Método de interferência de RNA mediado por eletroporação em Odonata

Resumo

Fornecemos um protocolo detalhado para a interferência mediada por eletroporação no RNA em insetos da ordem Odonata (libélulas e damselflies) usando a damselfly de cauda azul(Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) e a libélula de skimmer pied(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Resumo

Libélulas e damselflies (ordem Odonata) representam um dos insetos mais ancestrais com metamorfose, na qual mudam seu habitat, morfologia e comportamento drasticamente de larvas aquáticas para adultos terrestres/aéreos sem estágio pupal. Os adultos odonata têm uma visão colorida bem desenvolvida e mostram uma diversidade notável nas cores e padrões corporais entre sexos, estágios e espécies. Embora muitos estudos ecológicos e comportamentais sobre Odonata tenham sido realizados, estudos genéticos moleculares têm sido escassos principalmente devido à dificuldade em aplicar análise funcional genética em Odonata. Por exemplo, a interferência de RNA (RNAi) é menos eficaz na Odonata, como relatado na Lepidoptera. Para superar esse problema, estabelecemos com sucesso um método RNAi combinado com eletroporação in vivo. Aqui fornecemos um protocolo detalhado, incluindo um vídeo do método RNAi mediado por eletroporação da seguinte forma: preparação de larvas, identificação de espécies, preparação de solução dsRNA/siRNA e agulhas de injeção, anestesia gelada de larvas, injeção de dsRNA/siRNA, eletroporação in vivo e criação individual até o surgimento de adultos. O método RNAi mediado por eletroporação é aplicável tanto a damselflies (subordenador Zygoptera) quanto a libélulas (subordenação Anisoptera). Neste protocolo, apresentamos os métodos para a damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) como um exemplo de espécies damselfly e a libélula desnatado Pseudothemis zonata (Libellulidae) como outro exemplo de espécies libélulas. Como exemplos representativos, mostramos os resultados do RNAi visando a síntese de melanina multicopper oxidase 2. Este método RNAi facilitará a compreensão de várias funções genéticas envolvidas na metamorfose, morfogênese, formação de padrões de cor e outras características biológicas de Odonata. Além disso, este protocolo pode ser geralmente aplicável a organismos não-modelo em que o RNAi é menos eficaz na supressão genética devido à ineficiência e baixa penetração.

Introdução

Libélulas e damselflies (a ordem Odonata) estão entre os grupos mais ancestrais de insetos que exibem "metamorfose"^1,2. Por metamorfose, eles mudam seu habitat, morfologia e comportamento drasticamente de larvas aquáticas para adultos terrestres/aéreos³. Os adultos odonata têm uma visão colorida bem desenvolvida e representam uma diversidade notável nas cores e padrões corporais entre sexos, estágios e espécies^3,4,5. Embora muitos estudos ecológicos e comportamentais sobre Odonata tenham sido realizados^6,7, estudos genéticos moleculares têm sido dificultados principalmente pela dificuldade em aplicar análise funcional genética a Odonata.

O método convencional de interferência de RNA (RNAi), no qual o RNA de duplaridade (dsRNA) é injetado para suprimir a função do gene de interesse^8,mostrou-se ineficaz nos insetos Odonata^9,como relatado nos insetos lepidopteranos¹⁰. Por outro lado, relatórios anteriores sugerem que a RNAi mediada por eletroporação é eficaz em espécies lepidopteranas, especialmente em tecidos epidérmicos^11,12,13. Descobrimos recentemente que o RNAi mediado pela eletroporação funciona efetivamente na minúscula libélula Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)⁹, mas N. pygmaea é uma espécie relativamente rara e, portanto, não é adequada para estudos genéticos moleculares.

A maioria das espécies de Odonata são classificadas em qualquer uma das duas subordens, Zygoptera (damselflies) ou Anisoptera (verdadeiras libélulas)³. Aqui focamos na damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figura 1A) como uma espécie zygopterana representativa e a libélula desnatado pseudothemis zonata (Libellulidae; Figura 1B) como uma espécie anisopterana representativa. As duas espécies estão entre as espécies odonata mais comuns em lagoas naturais e urbanas no Japão, incluindo as da cidade de Tsukuba, e podemos coletar muitas larvas das duas espécies no campo. Recentemente estabelecemos um sistema de criação laboratorial para larvas individuais de I. senegalensis,que possibilitou o monitoramento contínuo do desenvolvimento e morfogênese das larvas de Odonata no detalhe¹⁴.

Neste relatório, fornecemos um método refinado e um protocolo de vídeo para o RNAi mediado por eletroporação em I. senegalensis e P. zonata. No Japão, eu. senegalensis e Ischnura asiatica, que são geneticamente próximos, são frequentemente encontrados sympatricamente¹⁵, e são difíceis de distinguir em larvas¹⁶. Também descrevemos como duas espécies de Ischnura podem ser distinguidas pelo polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição (RFLP).

Para avaliar a eficácia do RNAi mediado pela eletroporação, selecionamos o gene multicopper oxidase 2 (MCO2; também conhecido como laccase2) como um gene-alvo representativo, por conta do fenótipo visível da cor da cutícula mais pálida após o knockdown da expressão genética⁹. O MCO2 é conhecido por ser essencial para o escurecimento da epiderme em uma variedade de espécies de insetos^17,18.

Protocolo

NOTA: O esquema geral dos protocolos é mostrado na Figura 1.

1. Preparação de larvas de libélulas ou damselflies.

1. Coletar larvas no campo usando uma rede de mão.
   NOTA: I. larvas senegalensis muitas vezes se agarram a plantas de água flutuando na superfície da água, enquanto as larvas P. zonata muitas vezes ficam entre o lixo de folhas no fundo. Na cidade de Tsukuba, as larvas instar finais de I. senegalensis são encontradas principalmente de março a junho, e as de P. zonata de maio a junho. I. larvas senegalensis podem ser criadas a partir de ovos no laboratório¹⁴, mas as larvas coletadas no campo têm a taxa de sucesso claramente maior de emergência adulta.
2. Identificação de espécies por polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) de produtos amplificados por PCR.
   NOTA: Este passo só é necessário se a espécie for difícil de identificar a partir do aparecimento das larvas, como em I. senegalensis.
   1. Segure uma das brânquias caudais de uma larva usando fórceps. Em seguida, a larva cai de sua própria brânquia caudal (causando autotomia).
      NOTA: Larvas de damselflies zigopteranas geralmente têm três brânquias caudais(Figura 1A). Quando são atacados por um predador, podem tirar suas próprias brânquias caudais para escapar. Se a brânquia caudal não estiver disponível, uma parte da perna é dissecada.
   2. Coloque uma brânquia caudal em 100 μL de solução PBS [0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na₂HPO₄, e 0,02% KH₂PO₄ (w/v)] e homogeneize com um misturador de mão usando um pilão de depósito.
   3. Gire a mistura a 5.000 x g por 10 segundos, e submá-lo 0,5 μL do supernasal à amplificação pcr usando polimerase de DNA e primers para amplificar a região do espaçador transcrito interno 1 (ITS1) do DNA nuclear.
      NOTA: Realize o PCR de acordo com o protocolo do fabricante. A combinação de primers ITS-F0 (5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3') e 5.8S-AS1 (5'- GCC GGC CCT CAG CCA G -3') pode amplificar a região ITS1 em quase todas as espécies Odonata¹⁹.
   4. Incubar a mistura de 1 μL de produto amplificado por PCR, 0,3 μL de tampão de 10x M, 0,1 μL de enzima de restrição DraI e 1,6 μL de água a 37 °C por 1 h.
      NOTA: Selecione as melhores enzimas de restrição, dependendo da combinação de espécies. Se não houver enzimas de restrição adequadas para identificação de espécies, confirme por sequenciamento de DNA.
   5. Carregue 2 μL dos produtos com corante de carga em gel de 2% de agarose e execute a eletroforese.
      NOTA: É difícil identificar espécies ao usar gel de 1% ou 1,5% de agarose.
   6. Verifique o padrão de eletroforese para identificar a espécie (Figura 2).
      NOTA: Os padrões RFLP são dependentes de espécies e população. Na população de Tsukuba, i. asiatica tem uma grande faixa de 400-500 bp, enquanto I. senegalensis tem uma banda principal de aproximadamente 200 bp e uma banda adicional de menos de 100 bp (uma ponta de flecha na Figura 2). A região ITS1 existe em múltiplas cópias no genoma, e na espécie Ischnura, o polimorfismo microsatélite dentro da região ITS1 está frequentemente presente no mesmo indivíduo, afetando o padrão de RFLPs.
3. Guarde as larvas coletadas em laboratório até o uso do RNAi.
   1. Coloque cada larva separadamente em cada poço de uma placa de 12 poços com aproximadamente 3 mL de água.
      NOTA: I. as larvas senegalensis devem ser mantidas individualmente porque elas frequentemente canibalizam umas às outras, enquanto as larvas de P. zonata podem ser mantidas em grupo porque raramente canibalizam.
   2. Alimentar I. senegalensis larvas com camarão de salmoura Artemia todos os dias e larvas P. zonata com vermes de sangue e/ou vermes Tubifex pelo menos duas vezes por semana até que eles cresçam para o estágio de desenvolvimento adequado para RNAi.
      NOTA: A alimentação frequente é fundamental para aumentar a taxa de sucesso do surgimento de adultos.
   3. Troque a água assim que ficar suja com fezes ou sobras.
      NOTA: A mudança frequente de água também é importante para aumentar a taxa de sucesso do surgimento de adultos.
   4. Julgue a etapa de desenvolvimento apropriada para a RNAi.
      NOTA: As larvas instar finais de I. senegalensis podem ser classificadas em cinco estágios de desenvolvimento^14,20. A primeira etapa (estágio A, antes das asas começarem a se expandir) ou a segunda etapa (estágio B) das larvas instar finais é adequada para experimentos RNAi, quando se considera o fenótipo claro de RNAi após o surgimento de adultos (ver Discussão). Em P. zonata, as larvas instar finais antes da expansão da asa (correspondente à fase A de I. senegalensis) foram utilizadas neste estudo.

2. Preparação da solução dsRNA/siRNA e agulhas de injeção para RNAi.

NOTA: Selecione o RNA de interferência pequena (siRNA) (etapa 2.1) ou o RNA de dupla cadeia (dsRNA) (etapa 2.2) como a solução para RNAi.

1. Preparação da solução siRNA
   1. Design siRNA usando siDirect programa versão 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)²¹, seguindo as diretrizes relatadas anteriormente em insetos lepidopteranos²².
   2. Obter siRNA sintetizado comercialmente.
      NOTA: As sequências de siRNA direcionadas ao gene MCO2 de I. senegalensis utilizados neste estudo foram as seguintes: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3' para fios de sentido e 5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3' para fios antissense. Como controle negativo, as sequências de siRNA visando o gene de proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP)foram as seguintes: 5'- GCA UCA AGG AGG ACU UCA AGA -3' para fios de sentido e 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3' para fio antissense¹¹.
   3. Diluir o siRNA para 100 μM com tampão de injeção [100 mM CH₃COOK, 2 mM Mg(CH₃COO)₂, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]²².
   4. Armazenar a -80 °C até usar.
2. Preparação da solução dsRNA.
   1. Selecione uma região de 300-400 bp para dsRNA usando o programa primer3 versão 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)²³ e projete os conjuntos de primer.
   2. Obtenha conjuntos de primer sintetizados comercialmente.
      NOTA: Para produzir modelos para síntese de dsRNA, os conjuntos de primer utilizados neste estudo foram os seguintes: (5'- GCC TGT CAG CTT TGT CTT CC -3' para primer avançado e 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3' para primer reverso) para mco2 genes de I. senegalensis (IsMCO2, adesão no. LC589180) e (5'- CCG CAC AGC TCA TTC TTC AA -3' para primer avançado e 5'- GGA GGA TTC CTT CGA CGA CA -3' para primer reverso) para genes MCO2 de P. zonata (PzMCO2, adesão nº. LC589179). Como um controle negativo, o primer definido para o gene dsRNA targeting β-lactamase (bla) no vetor de clonagem foram (5'- CTA TGT GGC GCG GTA TTA T -3' para primer dianteiro e 5'- CAG AAG TGG TCC TGC AAC T -3' para primer reverso).
   3. Extrair RNA de larvas de Odonata usando um kit de extração de RNA comercialmente disponível e realizar a síntese de CDNA usando transcriptase reversa de acordo com o protocolo do fabricante.
      NOTA: a biblioteca cDNA preparada para análise de sequenciamento de RNA também pode ser usada.
   4. Amplie as sequências de destino usando o cDNA sintetizado e o conjunto de primer projetado e clone-as no vetor de clonagem usando uma ligase comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
   5. Transforme o plasmídeo em células competentes de E. coli e pegue uma única colônia após a incubação durante a noite.
   6. PcR-amplifica a região de inserção usando primers no vetor.
   7. Confirme a sequência clonada por sequenciamento Sanger.
   8. PCR-amplifica a inserção usando primers vetoriais contendo a sequência de promotor de polimerase T7^{24, 25}.
      NOTA: Neste estudo, foram utilizados os seguintes primers: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') e T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3') ²⁵.
   9. Purifique o produto PCR usando o kit de purificação pcr de acordo com o protocolo do fabricante, elute o DNA com 50 μL de água destilada, e concentre a solução de DNA elucido para aproximadamente 10 μL usando um evaporador centrífuga.
   10. Sintetizar dsRNA por transcrição in vitro de acordo com o protocolo do fabricante. Use um total de 1000 ng modelo DNA e elute sintetizado dsRNA com 100 μL de tampão de eluição.
   11. Meça a concentração de dsRNA usando um espectrofotômetro e confirme a qualidade do dsRNA por eletroforese em um gel de 1,5% de agarose.
       NOTA: Uma única banda pode ser vista quando a síntese de dsRNA é bem sucedida.
   12. Diluir dsRNA para 1000 ng/μL com tampão de elução e armazenar a -20 °C até usar.
3. Preparação de agulhas de injeção
   1. Puxe um capilar de vidro usando um puxador de agulha de vidro.
   2. Coloque a ponta do capilar puxado em uma fita adesiva de dois lados e quebre a ponta do capilar com fórceps.
   3. Coloque o capilar em um injetor.
      NOTA: É mais fácil manusear o capilar se você usar luvas de nitrito.
   4. Carregar solução siRNA/dsRNA para o capilar preparado.
      NOTA: Não utilize o capilar repetidamente, pois a ponta do capilar injetado pode ficar entupida de sujeira porque as larvas coletadas no campo viviam na lama.

3. injeção de siRNA/dsRNA

NOTA: O procedimento é ligeiramente diferente para damselflies (passo 3.1) e libélulas (passo 3.2).

1. Injeção em uma larva zygopteran (damselfly) (por exemplo, I. senegalensis).
   1. Anestesiar uma larva coberta com um papel molhado no gelo esmagado por 50-70 segundos(Figura 3A-C).
      NOTA: A duração da anestesia gelada depende da condição da larva; se a larva começar a se mover após 70 segundos de anestesia gelada, é aplicada uma anestesia adicional de 70 segundos de frio gelado. Para larvas que raramente se movem (por exemplo, P. zonata), este procedimento não é essencial.
   2. Conecte dois pinos em ambos os lados do protórax e fixe a larva em um suporte fixo (por exemplo, um pedaço de isopor)(Figura 3D).
      NOTA: Ajuste a posição e o número de pinos, dependendo do local da injeção.
   3. Estique a membrana intersu segmentar entre o 7º e o 8º segmento abdominal para RNAi no abdômen ou entre o protórax e o synthorax (mesotórx fundido e metatórax) para RNAi no tórax usando mãos e fórceps.
   4. Mantenha a membrana inter-segmental esticada à mão.
   5. Insira a ponta do capilar preparado na membrana intersu segmentar esticada(Figura 3D, 3F).
   6. Injete 1 μL de solução siRNA/dsRNA.
2. Injeção em uma larva anisopterana (libélula) (por exemplo, P. zonata).
   1. Limpe a água da superfície larval com uma toalha de papel.
   2. Se necessário, conecte dois pinos em ambos os lados do protórax e fixe a larva em um suporte fixo (por exemplo, um pedaço de isopor)(Figura 3H).
      NOTA: Ajuste a posição e o número de pinos, dependendo do local da injeção. No caso de P. zonata,não é essencial fixar as larvas com pinos nesta etapa.
   3. Estique a membrana intersu segmentar entre o 4º e o 5º segmento abdominal manualmente.
   4. Faça um pequeno orifício com uma agulha fina na membrana intersu segmentar entre o 4º e o 5º segmento abdominal.
      NOTA: Este procedimento é necessário para muitas espécies de anisopteran (libélula) porque a membrana inter-segmental é muito difícil de inserir um capilar de vidro diretamente.
   5. Insira a ponta do capilar preparado no orifício preparado(Figura 3I).
      NOTA: Como mostrado na Figura 3H, parte do lado dorsal das larvas corresponde ao lado ventral do adulto, de modo que o fenótipo aparece ventricamente quando tratado como mostrado na Figura 3H-J.
   6. Injete 1 μL de solução siRNA/dsRNA.

4. eletroporação in vivo

1. Se necessário, adicione mais pinos para fixar a larva em um suporte fixo (por exemplo, um pedaço de isopor).
2. Após a injeção da solução de siRNA/dsRNA, aplique duas gotículas de gel de ultrassom na superfície larval usando fórceps.
3. Coloque eletrodos no gel de ultrassom, com o eletrodo positivo na lateral injetado com a solução siRNA/dsRNA e um eletrodo negativo no lado oposto(Figura 3E, 3G, 3J).
   NOTA: Não toque diretamente na epiderme da larva para evitar o efeito de queima da eletroporação.
4. Gerar pulsos de eletroporação 10 vezes (280 ms/s cada) usando um eletroporador.
   NOTA: Ajuste a tensão da eletroporação, dependendo da espécie, estágios e tecidos. Neste estudo, foram aplicados 25 V a I. senegalensis e 45 V a P. zonata.
5. Limpe o gel restante na superfície com uma toalha de papel.
6. Mantenha as larvas tratadas descansando sobre uma toalha de papel molhada por aproximadamente um dia para recuperação e transfira-as para uma caixa de criação no dia seguinte.

5. Análise fenotípica específica do site

1. Mantenha I. senegalensis individualmente em uma placa de Petri (5 cm de diâmetro) contendo aproximadamente 10 mL de água e um pedaço de papel toalha, e mantenha P. zonata em uma gaiola de plástico com uma malha não tecida descartável (gaiola de eclosão¹⁴).
2. Para i. senegalensis, depois que as larvas pararem de comer, mova-as individualmente para uma gaiola de plástico com uma malha não tecida descartável.
   NOTA: Não coloque duas ou mais larvas na mesma gaiola. Caso contrário, eles vão canibalizar uns aos outros imediatamente depois de se tornarem adultos.
3. Após o surgimento do adulto, observe e fotografe o fenótipo ao redor da região onde o eletrodo positivo foi colocado para eletroporação.
   NOTA: O fenótipo aparece apenas em patches. Fenótipos são muitas vezes difíceis de reconhecer imediatamente após o surgimento devido à pigmentação incompleta.
4. A fim de examinar a eficiência da RNAi (por exemplo, RT-PCR quantitativo), se o fenótipo é visível, dissecar a região e compará-la com a região sem o fenótipo.
   NOTA: Os níveis de fenótipo RNAi, ou seja, tamanho e localização da descolorização da cutícula, muitas vezes apresentam variação considerável entre os indivíduos (ver Figura 4).
5. Mantenha os adultos emergidos em 100% EtOH para análises futuras.
   NOTA: A cor corporal da espécie Odonata desaparece rapidamente após a morte, por isso é importante armazená-las em etanol antes de morrer. O etanol às vezes descolore os insetos, nesses casos que os insetos são congelados antes de morrerem.

Resultados

Aplicamos o protocolo acima à RNAi mediada pela eletroporação visando genes de genes de controle MCO2 e negativos(EGFP para siRNA e bla para dsRNA) (i) no abdômen de I. senegalensis (Figura 4),(ii) no tórax de I. senegalensis (Figura 5),e (iii) no abdômen de P. zonata (Figura 6). Os resultados dos experimentos RNAi estão resumidos na Tabela 1. Como o siRNA/dsRNA carregado negativamente é incorporado apenas em células positivamente carregadas, fenótipos RNAi foram observados ao redor da região onde o eletrodo positivo foi colocado para eletroporação.

Em ambos eu. senegaleses e P. zonata, inibição da pigmentação de melanina (ou seja, preto, marrom e marrom avermelhado) apareceu em manchas ao redor da região onde o eletrodo positivo foi colocado (pontas de flechabrabra branca e linhas pontilhadas na Figura 4, Figura 5e Figura 6) quando o MCO2 RNAi foi realizado em combinação com eletroporação(Tabela 1),como relatado anteriormente em N pygeama⁹. Em contrapartida, não foram observados efeitos fenotípicos ao redor do local da eletroporação quando o gene de controle foi injetado(EGFP siRNA ou bla dsRNA)(Figura 4,Figura 5 e Figura 6, Tabela 1). Além disso, a injeção do gene MCO2 sem eletroporação não teve efeito na pigmentação adulta (Figura 4, Tabela 1), indicando que a eletroporação é essencial para rnai em Odonata. Deve-se notar que as colorações azul, verde e amarela não são afetadas pelo gene RNAi do gene MCO2 que está envolvido na síntese de melanina na cutícula, que refletem plausivelmente o fato de que essas cores corporais são atribuídas aos grânulos de pigmento presentes nas células epidérmicas que são visíveis através do cutícula transparente²⁶. Como mostrado na Figura 4,não foram observadas diferenças fenotípicas notáveis entre os indivíduos submetidos ao tratamento de siRNA e ao tratamento de dsRNA, enquanto a variação considerável de tamanho e localização do fenótipo RNAi foi observada entre diferentes indivíduos submetidos ao mesmo tratamento RNAi (ex. compare dois exemplos de IsMCO2 dsRNA na Figura 4).

Para determinar o estágio de desenvolvimento mais adequado para o tratamento RNAi, comparamos as consequências fenotípicas do tratamento RNAi em cinco estágios morfológicos (estágio A-E) na última instar larval da I. senegalensis (Figura 7A). A inibição da pigmentação de melanina causada pelo MCO2 RNAi foi observada em todos os adultos emergidos quando injetados nos estágios A e B(Figura 7C). Quando injetada nos estágios C e D, a supressão da pigmentação de melanina foi certamente observada em alguns adultos emergidos, mas outros adultos apresentaram coloração anormal causada por feridas(Figura 7B).

Figura 1: Métodos RNAi mediados por eletroporação em Odonata. A. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) como uma espécie representativa damselfly. B. Pseudothemis zonata (Libellulidae) como uma espécie representativa da libélula. C. O esquema geral dos protocolos. Caixas azuis e laranjas indicam os protocolos para I. senegalensis e P. zonata,respectivamente. As caixas roxas indicam os protocolos comuns aplicados a ambas as espécies. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 2: Um resultado representativo da identificação de espécies baseadas em fragmentos de restrição (RFLP) para espécies de Ischnura. Arrowhead indica a banda específica de I. Senegalensis. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: 100 base par marcação escada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Método RNAi mediado por eletroporação em Odonata. A-C. Anestesia gelada de I. senegalensis. Pontas de flecha indicam uma larva. A. Colocando uma larva no gelo esmagado com um papel molhado. B. Visão ampliada de uma larva no gelo. C. Uma larva coberta com um papel molhado no gelo. D-G. Método RNAi para I. senegalensis. D. Injeção no tórax. E. Eletroporação no tórax. F. Injeção no abdômen. G. Eletroporação no abdômen. H-J. Método RNAi para P. zonata. H. Fazendo um pequeno buraco no abdômen. Eu. Injeção no abdômen. J. Eletroporação no abdômen. As setas indicam o ponto de fazer um buraco ou injeção. +, -: Eletrodos laterais positivos/negativos. Os números indicam o segmento abdominal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Visões dorsais dos fenótipos RNAi no abdômen de I. senegalensis. Pontas de flechas brancas indicam as regiões da melanização suprimida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Visões laterais e dorsais dos fenótipos RNAi no tórax de I. senegalensis. Pontas de flechabranco e linhas pontilhadas indicam as regiões de pigmentação suprimida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Visões ventral de fenótipos RNAi no abdômen de P. zonata. Pontas de flechabranco e linhas pontilhadas indicam as regiões da melanização suprimida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Efeitos ismco2 RNAi dependentes de estágio durante a última instar larval de I.senegalensis. A. Alterações morfológicas nos olhos compostos em cinco estágios morfológicos (estágio A-E) e o número de dias para o surgimento de adultos neste estudo. Os números entre parênteses são do relatório anterior¹⁴. B. Pigmentação anormal devido a feridas. A ponta da seta indica o local de eletroporação. C. O efeito do RNAi em cinco estágios morfológicos na pigmentação adulta em I. senegalensis. O número na barra indica o número de indivíduos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Espécie		I.senegalensis							P.zonata
Região injetada		Abdômen					Tórax		Abdômen
siRNA/dsRNA		Sirna		Dsrna			Dsrna		Dsrna
Gene-alvo		IsMCO2	EGFP	IsMCO2	IsMCO2	Bla	IsMCO2	Bla	PzMCO2	PzMCO2	Bla
Electroporation		+	+	+	-	+	+	+	+	-	+
Larvas injetadas		22	25	30	6	53	12	20	17	5	9
Emergiu adultos		7	6	13	4	40	11	14	11	2	5
Adultos com regiões menos pigmentadas (razão)		7 (100%)	0 (0%)	13 (100%)	0 (0%)	0 (0%)	10 (91%)	0 (0%)	11 (100%)	0 (0%)	0 (0%)

Mesa 1. O efeito da RNAi na pigmentação adulta em I. senegalensis e P. zonata. Os resultados na fase A são mostrados em I. senegalensis. IsMCO2: multicopper oxidase 2 gene de I. senegalensis, EGFP: Gene de proteína fluorescente verde aprimorada, bla: gene beta lactamase de pGEM-T Easy Vector, PzMCO2: multicopper oxidase 2 gene de P. zonata. Os resultados dos genes de controle representam o número total de experimentos que os autores realizaram até o momento.

Discussão

Letalidade do tratamento RNAi

Descobrimos que a letalidade do tratamento RNAi depende fortemente da história de criação e condição das larvas de Odonata. As larvas logo após a coleta no campo são geralmente saudáveis e apresentam baixas taxas de mortalidade após o tratamento RNAi mediado pela eletroporação. Em contrapartida, as larvas criadas em laboratório por um longo período de tempo (por exemplo, um mês) tendem a sofrer baixas taxas de sucesso de emergência adulta. Em I. senegalensis, em vez das larvas coletadas no campo, as larvas criadas em laboratório a partir de ovos podem ser usadas¹⁴, mas as taxas de sucesso do RNAi usando as larvas criadas em laboratório tendem a ser consideravelmente menores (muitos indivíduos morreram durante a metamorfose) do que aquelas que usam as larvas coletadas em campo. Além disso, a alimentação frequente de larvas e a criação de água limpa são importantes para aumentar as taxas de sucesso do surgimento de adultos e reduzir a letalidade do tratamento RNAi.

Eficiência do tratamento RNAi

Como descrito acima, os níveis de fenótipo RNAi, ou seja, tamanho e localização da descoloração da cutícula, muitas vezes apresentaram variação considerável entre indivíduos submetidos ao mesmo tratamento RNAi (por exemplo, Figura 4), mas os níveis de penetração fenotípica parecem ser notavelmente diferentes entre as espécies de Odonata. As regiões fenotípicas observadas foram maiores e mais proeminentes em I. senegalensis (Figuras 4-5) do que em P. zonata (Figura 6) e N. pigmeu⁹. Essa diferença pode ser devido à espessura da cutícula na superfície larval, considerando que a cutícula de I. senegalensis é mais fina que a cutícula de P. zonata e N. pygmaea). Na medida em que examinamos, não foi reconhecida diferença clara entre os efeitos do siRNA e do dsRNA (Figura 4, Tabela 1).

Etapa de desenvolvimento adequada para RNAi

Deve-se notar que o estadiamento larval adequado é importante para a realização eficiente da RNAi. A inibição da pigmentação adulta foi causada por MCO2 RNAi antes do estágio D (aproximadamente 3 dias antes do surgimento de adultos), o que é consistente com o relatório anterior sobre N. pygmaea⁹. Os fenótipos RNAi observados quando injetados nos estágios C e D foram menos conspícuos do que os tratados nos estágios A e B, o que indica que os estágios C e D podem ser tarde demais para suprimir suficientemente a expressão genética. O tempo adequado para o tratamento RNAi depende do tempo de expressão genética, e o gene MCO2 exibe expressão transitoriamente alta durante o surgimento adulto⁹, como em outros insetos^17,18. No fedorg Plautia stali, RNAi knockdown do gene MCO2 foi observado a partir do dia 4 após a injeção²⁷, o que é consistente com os resultados atuais.

Nosso estudo anterior sobre I. senegalensis mostrou que, após a fase B, dias para o surgimento de adultos apresentam variação relativamente pequena entre a maioria das larvas instar finais, sugerindo que o estágio B pode corresponder ao início do processo para o surgimento de adultos, após o qual os processos de desenvolvimento para metamorfose prosseguem de forma prefixada e coordenada¹⁴. Anormalidades morfológicas causadas por feridas foram frequentemente observadas quando as larvas foram tratadas pela RNAi nos estágios C e D (Figura 7B, 7C). Isso provavelmente estará associado a uma progressão dramática da metamorfose durante esses estágios, sugerindo que o tratamento RNAi deve ser evitado do estágio C e sobre. Em resumo, recomendamos que as larvas instar finais no estágio A ou B (ou no estágio antes que as asas larvas se expandam significativamente) devem ser usadas para experimentos RNAi.

Utilidade e superioridade do método RNAi mediado por eletroporação

O RNAi convencional é um método experimental simples e poderoso, mas algumas linhagens de insetos como borboletas¹⁰, pulgões²⁸ e libélulas⁹ exibem baixa eficiência RNAi, para a qual o estabelecimento da análise da função genética é um grande desafio. Neste estudo, descobrimos que a RNAi mediada pela eletroporação pode induzir a supressão genética local em libélulas com quase 100% de eficiência, pelo menos em epiderme, se tratada em estágios de desenvolvimento adequados(Tabela 1). Recentemente, os nocautes genéticos baseados em CRISPR/Cas9 foram aplicados com sucesso a uma variedade de insetos, fornecendo uma poderosa ferramenta genética molecular para organismos não-modelo²⁹. Aqui, no entanto, ressaltamos que o CRISPR/Cas9 é certamente ótimo, mas o método RNAi mediado por eletroporação pode ser superior ao CRISPR/Cas9 em alguns aspectos.

Em primeiro lugar, no método RNAi mediado pela eletroporação, a região corporal onde os fenótipos RNAi aparecem pode ser facilmente controlada experimentalmente pela posição do eletrodo positivo após a eletroporação. Além disso, uma vez que a região onde a expressão genética é suprimida é limitada ao redor da região onde o eletrodo positivo foi colocado, os fenótipos RNAi podem ser facilmente comparados com os fenótipos de controle lado a lado no mesmo indivíduo. Em segundo lugar, em comparação com o método CRISPR/Cas9 no qual os ovos injetados devem ser criados até a idade adulta para observar os fenótipos eliminatórios, o RNAi mediado por eletroporação é superior na forma de que os fenótipos de knockdown genéticos geralmente podem ser observados em muito menos tempo. Por exemplo, leva de três a quatro meses para i. senegalês e de um a dois anos para P. zonata de ovos para adultos^14,30. No entanto, para observar os fenótipos RNAi dentro da epiderme adulta, leva menos de um mês desde a injeção de dsRNA até as larvas instar finais no estágio B até o surgimento adulto tanto para I. senegalensis quanto P. zonata (Figura 7). Em terceiro lugar, o método RNAi mediado pela eletroporação implica a injeção de dsRNA em larvas grandes, o que é mais fácil do que a microinjeção em pequenos ovos necessários para o método CRISPR/Cas9. Além disso, o RNAi mediado por eletroporação é aplicável a espécies de insetos cujos ovos recém-colocados são difíceis de coletar. Por exemplo, fêmeas de P. zonata colocam ovos em plantas flutuantes na superfície da água durante o voo, e assim é difícil coletar seus ovos tanto no campo quanto no laboratório. Portanto, esperamos que este protocolo possa ser geralmente aplicável a organismos não-modelo em que o método RNAi convencional não funciona de forma eficiente.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plate	Violamo	VTC-P12	For rearing larvae before injection
Brine shrimp eggs	JAPAN PET DESIGN	4975677012396
Calibrated micropipette (1-5 µL)	Drummond	2-000-001-90
Deposit pestle 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	K749520-0090
Digital high defenition microscope camera	Leica Microsystems	MC170HD
Disposable non-woven mesh	HAKUGEN EARTH	DSC-105A
DNA Ligation Kit Ver.2.1	Takara Bio	6022
DraI	Takara Bio	1037A
Electrode (1mmφ)	NEPAGENE	CUY650P1
Electroporator	CellProduce	Cure-gene
Forceps	KOWA Forceps Industry	K-10 No1
Glass needle puller	NARISHIGE	PN-3
Hand mixer	AS ONE	1-229-02
Hand net	HOGA	IS33-3B
HEPES	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	346-01373	For injection buffer
Insect pin capitate No. 3	Shiga Konchu Fukyusha	N230	For fixing larvae
KCl	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-03545	For PBS
KH2PO4	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	169-04245	For PBS
KOAc	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	160-03175	For injection buffer
KOH	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	168-21815	For injection buffer
Laboratory Jack (150x150)	AS ONE	1-4642-11	For adjusting the position of the manipulator
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type	GE Healthcare	2369385
Manipulator	Muromachi Kikai Co., Ltd.	SJ-1	For adjusting the position of the injector and the capillary
MEGAscript RNAi kit	Thermo Fisher Scientific	AM1626
Mg(OAc)2	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	130-00095	For injection buffer
Na2HPO4	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	197-02865	For PBS
NaCl	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	191-01665	For PBS
Petri dish (5 cm diameter)	Iwaki	1010-060	For rearing injected larvae
Pneumatic Injector	NARISHIGE	IM-12
pT7Blue T-Vector	Novagen	69820
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106
RNAiso Plus	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	9109
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74106
Shiga micro insect pin with stainless headless	Shiga Konchu Fukyusha	N251	For making a small hole
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	S8APO
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Thermo Fisher Scientific	18090010
TaKaRa Ex Taq	Takara Bio	RR001B	For PCR-amplification from plasmid
Tks Gflex DNA Polymerase	Takara Bio	R060B	For PCR-amplification from caudal gill