostazione di un esperimento. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 2: tabella "Piante" come foglio di calcolo; Software operativo. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 3: Finestra software per il calcolo del peso secco del suolo; Software operativo. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 4: finestra del software per l'impostazione di un trattamento di irrigazione; Software operativo. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 5: finestra Visualizzatore grafico analisi dati. Nel nostro esperimento, abbiamo usato tre cultivar di riso (cioè Indica, Karla e Risotto) e due diversi scenari di irrigazione, ben irrigati (controllo) e siccità. I dati grezzi hanno rivelato variazioni nel peso delle piante nel corso dell'esperimento. Ogni linea rappresenta una pianta/vaso. Durante il giorno, le piante sono trasversate, in modo che il sistema ha perso peso, come si può vedere nelle pendici delle curve quotidiane. I vasi sono stati irrigati ogni notte a piena capacità, come rappresentato come le cime nelle curve. L'evento di irrigazione è stato seguito dal drenaggio di qualsiasi acqua in eccesso dopo che il mezzo di potting era stato saturo. Inizialmente, tutte le piante erano ben irrigate (controllo). Dal 7 agosto 2018, metà delle piante sono state sottoposte a un trattamento per la siccità. Allo stesso tempo, il resto delle piante ha continuato a ricevere un'irrigazione ottimale. Il recupero differenziale è stato ottenuto ripristinando l'irrigazione alle piante trattate in siccità, a partire dal 20 agosto 2018 (consentendo a ciascuna pianta di sperimentare un simile grado di stress) e continuando fino alla fine dell'esperimento. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Lo strumento di irrigazione del feedback del sistema consente all'utente di progettare programmi di irrigazione per ogni singolo vaso in base al tempo, al peso della pentola, ai dati provenienti da un sensore del suolo (ad esempio, VWC) o dalla traspirazione delle piante nel giorno precedente. Ogni pianta può essere irrigata singolarmente in modo personalizzato in base alle proprie prestazioni. Questa irrigazione differenziale riduce al minimo le differenze tra il contenuto di acqua del suolo delle piante, in modo che tutte le piante siano esposte a un trattamento controllato della siccità indipendentemente dalle loro esigenze individuali di acqua.

Figura supplementare 6: finestra Analisi dei dati per l'analisi dei dati. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 7: finestra dell'istogramma di analisi dei dati. Questa figura mostra una rappresentazione grafica della distribuzione dei valori di traspirazione giornaliera nelle tre diverse cultivar di riso (ad esempio, Indica, Karla e Risotto) in condizioni ben irrigate (controllo). Il diagramma inferiore rappresenta una visualizzazione della mappa termica delle piante transpiration giornaliera in base alla posizione fisica dei vasi sul tavolo. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 8: finestra di test T di analisi dei dati. Le linee rappresentano le differenze nella traspirazione quotidiana (un tratto fisiologico fondamentale e importante) tra due cultivar di riso (cioè Karla e Risotto) in condizioni ben irrigate (controllo). La finestra mostra la traspirazione giornaliera delle singole piante (in alto a destra) e un confronto dei mezzi ± SE di ogni gruppo condotto utilizzando Student's t-test (in basso a destra). L'analisi statistica è stata eseguita automaticamente dal software. I punti rossi rappresentano differenze significative tra i trattamenti secondo i test t dellostudente; p < 0.05. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 9: finestra ANOVA analisi dei dati. (A) Rappresentazione grafica delle differenze nella traspirazione quotidiana tra due varietà di riso (ad esempio Karla e Risotto) sotto condizioni ben irrigate (controllo) e siccità durante l'intero periodo sperimentale. Il trattamento per la siccità è stato iniziato 5 giorni dopo l'inizio dell'esperimento. Cliccando in qualsiasi giorno presenterà il confronto (B) Gruppi utilizzando ANOVA (HSD di Tukey; p < 0.05), qui il 12 agosto. Ogni media ± SE rappresenta almeno quattro piante. Gli stessi gruppi potrebbero anche essere presentati come un tasso di traspirazione dell'intera pianta (Means ± SE) per l'intero periodo sperimentale. I grafici e l'analisi statistica sono stati prodotti dal software di analisi dei dati. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 10: Finestra della curva lineare pezzo-saggio di analisi dei dati. Questa finestra mostra le curve lineari a pezzi di tre cultivar di riso (ad esempio, Indica, Karla e Risotto) in condizioni di siccità. Il software può eseguire un'analisi lineare della vestibilità del rapporto tra qualsiasi parametro fisiologico (qui, traspirazione quotidiana) e il contenuto di acqua volumetrica calcolato (VWC) delle piante sottoposte al trattamento della siccità. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

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Medio	Descrizione
Sabbia grossolana	Sabbia di silice 20-30 (schermi a rete superiore e inferiore attraverso i quali è stata passata la sabbia: rispettivamente 0,841 e 0,595 mm)
Sabbia	Sabbia di silice 75-90 (schermi a rete superiore e inferiore attraverso i quali è stata passata la sabbia: rispettivamente 0,291 e 0,163 mm)
Terreno a base di torba	Klasmann 686
Suolo loamy (suolo naturale)	Terreno di sabbia loam preso dallo strato superiore di un terreno presso la fattoria sperimentale della Facoltà di Agricoltura, Alimentazione e Ambiente, Rehovot, Israele
Vermiculite	Vermiculite 3G
Perlite	Perlite 212 (Intervallo dimensioni: 0,5-2,5 mm)
Compost	Bental 11 Terrino da vaso
Poroso, ceramica, di medie dimensioni	Profilo Porrous Ceramic 20-50 (schermi a maglia superiore e inferiore attraverso i quali è stata passata la ceramica di terra: rispettivamente 0,841 e 0,297 mm)
Poroso, ceramica, medio misto	Profilo Ceramica Porosa 50% 20-50 maglia e 50% 20-6 maglia, 0.841– 3.36 mm

Tabella 1: Mezzi di comunicazione in vaso.

Tipo di supporto del suolo / Parametri	Sabbia grossolana	Sabbia	Terreno loamy	Perlite	Vermiculite	Ceramica porosa di dimensioni miste	Ceramica porosa di piccole dimensioni	Terreno a base di torba	Compost
Acqua totale (TW, ml)	860 ± 7,2 (F)	883,1 ± 24 (F)	1076,3 ± 35,9 (E)	1119,9 ± 8,5 (E)	1286 ± 22,4 (D)	1503,6 ± 15,4 (C)	1713 ± 25,9 (B)	1744.3 ± 8.2 (B)	2089.6 ± 61,6 (A)
Contenuto di acqua volumetrica (VWC, ml3/ml3)	0,26 (F)	0,27 (F)	0,33 (E)	0,35 (E)	0,4 (D)	0,46 (C)	0,53 (B)	0,54 (B)	0,65 (A)
Densità di massa (BD, g/cm3)	1.7 (A)	1.6 (B)	1.5(C)	0,1 (H)	0,2 (F)	0,8 (D)	0,7 (E)	0,2 (G)	0,1 (G)
Stabilità del peso del suolo (SWS, g/d)	±2,3 ± 0,3 (B)	±4,3 ± 0,3 (B)	±2,9 ± 0,9 (B)	±14,9 ± 0,7 (A)	±7,6 ± 2,8 (B)	±1,3 ± 0,1 (B)	±1,9 ± 0,4 (B)	±6,7 ± 0,8 (B)	±4,3 ± 1,2 (B)
Stabilità del peso del suolo con acqua riservata nella vasca da bagno (g/giorno; si prega di consultare la sezione 6.14)	3 ± 0,4 (B)	3,3 ± 0,4 (B)	3.2 ± 1,2 (B)	6,3 ± 0,5 (A)	2,7 ± 0,8 (B)	1,6 ± 0,3 (B)	1,9 ± 0,3 (B)	10,6 ± 3 (A)	1,5 ± 0,3 (B)
Contenuto di umidità gravimetrica della capacità di pot (SWC; si prega di consultare la Sezione 8.2)	0,18 (G)	0,23 (G)	0,23 (G)	3.79 (C)	3.0 (D)	0,74 (F)	0,99 (E)	4.25 (B)	6.13 (A)
Capacità di drenaggio relativa	Eccellente	Medio	Medio-basso	Eccellente	Eccellente	Eccellente	Eccellente	Basso	Medio
Tempo relativo per raggiungere la capacità del vaso	veloce	veloce	veloce	Lento	Lento	veloce	veloce	Lento	Lento
Capacità di scambio di cation relativa (CEC)	Basso	Basso	Basso	Basso	alto	alto	alto	alto	alto
Compatibilità con:
Lavaggio delle radici (alla fine dell'esperimento)	++	++	+	++	+	++	++	-	-
Trattamento nutritivo/biostimolante	++	++	-	++	+	+	+	-	-
Trattamenti di salinità	++	++	+	++	+	++	++	+	-
Misurazione accurata dei tassi di crescita	++	++	+	-,+	+	++	+++	+	+
Recupero della struttura fisica del suolo dopo la siccità	+++	+++	++	+	-	+++	+++	-,+	-
Acqua totale (TW, ml) - peso umido del suolo (alla capacità del vaso) – peso secco del suolo. Contenuto di acqua volumetrica (VWC) - volume TW/suolo.
Densità di massa (BD) - peso secco del suolo/volume del suolo. Stabilità del peso del suolo (SWS) - Variazione media del peso umido del suolo per 4 giorni consecutivi (media alla capacità del vaso senza pianta dopo l'ultima irrigazione).
Capacità di pot contenuto di umidità gravimetrica (SWC); per il calcolo, vedere la Sezione 7.2.

Tabella 2: Caratteristiche generali di 9 diversi supporti per l'uso e la loro compatibilità con la piattaforma gravimetrica. Le misurazioni sono state prese utilizzando vasi da 4 L riempiti con 3,2 L di media capacità di campo (capacità di pot). I dati vengono visualizzati come mezzi ± SE. Lettere diverse nelle colonne indicano differenze significative tra i supporti, secondo il test HSD di Tukey (P < 0.05; 3 ≤ n ≤ 5).

Componenti di fertigazione	Concentrazione finale (ppm)	Concentrazione finale (mM)
NaNO3	195.8	2.3
H3PO4	209	0.000969
KNO3	271.4	2.685
MgSO4	75	0.623
NSO4	0.748	0.0025
CuSO4	0.496	0.00198
MoO3	0.131	0.00081
MnSO4	3.441	0.0154
Borace	0.3	0.00078
C10H12N2NaFeO8 (Fe)	8.66	0.0204
Il pH della soluzione di irrigazione finale dal gocciolatore (dopo la diluizione con acqua del rubinetto) variava tra 6,5 e 7.

Tabella 3: Componenti di fertigazione.

Discussione

Il divario di conoscenza genotipo-fenotipo riflette la complessità delle interazioni dell'ambiente genotipo x^{(revisionato da 18,24}). Potrebbe essere possibile colmare questa lacuna attraverso l'uso di piattaforme di screening ad alta risoluzione, HTP-telemetrica e fenotipico che possono essere utilizzate per studiare le prestazioni fisiologiche dell'intera pianta e la cinetica della relazione^{dell'acqua 8,9}. La complessità delle interazioni dell'ambiente genotipo x rende la fenotipazione una sfida, in particolare alla luce della rapida risposta delle piante ai loro ambienti mutevoli. Sebbene attualmente siano disponibili vari sistemi di fenotipazione, la maggior parte di questi sistemi si basa su tecniche di telerilevamento e imaging avanzate. Sebbene tali sistemi forniscano misurazioni simultanee, in una certa misura, le loro misurazioni sono limitate ai tratti fisiologici morfologici e^{indiretti 25}. I tratti fisiologici sono molto importanti nel contesto della reattività o della sensibilità alle condizioni ambientali²⁶. Pertanto, le misurazioni dirette eseguite continuamente e simultaneamente ad una risoluzione molto elevata (ad esempio, intervalli di 3 minuti) possono fornire una descrizione molto accurata del comportamento fisiologico di una pianta. Nonostante questi notevoli vantaggi del sistema gravimetrico, è necessario tenere conto anche del fatto che questo sistema presenta alcuni svantaggi potenziali. I principali svantaggi derivano dalla necessità di lavorare con i vasi e in condizioni di serra, che possono presentare grandi sfide per la regolamentazione del trattamento (in particolare la regolamentazione dei trattamenti per la siccità) e la ripetibilità sperimentale.

Al fine di affrontare questi problemi, si dovrebbe standardizzare le sollecitazioni applicate, creare una struttura sperimentale veramente randomizzata, ridurre al minimo gli effetti del vaso e confrontare più comportamenti dinamici delle piante in condizioni ambientali mutevoli entro un breve periodo di tempo. L'approccio di fenotipazione funzionale HTP-telemetrico descritto in questo documento affronta tali problemi come indicato di seguito.

Al fine di correlare la risposta dinamica dell'impianto con il suo ambiente dinamico e acquisire un quadro completo e ampio delle complesse interazioni tra impianto e ambiente, sia le condizioni ambientali (Figura 4) che le risposte alle piante (Figura supplementare 9B) devono essere misurate continuamente. Questo metodo consente di misurazione dei cambiamenti fisici nel mezzo di vaso e nell'atmosfera in modo continuo e simultaneo, insieme ai tratti delle piante (continuum suolo-pianta-atmosfera, SPAC).

Per prevedere al meglio come le piante si comporteranno sul campo, è importante eseguire il processo di fenotipazione in condizioni che siano il più simili possibile a quelle presenti nel campo¹⁸. Conduciamo gli esperimenti in una serra in condizioni semi-controllate per imitare il più possibile le condizioni di campo. Una delle condizioni più importanti è il mezzo di crescita o di potting. È fondamentale selezionare il mezzo di potting più adatto per l'esperimento del sistema gravimetrico. Si consiglia di scegliere un mezzo di terreno che drena rapidamente, consente il rapido raggiungimento della capacità del vaso e ha una capacità di vaso altamente stabile, in quanto tali caratteristiche consentono misurazioni più accurate da parte del sistema gravimetrico. Inoltre, devono essere considerati anche i diversi trattamenti da applicare nell'esperimento. Ad esempio, i trattamenti che coinvolgono sali, fertilizzanti o sostanze chimiche prevedono l'uso di un mezzo di produzione inerte, preferibilmente con una bassa capacità di scambio di cation. I trattamenti di siccità applicati alle specie vegetali a bassa trasparenze funzionerebbero meglio con i mezzi di produzione con livelli di VWC relativamente bassi. Al contrario, i trattamenti lenti di siccità applicati agli impianti ad alta trasparenze funzionerebbero meglio con i supporti di produzione con livelli di VWC relativamente elevati. Se le radici sono necessarie per l'analisi post-esperimento (ad esempio, morfologia delle radici, peso secco, ecc.), l'uso di un mezzo con un contenuto di materia organica relativamente basso (ad esempio, sabbia, ceramica porosa o perlite) renderà più facile lavare le radici senza danneggiarle. Per gli esperimenti che continueranno per periodi più lunghi, è consigliabile evitare i media ricchi di materia organica, in quanto la materia organica può decomporsi con il tempo. Per informazioni più dettagliate su questo argomento, vedere la Tabella 1 e la Tabella 2.

La fenotipazione sul campo e la fenotipazione della serra (pre-campo) hanno i propri obiettivi e richiedono diversi allescari sperimentali. La fenotipazione pre-campo aiuta la selezione di promettenti genotipi candidati che hanno un'alta probabilità di fare bene sul campo, per contribuire a rendere le prove sul campo più mirate e convenienti. Tuttavia, la fenotipazione pre-campo comporta una serie di limitazioni (ad esempio, effetti di vaso) che possono causare le prestazioni delle piante in modo diverso rispetto alle condizioni di^{campo 18,27}. Piccole dimensioni del vaso, perdita d'acqua per evaporazione e riscaldamento delle scale di lysimeter sono esempi di fattori negli esperimenti serra che possono portare agli effetti del vaso¹⁸. Il metodo qui descritto è progettato per ridurre al minimo tali potenziali effetti nel modo seguente:

(a) La dimensione del vaso viene scelta in base al genotipo da esaminare. Il sistema è in grado di sostenere varie dimensioni del vaso (fino a 25 L) e trattamenti di irrigazione, che consente l'esame di qualsiasi tipo di pianta da coltura.
(b) I vasi e le squame del lysimetro sono isolati per evitare che il calore venga trasferito e qualsiasi riscaldamento dei vasi.
(c) Questo sistema prevede un sistema di irrigazione e drenaggio attentamente progettato.
(d) C'è un controller separato per ogni vaso, per consentire una vera randomizzazione con trattamenti auto-irriganti e auto-monitorati.
(e) Il software tiene conto del VPD locale delle piante nel calcolo della conduttanza stoccata a baldacchino. Vedere la localizzazione di più stazioni VPD nella Figura 1J.

Questo sistema comporta misurazioni fisiologiche dirette a densità di piante simili al campo, che elimina la necessità di grandi spazi tra le piante o di spostare le piante per fenotipizzazione basata sull'immagine. Questo sistema include l'analisi dei dati in tempo reale, nonché la capacità di rilevare con precisione il punto di stress fisiologico (θ) di ogni pianta. Ciò consente al ricercatore di monitorare le piante e prendere decisioni su come l'esperimento deve essere condotto e come tutti i campioni devono essere raccolti nel corso dell'esperimento. La calibrazione del peso semplice e semplice del sistema facilita una calibrazione efficiente. I sistemi ad alta velocità effettiva generano enormi quantità di dati, che presentano ulteriori problemi analitici e di gestione dei^{dati 11,12}. L'analisi in tempo reale dei big data che vengono direttamente alimentati al software dal controller è un passo importante nella traduzione dei dati nella^{conoscenza 14} che ha un grande valore per il processo decisionale pratico.

Questo metodo di fenotipazione fisiologica HTP-telemetrica potrebbe essere utile per condurre esperimenti serra in condizioni di campo ravvicinato. Il sistema è in grado di misurare e calcolare direttamente le risposte fisiologiche delle piante legate all'acqua al loro ambiente dinamico, superando in modo efficiente la maggior parte dei problemi associati all'effetto pot. Le capacità di questo sistema sono estremamente importanti nella fase di fenotipizzazione pre-campo, in quanto offrono la possibilità di prevedere le sanzioni di rendimento durante le prime fasi della crescita delle piante.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atmospheric Probes	SpectrumTech/Meter group	3686WD	Watchdog 2475
		40027	VP4
Array Randomizer		None	The software "Array Randomizer" can be used for creating an experimental design of a randomized block design, or fully random design. It was developed to have better control over the random distribution of the experimental samples (plants) in order to normalize the atmospheric microvariation inside the greenhouse.
			Free download and more information, please click on the following link: https://drive.google.com/open?id=1y4QbTpxRK5Lx430xzu1RFdrlcL8pz_1q
Cavity trays	Danish size with curved rim for nursery	30162	4X4X7 Cell, 84 cell per tray https://desch.nl/en/products/seed_propagation_trays/danish-size-with-curved-rim-for-nursery~p92
Coarse sand	Negev Industrial Minerals Ltd., Israel
Compost	Tuff Marom Golan, Israel
Data Analysis software	Plant-Ditech Ltd., Israel		SPAC Analytics
Drippers	Netafim	21500-001520	PCJ 8L/h
Fine sand	Negev Industrial Minerals Ltd., Israel
Loamy soil (natural soil)
Nylon mesh	Not relevant (generic products)
Operating software	Plant-Ditech Ltd., Israel		Plantarray Feedback Control (PFC)
Peat-based soil	Klasmann-Deilmann GmbH, Germany
Perlite	Agrekal , Israel
Plantarray 3.0 system	Plant-Ditech Ltd., Israel	SCA400s	Weighing lysimeters
		PLA300S	Planter unit container
		CON100	Control unit
		part of the planter set	Fiberglass stick
		part of the planter set	Gasket ring
			Operating software
			SPAC Analytics software
Porous, ceramic, mixed-sized medium	Greens Grade, PROFILE Products LLC., USA
Porous, ceramic, small-sized medium	Greens Grade, PROFILE Products LLC., USA
Pots	Not relevant (generic products)
Soil	Bental 11 by Tuff Marom Golan
Soil Probes	Meter group	40567	5TE
		40636	5TM
		40478	GS3
Vermiculite	Agrekal , Israel