Metodo di interferenza dell'RNA mediato dall'elettroporazione in Odonata

Riepilogo

Forniamo un protocollo dettagliato per l'interferenza dell'RNA mediato dall'elettroporazione negli insetti dell'ordine Odonata (libellule e damselflies) usando il damselfly dalla coda blu (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) e la libellula skimmer pied(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Abstract

Libellule e damselflies (ordine Odonata) rappresentano uno degli insetti più ancestrali con metamorfosi, in cui cambiano drasticamente il loro habitat, morfologia e comportamento dalle larve acquatiche agli adulti terrestri / aerei senza stadio pupale. Gli adulti odonata hanno una visione del colore ben sviluppata e mostrano una notevole diversità nei colori e nei motivi del corpo tra sessi, stadi e specie. Mentre sono stati condotti molti studi ecologici e comportamentali sull'Odonata, gli studi genetici molecolari sono stati scarsi principalmente a causa della difficoltà di applicare l'analisi funzionale genica all'Odonata. Per esempio, l'interferenza dell'RNA (RNAi) è meno efficace nell'Odonata, come riportato nei Lepidotteri. Per superare questo problema, abbiamo stabilito con successo un metodo RNAi combinato con l'elettroporazione in vivo. Qui forniamo un protocollo dettagliato che include un video del metodo RNAi mediato dall'elettroporazione come segue: preparazione delle larve, identificazione delle specie, preparazione della soluzione di dsRNA / siRNA e aghi di iniezione, anestesia ghiacciata delle larve, iniezione di dsRNA / siRNA, elettroporazione in vivo e allevamento individuale fino all'emergere adulto. Il metodo RNAi mediato dall'elettroporazione è applicabile sia alle damselflies (sottordine Zygoptera) che alle libellule (sottordine Anisoptera). In questo protocollo, presentiamo i metodi per la damigella dalla coda blu Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) come esempio di specie damselfly e la libellula skimmer pied Pseudothemis zonata (Libellulidae) come un altro esempio di specie di libellula. Come esempi rappresentativi, mostriamo i risultati di RNAi che prendono di mira il gene di sintesi della melanina multicopper ossidasi 2. Questo metodo RNAi faciliterà la comprensione di varie funzioni geniche coinvolte nella metamorfosi, morfogenesi, formazione di modelli di colore e altre caratteristiche biologiche dell'Odonata. Inoltre, questo protocollo può essere generalmente applicabile agli organismi non modello in cui la RNAi è meno efficace nella soppressione genica a causa dell'inefficienza e della bassa penetranza.

Introduzione

Libellule e damselflies (l'ordine Odonata) sono tra i gruppi di insetti più ancestrali che mostrano "metamorfosi"^1,2. Per metamorfosi, cambiano drasticamente il loro habitat, morfologia e comportamento dalle larve acquatiche agli adulti terrestri / aerei³. Gli adulti odonata hanno una visione del colore ben sviluppata e rappresentano una notevole diversità nei colori e nei motivi del corpo tra sessi, stadi e^{specie 3,4,5}. Mentre molti studi ecologici e comportamentali sull'Odonata sono stati^{condotti 6,7}, gli studi genetici molecolari sono stati ostacolati principalmente dalla difficoltà di applicare l'analisi funzionale genica all'Odonata.

Il metodo convenzionale di interferenza dell'RNA (RNAi), in cui l'RNA a doppio filamento (dsRNA) viene iniettato per sopprimere la funzione del gene^{di interesse 8}, si è rivelato inefficace negli insetti Odonata^9,come riportato negli insetti Lepidopteran¹⁰. D'altra parte, rapporti precedenti hanno suggerito che l'RNAi mediato dall'elettroporazione è efficace nelle specie di lepidotteri, specialmente nei tessuti epidermici^11,12,13. Recentemente abbiamo scoperto che l'RNAi mediato dall'elettroporazione funziona efficacemente nella piccola libellula Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)⁹, ma N. pygmaea è una specie relativamente rara e quindi non adatta per studi genetici molecolari.

La maggior parte delle specie di Odonata sono classificate in uno dei due sottordini, Zygoptera (damselflies) o Anisoptera (vere libellule)³. Qui ci siamo concentrati sulla damselfly dalla coda blu Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figura 1A) come specie rappresentativa degli Zigotteri e della libellula pied skimmer Pseudothemis zonata (Libellulidae; Figura 1B) come specie rappresentativa di Anisopteran. Le due specie sono tra le specie di Odonata più comuni negli stagni naturali e urbani in Giappone, comprese quelle della città di Tsukuba, e possiamo raccogliere molte larve delle due specie nel campo. Recentemente abbiamo istituito un sistema di allevamento in laboratorio per le singole larve di I. senegalensis,che ha permesso il monitoraggio continuo dello sviluppo e della morfogenesi delle larve di Odonata nel dettaglio^14.

In questa relazione, forniamo un metodo raffinato e un protocollo video per l'RNAi mediato dall'elettroporazione in I. senegalensis e P. zonata. In Giappone, I. senegalensis e Ischnura asiatica, che sono geneticamente vicine, si trovano spesso sympatrically¹⁵e sono difficili da distinguere nelle larve¹⁶. Descriviamo anche come due specie di Ischnura possono essere distinte per polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP).

Per valutare l'efficacia del RNAi mediato dall'elettroporazione, selezioniamo il gene multicopper ossidasi 2 (MCO2; noto anche come laccasi2) come gene bersaglio rappresentativo, a causa del fenotipo visibile del colore della cuticola più pallide al knockdown dell'espressione genica⁹. MCO2 è noto per essere essenziale per oscurare l'epidermide in una varietà di specie di^{insetti 17,18}.

Protocollo

NOTA: Lo schema generale dei protocolli è illustrato nella figura 1.

1. Preparazione di larve di libellule o damigella.

1. Raccogli le larve sul campo usando una rete a mano.
   NOTA: Le larve di I. senegalensis spesso si aggrappano alle piante acquatiche che galleggiano sulla superficie dell'acqua, mentre le larve di P. zonata spesso rimangono tra i rifiuti fogliari sul fondo. Nella città di Tsukuba, le larve instar finali di I. senegalensis si trovano principalmente da marzo a giugno e quelle di P. zonata da maggio a giugno. Le larve di I. senegalensis possono essere allevate dalle uova nel^{laboratorio 14}, ma le larve raccolte sul campo hanno il tasso di successo chiaramente più elevato dell'emergenza adulta.
2. Identificazione delle specie mediante restrizione del polimorfismo della lunghezza dei frammenti (RFLP) dei prodotti amplificati dalla PCR.
   NOTA: Questo passaggio è necessario solo se la specie è difficile da identificare dall'aspetto delle larve, come in I. senegalensis.
   1. Tenere una delle branchie caudali di una larva usando le forcep. Quindi, la larva cade dalla sua branchia caudale stessa (causando autotomia).
      NOTA: Le larve di damselflie degli zigotteri di solito hanno tre branchie caudali (Figura 1A). Quando vengono attaccati da un predatore, possono togliersi le proprie branchie caudali per fuggire. Se la branchia caudale non è disponibile, una porzione della gamba viene sezionata.
   2. Mettere una branchia caudale in 100 μL di soluzione PBS [0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na₂HPO₄e 0,02% KH₂PO₄ (w/v)] e omogeneizzare con un miscelatore a mano utilizzando un pestello di deposito.
   3. Spin giù la miscela a 5.000 x g per 10 secondi, e soggetto 0,5 μL del supernatante all'amplificazione PCR usando DNA polimerasi e primer per amplificare la regione interna trascritta distanziale 1 (ITS1) del DNA nucleare.
      NOTA: Eseguire la PCR in base al protocollo del produttore. La combinazione di primer ITS-F0 (5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3') e 5.8S-AS1 (5'- GCC GGC CCT CAG CCA G -3') può amplificare la regione ITS1 in quasi tutte le specie di Odonata¹⁹.
   4. Incubare la miscela di 1 μL di prodotto amplificato da PCR, 0,3 μL di tampone 10x M, 0,1 μL di enzima di restrizione DraI e 1,6 μL di acqua a 37 °C per 1 h.
      NOTA: Selezionare i migliori enzimi di restrizione, a seconda della combinazione di specie. Se non ci sono enzimi di restrizione adatti per l'identificazione delle specie, confermare con il sequenziamento del DNA.
   5. Caricare 2 μL dei prodotti con colorante di carico su gel di agarosio al 2% ed eseguire l'elettroforesi.
      NOTA: È difficile identificare le specie quando si utilizza gel di agarosio all'1% o all'1,5%.
   6. Controllare il modello di elettroforesi per identificare la specie (Figura 2).
      NOTA: I modelli RFLP dipendono dalle specie e dalla popolazione. Nella popolazione di Tsukuba, I. asiatica ha una banda maggiore di 400-500 bp, mentre I. senegalensis ha una banda maggiore di circa 200 bp e una banda aggiuntiva inferiore a 100 bp (una punta di freccia nella figura 2). La regione ITS1 esiste in più copie nel genoma, e nelle specie di Ischnura, il polimorfismo microsatellita all'interno della regione ITS1 è spesso presente nello stesso individuo, influenzando il modello degli RFLP.
3. Allevare le larve raccolte in laboratorio fino all'uso per RNAi.
   1. Posizionare ogni larva separatamente in ogni pozzo di un piatto di 12 po 'con circa 3 mL di acqua.
      NOTA: Le larve di I. senegalensis devono essere tenute singolarmente perché spesso si cannibalizzano a vicenda, mentre le larve di P. zonata possono essere tenute in gruppo perché raramente cannibalizzano.
   2. Nutrire le larve di I. senegalensis con gamberetti salamoia Artemia ogni giorno e larve di P. zonata con bloodworms e/o vermi Tubifex almeno due volte a settimana fino a quando non crescono fino alla fase di sviluppo adatta per RNAi.
      NOTA: L'alimentazione frequente è fondamentale per aumentare il tasso di successo dell'emergenza adulta.
   3. Cambiare l'acqua non appena si sporca con feci o avanzi.
      NOTA: Il frequente cambiamento dell'acqua è anche importante per aumentare il tasso di successo dell'emergenza adulta.
   4. Giudica la fase di sviluppo appropriata per RNAi.
      NOTA: Le larve instar finali di I. senegalensis possono essere classificate in cinque fasi di sviluppo^14,20. Il primo stadio (stadio A, prima che le ali inizino ad espandersi) o il secondo stadio (stadio B) delle larve instar finali è adatto per gli esperimenti RNAi, quando si considera il fenotipo chiaro di RNAi dopo l'emergere adulto (vedi Discussione). In P. zonata, le larve instar finali prima dell'espansione delle ali (corrispondenti allo stadio A di I. senegalensis) sono state utilizzate in questo studio.

2. Preparazione della soluzione di dsRNA/siRNA e aghi di iniezione per RNAi.

NOTA: Selezionare l'RNA interferente piccolo (siRNA) (fase 2.1) o l'RNA a doppio filamento (dsRNA) (fase 2.2) come soluzione per RNAi.

1. Preparazione della soluzione di siRNA
   1. Progettare siRNA utilizzando il programma siDirect versione 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)²¹, seguendo le linee guida precedentemente riportate in Lepidopteran insects²².
   2. Ottenere siRNA sintetizzato commercialmente.
      NOTA: Le sequenze di siRNA che prendono di mira il gene MCO2 di I. senegalensis utilizzato in questo studio sono state le seguenti: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3' per il filamento di senso e 5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3' per il filamento antisenso. Come controllo negativo, le sequenze di siRNA mirate al gene delle proteine fluorescenti verdi potenziate (EGFP)erano le seguenti: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3' per il filamento di senso e 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3' per il filamento antisenso¹¹.
   3. Diluire il siRNA a 100 μM con tampone di iniezione [100 mM CH₃COOK, 2 mM Mg(CH₃COO)₂, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]²².
   4. Conservare a -80 °C fino all'uso.
2. Preparazione della soluzione di dsRNA.
   1. Selezionate una regione di 300-400 bp per dsRNA utilizzando il programma primer3 versione 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)²³ e progettate i set di primer.
   2. Ottenere set di primer sintetizzati commercialmente.
      NOTA: Per produrre modelli per la sintesi del dsRNA, i set di primer utilizzati in questo studio sono stati i seguenti: (5'- GCC TGT CAG CTT TGT CTT CC -3' per il primer in avanti e 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3' per il primer inverso) per i geni MCO2 di I. senegalensis (IsMCO2, numero di adesione. LC589180) e (5'- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3' per il primer forward e 5'- GGA TTC CTT CAT CGA CA -3' per il primer inverso) per i geni MCO2 di P. zonata (PzMCO2, adesione n. LC589179). Come controllo negativo, il set di primer per il dsRNA che prende di mira il gene β-lattamasi (bla) sul vettore di clonazione erano (5'- CTA TGT GGC GCG GTA TTA T -3' per il primer in avanti e 5'- CAG AAG TGG TGG TCC TGC AAC T -3' per il primer inverso).
   3. Estrarre l'RNA dalle larve di Odonata utilizzando un kit di estrazione dell'RNA disponibile in commercio ed eseguire la sintesi cDNA utilizzando la transcriptasi inversa secondo il protocollo del produttore.
      NOTA: può essere utilizzata anche la libreria cDNA preparata per l'analisi del sequenziamento dell'RNA.
   4. Amplificare le sequenze di destinazione utilizzando il cDNA sintetizzato e il set di primer progettato e clonarle nel vettore di clonazione utilizzando una ligasi commerciale secondo il protocollo del produttore.
   5. Trasforma il plasmide in cellule competenti di E. coli e raccogli una singola colonia dopo l'incubazione notturna.
   6. PCR amplifica l'area di inserimento utilizzando i primer sul vettore.
   7. Confermare la sequenza clonata sequenziando Sanger.
   8. PCR amplificare l'inserto utilizzando primer vettoriali contenenti la sequenza di promotore della polimerasi^{T7 24, 25}.
      NOTA: In questo studio sono stati utilizzati i seguenti primer: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') e T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAGGAC CCG GGG ATC CGA T - 3') ²⁵.
   9. Purificare il prodotto PCR utilizzando il kit di purificazione PCR secondo il protocollo del produttore, eludere il DNA con 50 μL di acqua distillata e concentrare la soluzione di DNA eluito a circa 10 μL utilizzando un evaporatore centrifugo.
   10. Sintetizzare dsRNA mediante trascrizione in vitro secondo il protocollo del produttore. Utilizzare un totale di 1000 ng modello DNA ed elute sintetizzato dsRNA con 100 μL di tampone di eluizione.
   11. Misurare la concentrazione di dsRNA utilizzando uno spettrofotometro e confermare la qualità del dsRNA per elettroforesi su un gel di agarosio all'1,5%.
       NOTA: Una singola banda può essere vista quando la sintesi di dsRNA ha successo.
   12. Diluire l'dsRNA a 1000 ng/μL con tampone di eluizione e conservare a -20 °C fino all'uso.
3. Preparazione di aghi per iniezione
   1. Tirare un capillare di vetro utilizzando un estrattore di ago di vetro.
   2. Posizionare la punta del capillare tirato su un nastro adesivo a doppia fronte e rompere la punta del capillare con le forcep.
   3. Impostare il capillare su un iniettore.
      NOTA: È più facile maneggiare il capillare se si indossano guanti in nitrile.
   4. Caricare la soluzione di siRNA/dsRNA sul capillare preparato.
      NOTA: Non utilizzare ripetutamente il capillare poiché la punta del capillare iniettato può intasarsi di sporco perché le larve raccolte nel campo vivevano nel fango.

3. iniezione di siRNA/dsRNA

NOTA: La procedura è leggermente diversa per damselflies (fase 3.1) e libellule (fase 3.2).

1. Iniezione a una larva zygopteran (damigella) (ad esempio, I. senegalensis).
   1. Anestetizzare una larva coperta da una carta bagnata su ghiaccio tritato per 50-70 secondi(Figura 3A-C).
      NOTA: La durata dell'anestesia ghiacciata dipende dalle condizioni della larva; se la larva inizia a muoversi dopo 70 secondi di anestesia ghiacciata, vengono applicati altri 70 secondi di anestesia ghiacciata. Per le larve che raramente si muovono (ad esempio, P. zonata), questa procedura non è essenziale.
   2. Attaccare due perni su entrambi i lati del protorace e fissare la larva a un supporto fisso (ad esempio, un pezzo di polistirolo)(Figura 3D).
      NOTA: Regolare la posizione e il numero di perni, a seconda del luogo di iniezione.
   3. Allungare la membrana interse segmentale tra il 7 ° e l'8 ° segmento addominale per RNAi nell'addome o tra il protorace e il synthorax (mesotorace fuso e metatorace) per RNAi nel torace usando mani e forcep.
   4. Mantenere la membrana interse segmentale tesa a mano.
   5. Inserire la punta del capillare preparato nella membrana interse segmentale allungata (Figura 3D, 3F).
   6. Iniettare 1 μL di soluzione di siRNA/dsRNA.
2. Iniezione a una larva di anisottero (libellula) (ad esempio, P. zonata).
   1. Pulire l'acqua dalla superficie larvale con un tovagliolo di carta.
   2. Se necessario, attaccare due perni su entrambi i lati del protorace e fissare la larva a un supporto fisso (ad esempio, un pezzo di polistirolo)(Figura 3H).
      NOTA: Regolare la posizione e il numero di perni, a seconda del luogo di iniezione. Nel caso di P. zonata, non è essenziale fissare le larve con perni in questo passaggio.
   3. Allungare la membrana interse segmentale tra il 4 ° e il 5 ° segmento addominale a mano.
   4. Fai un piccolo foro con un ago fine nella membrana interse segmentale tra il 4 ° e il 5 ° segmento addominale.
      NOTA: Questa procedura è necessaria per molte specie di anisotteri (libellula) perché la membrana interse segmentale è troppo difficile da inserire direttamente un capillare di vetro.
   5. Inserire la punta del capillare preparato nel foro preparato (Figura 3I).
      NOTA: Come mostrato nella figura 3H, parte del lato dorsale delle larve corrisponde al lato ventrale dell'adulto, quindi il fenotipo appare ventralmente se trattato come mostrato nella figura 3H-J.
   6. Iniettare 1 μL di soluzione di siRNA/dsRNA.

4. elettroporazione in vivo

1. Se necessario, aggiungere altri perni per fissare la larva a un supporto fisso (ad esempio, un pezzo di polistirolo).
2. Dopo l'iniezione della soluzione di siRNA/dsRNA, applicare due goccioline di gel ad ultrasuoni sulla superficie larvale utilizzando le forcep.
3. Posizionare gli elettrodi sul gel ad ultrasuoni, con l'elettrodo positivo sul lato iniettato con la soluzione di siRNA/dsRNA e un elettrodo negativo sul lato opposto(Figura 3E, 3G, 3J).
   NOTA: Non toccare direttamente l'epidermide della larva per evitare l'effetto bruciante dell'elettroporazione.
4. Generare impulsi di elettroporazione 10 volte (280 ms/s ciascuno) utilizzando un elettroporatore.
   NOTA: Regolare la tensione di elettroporazione, a seconda della specie, degli stadi e dei tessuti. In questo studio, 25 V sono stati applicati a I. senegalensis e 45 V a P. zonata.
5. Pulire il gel rimanente sulla superficie con un tovagliolo di carta.
6. Mantenere le larve trattate appoggiate su un tovagliolo di carta bagnato per circa un giorno per il recupero e trasferirle in una custodia di allevamento il giorno successivo.

5. Analisi fenotipico specifica del sito

1. Tenere I. senegalensis singolarmente in una piastra di Petri (5 cm di diametro) contenente circa 10 mL di acqua e un pezzo di carta assorbente, e tenere P. zonata in una gabbia di plastica con una rete non tessuta usa e getta (gabbia di chiusura¹⁴).
2. Per I. senegalensis, dopo che le larve hanno smettereo, spostarle singolarmente in una gabbia di plastica con una rete monouso non tessuta.
   NOTA: Non mettere due o più larve nella stessa gabbia. Altrimenti, si cannibalizzeranno a vicenda immediatamente dopo essere diventati adulti.
3. Dopo l'emergere dell'adulto, osservare e fotografare il fenotipo intorno alla regione in cui è stato posizionato l'elettrodo positivo per l'elettroporazione.
   NOTA: il fenotipo viene visualizzato solo nelle patch. I fenotipi sono spesso difficili da riconoscere immediatamente dopo l'emergenza a causa della pigmentazione incompleta.
4. Al fine di esaminare l'efficienza di RNAi (ad esempio, RT-PCR quantitativa), se il fenotipo è visibile, sezionare la regione e confrontarla con la regione senza il fenotipo.
   NOTA: I livelli di fenotipo RNAi, vale a dire le dimensioni e la posizione della decolorazione della cuticola, presentano spesso notevoli variazioni tra gli individui (cfr. figura 4).
5. Mantieni gli adulti emersi al 100% EtOH per le analisi future.
   NOTA: Il colore del corpo delle specie di Odonata svanisce rapidamente dopo la morte, quindi è importante conservarli in etanolo prima che muoia. L'etanolo a volte scolorise gli insetti, in questi casi gli insetti sono congelati prima di morire.

Risultati

Abbiamo applicato il protocollo di cui sopra alla RNAi mediata dall'elettroporazione che prende di mira i geni gene MCO2 e di controllo negativo (EGFP per siRNA e bla per dsRNA) (i) nell'addome di I. senegalensis (Figura 4), (ii) nel torace di I. senegalensis (Figura 5) e (iii) nell'addome di P. zonata (Figura 6). I risultati degli esperimenti RNAi sono riassunti nella tabella 1. Poiché il siRNA/dsRNA caricato negativamente è incorporato solo in cellule cariche positivamente, i fenotipi RNAi sono stati osservati intorno alla regione in cui l'elettrodo positivo è stato posizionato per l'elettroporazione.

Sia in I. senegalensis che in P. zonata, l'inibizione della pigmentazione della melanina (cioè nero, marrone e marrone rossastro) è apparsa in chiazze intorno alla regione in cui è stato posizionato l'elettrodo positivo (punte di freccia bianche e linee tratteggiate nella figura 4, Figura 5e Figura 6) quando MCO2 RNAi è stato eseguito in combinazione con l'elettroporazione(Tabella 1), come precedentemente riportato nella N. pygmaea⁹. Al contrario, non sono stati osservati effetti fenotipici intorno al sito di elettroporazione quando è stato iniettato il gene dicontrollo (siRNA EGFP o bla dsRNA)(Figura 4, Figura 5e Figura 6, Tabella 1). Inoltre, l'iniezione del gene MCO2 senza elettroporazione non ha avuto alcun effetto sulla pigmentazione adulta (Figura 4, Tabella 1), indicando che l'elettroporazione è essenziale per RNAi in Odonata. Va notato che le colorazioni blu, verde e gialla non sono influenzate dal RNAi del gene MCO2 che è coinvolto nella sintesi della melanina nella cuticola, che riflette plausibilmente il fatto che questi colori del corpo sono attribuiti ai granuli di pigmento presenti nelle cellule epidermiche che sono visibili attraverso la cuticola^{trasparente 26}. Come mostrato nella figura 4, non sono state riconosciute differenze fenotipiche notevoli tra gli individui sottoposti a trattamento con siRNA e trattamento con dsRNA, mentre sono state osservate notevoli variazioni nelle dimensioni e nella posizione del fenotipo RNAi tra diversi individui sottoposti allo stesso trattamento RNAi (ad esempio confrontare due esempi di dsRNA IsMCO2 nella figura 4).

Per determinare lo stadio di sviluppo più adatto al trattamento RNAi, abbiamo confrontato le conseguenze fenotipiche del trattamento RNAi in cinque fasi morfologiche (stadio A-E) nell'instar larvale finale di I. senegalensis (Figura 7A). L'inibizione della pigmentazione della melanina causata da MCO2 RNAi è stata osservata in tutti gli adulti emersi quando è stata iniettata nelle fasi A e B (Figura 7C). Quando è stata iniettata nelle fasi C e D, la soppressione della pigmentazione della melanina è stata certamente osservata in alcuni adulti emersi, ma altri adulti hanno mostrato una colorazione anomala causata da ferite(figura 7B).

Figura 1: Metodi RNAi mediati dall'elettroporazione in Odonata. A. La commissione per l'a Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) come specie damigella rappresentativa. B. La commissione per i trasporti e Pseudothemis zonata (Libellulidae) come specie rappresentativa di libellula. C. La commissione per l' Lo schema generale dei protocolli. Le scatole blu e arancioni indicano i protocolli rispettivamente per I. senegalensis e P. zonata. Le scatole viola indicano i protocolli comuni applicati a entrambe le specie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 2: Risultato rappresentativo dell'identificazione delle specie basate sul polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) per le specie di Ischnura. Arrowhead indica la banda specifica dell'I. senegalensis. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: 100-base coppia scaletta marcatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Metodo RNAi mediato dall'elettroporazione in Odonata. A-C. Anestesia ghiacciata di I. senegalensis. Le punte delle frecce indicano una larva. A. La commissione per l'a Mettere una larva sul ghiaccio schiacciato con una carta bagnata. B. La commissione per i trasporti e Vista ingrandita di una larva sul ghiaccio. C. La commissione per l' Una larva coperta da una carta bagnata sul ghiaccio. D-G. Metodo RNAi per I. senegalensis. D. La commissione per l' Iniezione nel torace. E. La commissione per i Elettroporazione sul torace. F. Iniezione nell'addome. G. La commissione per l' Elettroporazione sull'addome. H-J. Metodo RNAi per P. zonata. H. Altri progetti==== Note Fare un piccolo buco sull'addome. Io. Iniezione nell'addome. J. Altri progetti==== Collegamenti esterni Elettroporazione sull'addome. Le frecce indicano il punto di fare un buco o un'iniezione. +, -: Elettrodi laterali positivi/negativi. I numeri indicano il segmento addominale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Vedute dorsali dei fenotipi RNAi sull'addome di I. senegalensis. Le punte di freccia bianche indicano le regioni di melanizzazione soppressa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Vedute laterale e dorsale dei fenotipi RNAi sul torace di I. senegalensis. Punte di freccia bianche e linee tratteggiate indicano le regioni di pigmentazione soppressa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Vedute ventrali dei fenotipi RNAi nell'addome di P. zonata. Punte di freccia bianche e linee tratteggiate indicano le regioni di melanizzazione soppressa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Effetti IsMCO2 RNAi dipendenti dallo stadio durante l'instar larvale finale di I.senegalensis. A. La commissione per l'a Cambiamenti morfologici negli occhi composti in cinque stadi morfologici (stadio A-E) e il numero di giorni per l'emergere adulto in questo studio. I numeri tra parentesi provengono dal rapporto precedente¹⁴. B. La commissione per i trasporti e Pigmentazione anomala dovuta a ferite. Arrowhead indica il sito di elettroporazione. C. La commissione per l' L'effetto di RNAi in cinque fasi morfologiche sulla pigmentazione adulta in I. senegalensis. Il numero sulla barra indica il numero di individui. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Specie		I.senegalensis							P.zonata
Regione iniettata		Addome					Torace		Addome
siRNA/dsRNA		Sirna		dsRNA			dsRNA		dsRNA
Gene bersaglio		IsMCO2	EGFP	IsMCO2	IsMCO2	bla	IsMCO2	bla	PzMCO2	PzMCO2	bla
Elettroporazione		+	+	+	-	+	+	+	+	-	+
Larve iniettate		22	25	30	6	53	12	20	17	5	9
Adulti emersi		7	6	13	4	40	11	14	11	2	5
Adulti con regioni meno pigmentate (rapporto)		7 (100%)	0 (0%)	13 (100%)	0 (0%)	0 (0%)	10 (91%)	0 (0%)	11 (100%)	0 (0%)	0 (0%)

La tabella 1. L'effetto di RNAi sulla pigmentazione adulta in I. senegalensis e P. zonata. I risultati nella fase A sono riportati in I. senegalensis. IsMCO2: gene multicopper ossidasi 2 di I. senegalensis, EGFP: Gene proteico fluorescente verde avanzato, bla: gene beta lattamasi da pGEM-T Easy Vector, PzMCO2: gene multicopper ossidasi 2 di P. zonata. I risultati per i geni di controllo rappresentano il numero totale di esperimenti che gli autori hanno condotto fino ad oggi.

Discussione

Letalità del trattamento RNAi

Abbiamo scoperto che la letalità del trattamento RNAi dipende fortemente dalla storia e dalle condizioni di allevamento delle larve di Odonata. Le larve subito dopo la raccolta sul campo sono generalmente sane e mostrano bassi tassi di mortalità dopo il trattamento RNAi mediato dall'elettroporazione. Al contrario, le larve allevate in laboratorio per un lungo periodo di tempo (ad esempio, un mese) tendono a soffrire di bassi tassi di successo di emergenza adulta. In I. senegalensis, invece delle larve raccolte sul campo, le larve allevate in laboratorio dalle uova possono essere^{utilizzate 14}, ma i tassi di successo di RNAi utilizzando le larve allevate in laboratorio tendono ad essere notevolmente inferiori (molti individui sono morti durante la metamorfosi) rispetto a quelli che utilizzano le larve raccolte sul campo. Inoltre, l'alimentazione larvale frequente e l'allevamento di acqua pulita sono importanti per aumentare i tassi di successo dell'emergenza adulta e ridurre la letalità del trattamento RNAi.

Efficienza del trattamento RNAi

Come descritto sopra, i livelli di fenotipo RNAi, vale a dire le dimensioni e la posizione della decolorazione della cuticola, spesso presentavano notevoli variazioni tra gli individui sottoposti allo stesso trattamento RNAi (ad esempio, figura 4), ma i livelli della penetranza fenotipico sembrano essere notevolmente diversi tra le specie di Odonata. Le regioni fenotipiche osservate erano più grandi e più importanti in I. senegalensis (figure 4-5) che in P. zonata (Figura 6) e N. pygmaea⁹. Questa differenza può essere dovuta allo spessore della cuticola sulla superficie larvale, considerando che la cuticola di I. senegalensis è più sottile della cuticola di P. zonata e N. pygmaea). Per quanto esaminato, non è stata riconosciuta alcuna chiara differenza tra gli effetti del siRNA e dell'dsRNA(figura 4, tabella 1).

Fase di sviluppo appropriata per RNAi

Va notato che una corretta stadiazione larvale è importante per eseguire RNAi in modo efficiente. L'inibizione della pigmentazione adulta è stata causata da MCO2 RNAi prima dello stadio D (circa 3 giorni prima dell'emergere degli adulti), che è coerente con il precedente rapporto su N. pygmaea⁹. I fenotipi RNAi osservati quando iniettati nelle fasi C e D erano meno evidenti di quelli trattati nelle fasi A e B, il che indica che gli stadi C e D potrebbero essere troppo tardi per sopprimere sufficientemente l'espressione genica. La tempistica appropriata per il trattamento RNAi dipende dalla tempistica dell'espressione genica e il gene MCO2 mostra un'espressione transitoriamente elevata durante l'emergenza^{adulta 9}, come in altri^{insetti 17,18}. Nello stinkbug Plautia stali, il knockdown RNAi del gene MCO2 è stato osservato dal giorno 4 in poi dopo l'iniezione²⁷, che è coerente con i risultati attuali.

Il nostro precedente studio su I. senegalensis ha mostrato che, dopo la fase B, i giorni di emergenza adulta mostrano variazioni relativamente piccole tra la maggior parte delle larve instar finali, suggerendo che lo stadio B può corrispondere all'inizio del processo verso l'emergere adulto, dopo di che i processi di sviluppo per la metamorfosi procedono in modo prefissato e coordinato¹⁴. Anomalie morfologiche causate da ferite sono state spesso osservate quando le larve sono state trattate con RNAi nelle fasi C e D(Figura 7B, 7C). Questo è probabile che sia associato a una progressione drammatica della metamorfosi durante queste fasi, suggerendo che il trattamento RNAi dovrebbe essere evitato dallo stadio C e oltre. In sintesi, si consiglia di utilizzare larve instar finali nella fase A o B (o nella fase prima che le ali larvali si espandano in modo significativo) per esperimenti RNAi.

Utilità e superiorità del metodo RNAi mediato dall'elettroporazione

Il RNAi convenzionale è un metodo sperimentale semplice e potente, ma alcune lignaggi di insetti^{come farfalle 10,}afidi²⁸ e libellule^{9 mostrano} una bassa efficienza RNAi, per la quale la creazione dell'analisi della funzione genica è una sfida importante. In questo studio, la Corte ha riscontrato che la RNAi mediata dall'elettroporazione può indurre la soppressione genica locale nelle libellule con quasi il 100% di efficienza, almeno nell'epidermide, se trattata in fasi di sviluppo appropriate(tabella 1). Recentemente, i knockout genetici basati su CRISPR /Cas9 sono stati applicati con successo a una varietà di insetti, fornendo un potente strumento genetico molecolare per organismi non modello²⁹. Qui, tuttavia, sottoseloiamo che CRISPR / Cas9 è certamente eccezionale, ma il metodo RNAi mediato dall'elettroporazione può essere superiore a CRISPR / Cas9 per alcuni aspetti.

In primo luogo, nel metodo RNAi mediato dall'elettroporazione, la regione corporea in cui compaiono i fenotipi RNAi può essere facilmente controllata sperimentalmente dalla posizione dell'elettrodo positivo all'elettroporazione. Inoltre, poiché la regione in cui l'espressione genica viene soppressa è limitata intorno alla regione in cui è stato posizionato l'elettrodo positivo, i fenotipi RNAi possono essere facilmente confrontati con i fenotipi di controllo fianco a fianco nello stesso individuo. In secondo luogo, rispetto al metodo CRISPR/Cas9 in cui le uova iniettate devono essere allevate fino all'età adulta per osservare i fenotipi knockout, l'RNAi mediato dall'elettroporazione è superiore in quanto i fenotipi gene knockdown possono di solito essere osservati in tempi molto più brevi. Ad esempio, ci vogliono dai tre ai quattro mesi per I. senegalensis e da uno a due anni per P. zonata dalle uova agli^{adulti 14,30}. Tuttavia, per osservare i fenotipi RNAi all'interno dell'epidermide adulta, ci vuole meno di un mese dall'iniezione di dsRNA nelle larve finali instar nella fase B all'emergere adulto sia per I. senegalensis che per P. zonata (Figura 7). In terzo luogo, il metodo RNAi mediato dall'elettroporazione comporta l'iniezione di dsRNA in larve di grandi dimensioni, che è più facile della microiniezione in minuscole uova necessarie per il metodo CRISPR /Cas9. Inoltre, l'RNAi mediato dall'elettroporazione è applicabile alle specie di insetti le cui uova appena deposte sono difficili da raccogliere. Ad esempio, le femmine di P. zonata depongono le uova su piante galleggianti sulla superficie dell'acqua durante il volo, e quindi è difficile raccogliere le loro uova sia in campo che in laboratorio. Pertanto, ci aspettiamo che questo protocollo possa essere generalmente applicabile agli organismi non modello in cui il metodo RNAi convenzionale non funziona in modo efficiente.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plate	Violamo	VTC-P12	For rearing larvae before injection
Brine shrimp eggs	JAPAN PET DESIGN	4975677012396
Calibrated micropipette (1-5 µL)	Drummond	2-000-001-90
Deposit pestle 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	K749520-0090
Digital high defenition microscope camera	Leica Microsystems	MC170HD
Disposable non-woven mesh	HAKUGEN EARTH	DSC-105A
DNA Ligation Kit Ver.2.1	Takara Bio	6022
DraI	Takara Bio	1037A
Electrode (1mmφ)	NEPAGENE	CUY650P1
Electroporator	CellProduce	Cure-gene
Forceps	KOWA Forceps Industry	K-10 No1
Glass needle puller	NARISHIGE	PN-3
Hand mixer	AS ONE	1-229-02
Hand net	HOGA	IS33-3B
HEPES	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	346-01373	For injection buffer
Insect pin capitate No. 3	Shiga Konchu Fukyusha	N230	For fixing larvae
KCl	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-03545	For PBS
KH2PO4	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	169-04245	For PBS
KOAc	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	160-03175	For injection buffer
KOH	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	168-21815	For injection buffer
Laboratory Jack (150x150)	AS ONE	1-4642-11	For adjusting the position of the manipulator
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type	GE Healthcare	2369385
Manipulator	Muromachi Kikai Co., Ltd.	SJ-1	For adjusting the position of the injector and the capillary
MEGAscript RNAi kit	Thermo Fisher Scientific	AM1626
Mg(OAc)2	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	130-00095	For injection buffer
Na2HPO4	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	197-02865	For PBS
NaCl	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	191-01665	For PBS
Petri dish (5 cm diameter)	Iwaki	1010-060	For rearing injected larvae
Pneumatic Injector	NARISHIGE	IM-12
pT7Blue T-Vector	Novagen	69820
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106
RNAiso Plus	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	9109
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74106
Shiga micro insect pin with stainless headless	Shiga Konchu Fukyusha	N251	For making a small hole
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	S8APO
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Thermo Fisher Scientific	18090010
TaKaRa Ex Taq	Takara Bio	RR001B	For PCR-amplification from plasmid
Tks Gflex DNA Polymerase	Takara Bio	R060B	For PCR-amplification from caudal gill