Imaging a cellule vive dell'attività trascrizionale a rotture a doppio filamento di DNA

Riepilogo

Questo protocollo presenta un nuovo sistema genico reporter e la configurazione sperimentale per rilevare la trascrizione a rotture a doppio filamento di DNA con sensibilità a singola molecola.

Abstract

Le rotture a doppio filamento del DNA (DSB) sono il tipo più grave di danno al DNA. Nonostante le conseguenze catastrofiche sull'integrità del genoma, rimane finora elusivo il modo in cui i DSB influenzano la trascrizione. Una ragione di ciò era la mancanza di strumenti adeguati per monitorare contemporaneamente la trascrizione e l'induzione di un DSB genico con sufficiente risoluzione temporale e spaziale. Questo lavoro descrive una serie di nuovi reporter che visualizzano direttamente la trascrizione in cellule vive immediatamente dopo l'induzione di un DSB nel modello di DNA. Gli stem-loop dell'RNA batteriofago sono impiegati per monitorare la trascrizione con sensibilità a singola molecola. Per indirizzare il DSB a una specifica regione genica, i geni reporter sono progettati per contenere una singola sequenza di riconoscimento dell'endonucleasi di homing I-SceI, altrimenti assente dal genoma umano. Una singola copia di ogni gene reporter è stata integrata nel genoma delle linee cellulari umane. Questo sistema sperimentale permette la rilevazione di singole molecole di RNA generate dalla trascrizione genica canonica o dall'inizio della trascrizione indotta da rottura del DNA. Questi reporter offrono un'opportunità senza precedenti per interpretare le interazioni reciproche tra trascrizione e danno al DNA e per rivelare aspetti finora non apprezzati della trascrizione indotta dalla rottura del DNA.

Introduzione

Le rotture a doppio filamento del DNA (DSB) sono lesioni tossiche del DNA che interrompono la funzione cellulare e contribuiscono all'insorgenza di diverse malattie e all'invecchiamento1. Le mutazioni derivanti dalla riparazione imprecisa dei DSB influenzano l'espressione genica e pongono le basi per il declino funzionale della cellula. L'opinione emergente che i DSB guidino la trascrizione indotta da rotture de novo nel sito della lesione2,3,4,5,6,7 suggerisce che i DSB possono anche influenzare la funzione cellulare attraverso RNA indotti da rottura. Diversi studi recenti indicano che i DSB sono sufficienti per avviare la trascrizione programmata (ad esempio, a geni inducibili dallo stimolo) e non programmata (ad esempio, a promotori non canonici)^4,5,7. Tuttavia, nonostante diversi studi che esplorano i legami tra danno al DNA e trascrizione, il campo è ancora in ritardo nella sua capacità di fornire una caratterizzazione precisa (cioè a singola molecola) degli eventi trascrizionali nei siti di rottura del DNA. Una ragione importante per questo era la mancanza di strumenti sperimentali appropriati. L'irradiazione cellulare (raggi γ, raggi X, ioni pesanti) e i trattamenti farmacologici (ad esempio, inibitori della topoisomerasi o agenti intercalanti) mancano di precisione spaziale e inducono lesioni del DNA diverse dai DSB, comprese le rotture a singolo filamento e gli addotti del ^DNA8. Le endonucleasi, come I-PpoI e AsiSI, generano DSB locus-specific ma non sono state combinate con un sistema che consenta la visualizzazione simultanea della trascrizione in un singolo locus con elevata precisione ^temporale8. Per aggirare questa limitazione, il nostro laboratorio ha guidato lo sviluppo di una serie di reporter all'avanguardia che visualizzano direttamente la trascrizione con risoluzione a singola molecola sull'induzione controllata di un ^DSB4 unico. Qui, descriviamo questi reporter, forniamo un protocollo dettagliato per l'imaging di cellule vive della trascrizione a DSB e mostriamo i dati che rivelano l'inizio della trascrizione in un singolo DSB.

I sistemi genici reporter utilizzati in questo protocollo si basano sul gene reporter IgM di topo ben caratterizzato e contengono gli esoni M1 e M2 della forma legata alla membrana (μm) della catena pesante IgM μ ^9,10,11. Un introne ibrido separa i due esoni con il tratto PY adenovirus major late transcript (AdML) ^forte12. L'espressione dei geni reporter è controllata dal promotore del citomegalovirus umano (CMV), in cui sono state inserite due copie tandem della sequenza dell'operatore Tet (TetO). I geni reporter sono inseriti ciascuno in un vettore plasmidico contenente un sito Flp Recombination Target (FRT) e inseriti in uno specifico sito target FRT nel genoma di una linea cellulare ospite HEK293. Questa linea cellulare esprime anche costitutivamente la proteina repressore Tet per regolare l'espressione del gene reporter attraverso la presenza o l'assenza di tetraciclina/doxiciclina. Per consentire la visualizzazione della trascrizione del gene reporter, sono state inserite 24 ripetizioni tandem della sequenza del loop stem MS2 e 24 ripetizioni tandem della sequenza stem loop PP7 in posizioni diverse rispetto al sito di inizio della trascrizione e alla struttura dell'esone/ introne del gene reporter. I loop dello stelo dell'RNA MS2/PP7 si formano al momento della trascrizione e sono specificamente legati da proteine del mantello MS2/PP7 espresse ectopicamente marcate con proteine fluorescenti verdi e rosse, una strategia ampiamente utilizzata prima per la trascrizione delle immagini13,14,15. Inoltre, è stata inserita una singola copia della sequenza di riconoscimento a 18 bp per l'endonucleasi di homing I-SceI che è direttamente affiancata dagli array di sequenze stem-loop dell'RNA nei geni reporter. Sono state utilizzate tecniche di clonazione standard per generare tutti i plasmidi, il frammento contenente lo stem-loop I-SceI-24xMS2 del gene reporter PROP è stato sintetizzato da un servizio di sintesi genica commerciale.

Il gene reporter DSB promotore-prossimale (PROP) è stato costruito inserendo il sito di taglio I-SceI 45 coppie di basi (bp) a valle del presunto sito di inizio della trascrizione nell'esone I, seguito da 149 bp fino all'inizio della cassetta 24x MS2 stem-loop, che è stata progettata de novo con due sequenze stem-loop alternate non identiche16 e altre cinque sequenze distanziatrici non ripetitive da 20 bp per ridurre la ridondanza. L'array MS2 stem-loop è seguito da 72 bp fino all'inizio dell'introne 1844 bp e dall'esone II 1085 bp fino al sito di scissione e poliadenilazione. L'esone II codifica per una proteina fluorescente ciano (CFP) fusa in una sequenza di targeting perossisomale C-terminale (PTS) dalla perossisomiale acil-CoA ossidasi umana per consentire uno screening indipendente dell'espressione genica reporter (Figura 1A).

Il gene reporter dell'esone II DSB (EX2) è costituito da un esone I da 167 bp seguito dall'introne e dall'esone II che codificano per il CFP-PTS. Più a valle, a una distanza di 169 bp, è stata inserita una cassetta contenente 24 anelli di stelo MS2, seguita da una sequenza di linker da 84 bp con un sito I-SceI al centro, seguita da 24x PP7 stem-loop e 221 bp fino al sito di scissione e poliadenilazione17 (Figura 1B).

Infine, il gene reporter dell'esone II DSB con marcatura di trascrizione antisenso (EX2AS) si basa sul trascritto del gene dell'ubiquitina B umana (UBB) UBB-201 e contiene due esoni e un introne. L'esone I ha una lunghezza totale di 1534 bp con un inserimento inverso della sequenza stelo-loop MS2 24x. Pertanto, la corretta sequenza di RNA stem-loop MS2 verrà trascritta in una direzione antisenso rispetto alla trascrizione sensoriale del gene reporter dal promotore CMV. L'introne ha una lunghezza di 490 bp, seguito dall'esone II con il sito I-SceI , ed è stata inserita una regione codificante per due subunità di ubiquitina in-frame. A valle del gene UBB c'è una sequenza che forma un ciclo di stelo PP7 24x alla trascrizione del gene reporter in una direzione di senso (Figura 1C).

La trasfezione transitoria di un costrutto inducibile dell'endonucleasi di homing I-SceI consente la creazione controllata di un DSB nel sito di riconoscimento inserito all'interno di ciascun gene ^reporter18. L'endonucleasi I-SceI è fusa in frame con il dominio legante il ligando del recettore glucocorticoide e una proteina fluorescente rosso lontano iRFP713. Questo costrutto è citoplasmatico in assenza di triamcinolone acetonide (TA) ma migra rapidamente nel nucleo con l'aggiunta di TA al mezzo di crescita delle cellule (Figura 1D). L'induzione dei DSB da parte del sistema I-SceI è robusta, come dimostrato prima18,19,20. La trascrizione del gene reporter può essere monitorata in parallelo visualizzando i sistemi di stem-loop di RNA marcati in modo fluorescente MS2 e PP7.

Protocollo

1. Preparazione e trasfezione di cellule per la microscopia a cellule vive

1. Preparare un pallone di coltura cellulare di ^{25 cm2} della linea cellulare reporter (EX2, EX2-AS o PROM) con 5 ml di DMEM per raggiungere l'80-90% di confluenza il giorno prima dell'esperimento di microscopia a cellule vive.
2. Aspirare il mezzo con una pipetta dal matraccio di coltura cellulare da ^{25 cm2} e lavare le cellule con 2,5 mL di 1x PBS.
3. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA (0,05%) e incubare a 37 °C per 2-3 minuti per il distacco cellulare.
4. Dopo il distacco cellulare, aggiungere 4 ml di DMEM senza tampone HEPES contenente rosso fenolo, integrato con il 10% (v/v) di siero bovino fetale spogliato di carbone e risospese delicatamente le cellule.
5. Piastra 1 mL della soluzione cellulare in una parabola rotonda da 35 mm con pozzetto di fondo di vetro da 10 mm (diametro n. 1,5) e omogeneizzare. Conservare il piatto rotondo da 35 mm all'interno di un piatto di coltura cellulare standard da 100 mm e incubarlo a 37 °C in un'atmosfera umidificata con il 5% di _CO2.
6. ~ 6 ore dopo la semina, trasfettare le cellule nel piatto di fondo di vetro. Per ogni miscela di trasfezione, preparare due soluzioni nel modo seguente:
   1. In un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL, preparare la soluzione A contenente 150 μL di mezzo essenziale minimo (MEM) sierico ridotto, DNA plasmidico (come descritto nella Tabella 1) e 2,5 μg/μL di DNA del reagente helper di trasfezione (vedere Tabella dei materiali).
   2. In parallelo, preparare la soluzione B, contenente 150 μL di MEM sierica ridotta e 1,5 μg/μL di DNA di un reagente di trasfezione a base lipidica (vedere Tabella dei materiali).
   3. Incubare entrambe le soluzioni a temperatura ambiente (RT) per 5 min. Quindi, aggiungere delicatamente la soluzione A alla soluzione B e incubare 20 minuti a RT.
   4. Per trasfettare le cellule, aggiungere 300 μL di soluzione A + B a goccia a ciascun piatto e distribuire delicatamente. Conservare il piatto con fondo di vetro all'interno di un piatto di coltura cellulare standard da 100 mm e incubarlo a 37 °C in un'atmosfera umidificata con il 5% di _CO2.
7. Preparare un tubo microcentrifuga da 1,5 mL con 200 μL di DMEM con HEPES, senza rosso fenolo integrato con siero bovino fetale spogliato al 10% (v/v) di carbone e aggiungere TA ad una concentrazione di 7,5 x ^10-7 M.

2. Configurazione sperimentale

1. Impostare la temperatura della grande camera di incubazione del microscopio in plexiglass e della camera di incubazione dello stadio superiore a 37 °C presso l'unità di controllo comune. Impostare le condizioni ambientali all'interno della camera di incubazione del palcoscenico al 5% di _CO2 e al 100% di umidità.
   NOTA: La temperatura della gabbia del microscopio e dell'incubatore dello stadio deve essere impostata almeno 1 ora prima di iniziare l'esperimento per consentire il riscaldamento dell'intero sistema per ridurre al minimo le fluttuazioni di temperatura. Avviare tutte le altre unità di controllo e operative del microscopio contemporaneamente.
2. Indurre la trascrizione dei geni reporter aggiungendo doxiciclina (0,5 μg/mL) al mezzo di crescita e mescolare delicatamente pipettando su e giù con una micropipetta da 200 μL ~ 1 ora prima di iniziare l'osservazione al microscopio.
   NOTA: Tenere il piatto con fondo di vetro con le cellule trasfettate all'interno di un piatto di coltura cellulare standard da 100 mm per una facile manipolazione e trasporto dalla coltura cellulare alla stanza del microscopio in un contenitore di polistirolo per mantenere la temperatura il più stabile possibile.
3. Trasportare le cellule al microscopio almeno 30 minuti prima di iniziare l'osservazione e all'arrivo, posizionare la parabola da 100 mm con le cellule immediatamente all'interno della camera di incubazione del microscopio grande preriscaldata.
4. Posizionare il tubo microcentrifuga con l'AT pre-diluito dal punto 1.7. all'interno della grande camera ambientale del microscopio per riscaldare fino a 37 °C.
5. Sostituire il coperchio del piatto inferiore in vetro simile a quello preparato in precedenza con un foro di 3 mm di diametro praticato nel coperchio (Figura 2A).
   NOTA: Il TA verrà aggiunto successivamente alle cellule attraverso il piccolo foro nel coperchio senza manipolare il piatto montato sullo stadio del microscopio.
6. Selezionare l'obiettivo di immersione in olio 100x (obiettivo apocromatico, apertura numerica 1,4) nel pannello di controllo del microscopio. Applicare una goccia di olio per immersione all'obiettivo.
   1. Posizionare il piatto con fondo di vetro con le cellule all'interno della camera di incubazione dello stadio del microscopio e bloccarlo in posizione. Chiudere il coperchio dell'incubatore del palco e tutte le porte dell'alloggiamento del microscopio.
7. Avviare il software di funzionamento e controllo del microscopio, aprire la finestra Controllo messa a fuoco (Figura 2B), fare clic sul riquadro Ambito e, nel riquadro Selezione emissioni , fare clic sulla casella Occhio al 100% per impostare il percorso del fascio oculare per l'osservazione diretta del campione ad occhio.
   1. Nel menu Set filtri , passare a Set filtri occhi e fare clic su Brightfield, quindi premere il pulsante Apri Brightfield .
8. Spostare l'obiettivo del microscopio verso il piatto di fondo di vetro fino a quando l'olio tocca il vetro. Quindi guarda attraverso gli oculari e concentrati manualmente sul piano delle cellule. Spegnere il pulsante Apri Brightfield .
9. Lasciare le celle per 30 minuti prima di iniziare le osservazioni sperimentali per adattarsi alle condizioni ambientali e prevenire la deriva focale durante l'imaging da gradienti di temperatura.
10. Posizionare una micropipetta da 200 μL e punte filtranti da 200 μL pronte per l'uso a temperatura ambiente.

3. Acquisizione di immagini

1. Nella finestra Focus Control del software di controllo del microscopio, impostare l'intensità del laser su 5% e immettere un valore di 50 ms per il tempo di esposizione (Figura 2B).
2. Aprire la finestra Acquisizione per regolare le impostazioni in modo da eseguire un'acquisizione automatica delle immagini di time-lapse tridimensionali (3D) (Figura 2C).
3. Selezionare il tipo di acquisizione 3D e impostare da 12 a 16 fette ottiche separate da 0,4 μm, selezionare le caselle di controllo Intervallo intorno alla corrente e Torna alla posizione corrente dopo l'acquisizione.
4. Nel riquadro Acquisizione Timelapse immettere il valore 120 per il numero di punti temporali e 30 s per l'intervallo.
5. Selezionare il set di filtri confocali in base alle etichette delle proteine fluorescenti trasfettate con λ = 488 nm per GFP, λ = 561 nm per TagRFPt e λ = 640 nm per iRFP713 e impostare il tempo di esposizione per ciascun canale su 50 ms.
6. Utilizzare l'impostazione Corrente per la potenza del laser per utilizzare il valore di 5% selezionato nella finestra di messa a fuoco (Figura 2C).
7. Nella finestra Controllo messa a fuoco , accedere al riquadro Fotocamera , selezionare il controllo Ridimensiona visualizzazione immagini e scegliere il pulsante Manuale per impostare un intervallo fisso di intensità dell'immagine da visualizzare. Immettere i valori per Basso: 500 e Alto: 5000 (vedere la Figura 2B).
   NOTA: questa impostazione limita la gamma dinamica dell'acquisizione della fotocamera visualizzata nella vista dal vivo per selezionare le celle all'interno dello stesso intervallo di intensità di fluorescenza (Figura 2D).
8. Selezionare le celle per l'imaging time-lapse 3D dei siti di trascrizione dopo l'induzione di un DSB. Esaminare le celle e selezionare tre campi visivi in base alle condizioni descritte nella discussione.
9. Focalizzare ogni cella selezionata precedentemente situata al centro del campo visivo con il sito di trascrizione nel piano intermedio dello stack Z.
   NOTA: la centratura della cella e del sito di trascrizione in XYZ consente di spostare la cella.
10. Contrassegnare ogni posizione XYZ nel riquadro XY della finestra Controllo messa a fuoco facendo clic su Imposta punto.
    NOTA: Rivisitare le posizioni selezionate 2-3 volte nei successivi 5 minuti per confermare la trascrizione continua dei geni reporter e la relativa stabilità posizionale delle posizioni delle cellule nelle dimensioni XYZ.
11. Aggiungere 200 μL dell'AT pre-diluito dal punto 1.7. alle celle come mostrato nella Figura 2F.
    NOTA: Prestare estrema attenzione a non toccare il piatto con fondo di vetro o il coperchio durante l'aggiunta del TA per evitare qualsiasi spostamento dalle posizioni XY contrassegnate. Dopo l'induzione DSB, confermare che le celle sono centrate all'interno del campo visivo e che il sito di trascrizione si trova nel piano Z centrale. La rimessa a fuoco e l'aggiornamento della posizione non dovrebbero richiedere più di 1-2 minuti.
12. Avviare l'imaging di serie temporali 3D facendo clic su Avvia nella finestra Acquisizione .
13. Salvare i dati di imaging nel formato di dati del software di controllo del microscopio sul disco rigido del computer di controllo del microscopio.

4. Analisi dei dati

1. Aprire i dati di imaging nel software di controllo del microscopio ed esportarli come file in formato TIFF a 16 bit.
2. Aprire i file esportati con il software ^StaQtool21 . Selezionare la modalità Single Spot 3D e caricare i file immagine premendo Vai.
   NOTA: la serie temporale selezionata viene aperta nel Visualizzatore Timelapse di proiezione massima, mostrando una proiezione di intensità massima dello z-stack del primo punto temporale (Figura 3A).
3. Regola la visualizzazione dell'intensità dell'immagine con il cursore VERTICALE MAX sul lato sinistro.
4. Selezionare il punto temporale da analizzare con il dispositivo di scorrimento orizzontale Timepoint .
5. Passare il cursore sulla posizione del sito di trascrizione etichettato per contrassegnare manualmente o utilizzare la funzione di rilevamento automatico e premere sul rispettivo sito di trascrizione se sono stati rilevati più oggetti.
6. Utilizzare la funzione Auto Track per determinare le posizioni XYZ del sito di trascrizione nel tempo.
   NOTA: se una determinata posizione non è stata tracciata correttamente, selezionare manualmente il sito di trascrizione in base al manuale del software StaQtool.
7. Premere il pulsante Auto per eseguire il raccordo Gauss per ogni timepoint e misurare l'intensità di fluorescenza totale (TFI).
   NOTA: se l'attività trascrizionale cessa, lo strumento di tracciamento rimane nell'ultima posizione in cui è stato rilevato un oggetto con diffrazione limitata (un sito di trascrizione etichettato). Se la cella si muove in direzione XY dopo la scomparsa dell'etichetta del sito di trascrizione, è necessario un riposizionamento manuale del quadrato di ricerca .
8. Dopo aver completato l'adattamento del valore TFI per ogni punto temporale, premere il pulsante Termina timelapse per chiudere il file di immagine della serie temporale corrente e passare al file successivo.
   NOTA: i valori TFI vengono automaticamente esportati e salvati in un file Excel.

5. Misurazioni e analisi della calibrazione al microscopio

1. Seminare le cellule in piatti con fondo di vetro da 35 mm e trasfettare con le proteine del rivestimento MS2 e PP7 marcate fluorescentemente come descritto nella sezione 1.
   NOTA: per le misurazioni di calibrazione, utilizzare le stesse linee cellulari geniche reporter descritte nell'Introduzione.
2. Aggiungere 0,5 μg/mL di doxiciclina al terreno di crescita delle cellule 1 ora prima di iniziare l'acquisizione di immagini al microscopio.
3. Montare la parabola con fondo di vetro all'interno della camera di incubazione dello stadio del microscopio e preparare l'acquisizione dell'immagine come prima (vedere paragrafo 2).
   NOTA: il coperchio originale del piatto con fondo di vetro non viene sostituito per gli esperimenti di calibrazione.
4. Utilizzare le stesse impostazioni di intensità ed esposizione del laser descritte al punto 3.1.
5. Impostate le impostazioni di acquisizione per le serie temporali 2D (deselezionate l'opzione 3D nel riquadro Tipo di acquisizione ) e impostate 120 timepoint a intervalli di 500 ms nel pannello Acquisizione Timelapse (Figura 2C).
   NOTA: questa impostazione di acquisizione delle immagini si tradurrà in serie temporali all'interno di un singolo piano ottico a intervalli molto brevi.
6. Acquisisci dozzine di serie temporali di calibrazione da più posizioni per generare set di dati per contare diverse centinaia di misurazioni TFI a trascrizione singola.
7. Per l'analisi delle serie temporali di calibrazione, convertire i file in file in formato TIFF a 16 bit conformemente al punto 4.1.
8. Aprire i file esportati con il software ^StaQtool21 (Figura 3). Premere il pulsante Seleziona file LOG , scegliere il File di registro delle rispettive serie temporali 2D acquisite come descritto al punto 4.2.
9. Selezionare la casella di controllo Multiple Spots 2D e premere il pulsante GO per caricare la serie temporale nel software di analisi.
10. Nella finestra del visualizzatore Timelapse (Figura 3A), nel PSF FWHM, il campo di input inserisce il valore calcolato per il sistema e l'obiettivo del microscopio come ^descritto21.
11. Per avviare il processo di analisi, premere il pulsante Rilevamento automatico per rilevare tutti gli oggetti con diffrazione limitata per il punto temporale corrente visualizzato. Quindi, fate clic su Adattamento automatico (AutoFit ) per eseguire il raccordo gaussiano (Raccordo gaussiano) per determinare il valore TFI per ciascun oggetto (Figura 3A).
12. In alternativa, posizionate il cursore su un oggetto con diffrazione limitata e fate clic per selezionarlo (viene visualizzato un cerchio verde all'interno di un quadrato bianco), quindi premete il pulsante Gaussian Fit per la selezione manuale e la procedura di fitting gauss.
    NOTA: l'ultima modalità è consigliata per escludere oggetti non contati, come siti di trascrizione luminosi con diversi trascritti nascenti presenti nello stesso nucleo.
13. Premere il pulsante Termina timelapse per completare il passaggio precedente.
    Nota : i risultati vengono salvati automaticamente in un formato di file di Microsoft Excel nella stessa cartella del file di immagine.
14. Avviare il modulo TFI e W Distributions per più punti premendo il rispettivo pulsante (Figura 3B).
15. Caricare i file Excel tramite il pulsante Aggiungi file e avviare l'analisi TFI premendo il pulsante Vai.
    NOTA: l'output è il valore medio di IFT determinato da più IFT misurate singole.
16. Iniziate l'analisi W inserendo il FPF FWHM precedentemente utilizzato al punto 5.10. e premere il pulsante Vai utilizzando il valore predefinito per il Cestino.
    NOTA: Il parametro W è il controllo di qualità per le misurazioni TFI a trascrizione singola per conformarsi al valore FWHM PSF corretto per il sistema di microscopio utilizzato.

6. Fusione di dati e calibrazione

1. Immettere i valori TFI della serie temporale ottenuti dal foglio Excel salvato al punto 4.8. in un nuovo foglio Excel e dividere ogni valore del punto temporale per la TFI media per le singole trascrizioni ottenute al punto 5.15.
   Nota : per standardizzare questo processo, sono stati utilizzati moduli modello di Excel preparati su misura.

Risultati

Le linee cellulari che ospitano i geni reporter descritti nella Figura 1A-C consentono lo studio delle dinamiche di trascrizione in un singolo DSB in cellule vive. I numeri nella Figura 1A-C sotto ogni rappresentazione grafica del gene reporter indicano la lunghezza in coppie di kilobasi (kbp). CMV indica il promotore del citomegalovirus, TetO è le sequenze Tet-operatore, pA evidenzia la scissione 3' e il sito di poli-adenilazione all'estremità del gene. CFP-PTS è la proteina fluorescente ciano codificata fusa a un segnale di targeting perossisomiale e 2UBB è l'unità tandem di ubiquitina B umana codificata. Seguendo il protocollo e le procedure di analisi sopra descritte, è possibile ottenere grafici che mostrano il numero di trascrizioni geniche reporter marcate fluorescentemente nel tempo, con una risoluzione temporale di secondi su periodi fino a ore (Figura 4A-D). Il grafico nella Figura 4A mostra il decorso temporale dei valori TFI di un sito di trascrizione genica reporter PROM etichettato dall'accumulo di molecole MS2-GFP su trascritti nascenti. Questo particolare grafico rappresenta un esperimento di controllo senza aggiunta di TA; pertanto, non viene indotto alcun DSB. La trascrizione continua con picchi simili a scoppi e 2-8 trascrizioni alla volta per l'intero periodo di osservazione di 60 minuti. Risultati simili sono stati ottenuti per i geni reporter EX2 ed EX2-AS (dati non mostrati qui)⁴. L'induzione di un singolo DSB nei geni reporter (utilizzando I-SceI-GR-iRFP) consente di studiare l'impatto del DSB sulla trascrizione del gene reporter in corso e il monitoraggio degli eventi di trascrizione emergenti dal sito DSB, ovvero la trascrizione indotta da rotture (Figura 4B-D).

La dinamica della trascrizione indotta dalla rottura del DNA dipende dalla posizione del DSB all'interno del gene
L'induzione di un singolo DSB da parte di I-SceI-GR-iRFP nel gene reporter con un sito di riconoscimento I-SceI promotore-prossimale porta al silenziamento trascrizionale del gene reporter dopo circa 11 minuti dall'aggiunta di TA e la trascrizione non viene ripristinata entro il periodo di osservazione di 60 minuti (Figura 4B). Osservando la trascrizione del gene reporter EX2, la completa soppressione della trascrizione canonica guidata dal promotore è stata rilevata da una perdita simultanea completa di entrambi i segnali MS2-GFP e PP7-RFP circa 30 minuti dopo l'aggiunta di TA. Tuttavia, entro 10 minuti, la trascrizione ricomincia, come rivelato dalla ricomparsa dei picchi di fluorescenza PP7-RFP. Il recupero completo del segnale PP7-RFP (e non della fluorescenza MS2-GFP) mostra l'inizio della trascrizione indotta da interruzioni (Figura 4C). La trascrizione indotta da rottura non è stabile per lunghi periodi; appare simile a una raffica e a bassa intensità di picco, indicando che solo poche trascrizioni indotte da interruzioni sono state avviate dal sito DSB.

Il gene reporter EX2AS, che contiene un array stem-loop PP7 24x nell'esone II a valle del sito I-SceI per rilevare la trascrizione di senso, mostra la trascrizione canonica guidata dal promotore che termina all'interno del gene reporter EX2AS entro circa 25 minuti dall'aggiunta di TA. Viene quindi sostituito dalla trascrizione indotta da rotture antisenso, come rivelato dall'accumulo di legame della proteina MS2-GFP all'RNA generato da sequenze di stem-loop MS2 antisenso (Figura 4D). L'attività trascrizionale antisenso era assente prima dell'interruzione della trascrizione sensoriale a causa dell'induzione del DSB e mostra in questo esempio che diversi trascritti sono stati avviati dal sito di rottura entro circa 15 minuti. I dati rappresentativi qui ottenuti mostrano che i DSB hanno effetti diversi sulla trascrizione a seconda della loro posizione all'interno del gene, come è stato recentemente ^riportato4. I dati rivelano anche una variabilità da cella a cellula nei tempi dell'induzione DSB da parte di I-SceI-GR-iRFP, che varia da 12 a 30 minuti dopo l'aggiunta di TA. Inoltre, la rilevazione di trascritti individuali permette la scoperta di differenze da cellula a cellula e di sito di rottura verso l'intensità dell'attività trascrizionale indotta da rottura. La trascrizione indotta da rottura viene rilevata solo nei DSB all'interno del gene. È assente nei DSB promotori-prossimali, dove la trascrizione canonica cessa su un DSB per il restante periodo di osservazione.

Figura 1: Geni reporter e il sistema per indurre rotture a doppio filamento del DNA. La rappresentazione schematica in (A) a (C) mostra la struttura dei tre geni reporter utilizzati per studiare la trascrizione dopo l'induzione di una rottura del doppio filamento di DNA. Il gene reporter con il sito I-SceI promotore-prossimale nel primo esone (PROM) affiancato a valle da un array di sequenze MS2-loop (MS2-SL) 24x è raffigurato in (A). Il gene reporter con il sito I-SceI nel secondo esone (EX2) affiancato a monte con una sequenza stem-loop MS2 24x e a valle da un array 24x PP7 stem-loop (PP7-SL) è mostrato in (B). Il gene reporter con il sito I-SceI situato nell'esone II con un inserimento anti-parallelo della sequenza stem-loop MS2 24x a monte del sito I-SceI per rilevare la trascrizione antisenso (EX2-AS) è mostrato in (C). La funzione del costrutto della proteina di fusione I-SceI-GR-iRFP è rappresentata in (D) da un display grafico e dalle corrispondenti immagini di cellule vive di seguito. Dopo l'espressione transitoria del costrutto (colore rosso) nelle linee cellulari del gene reporter, la proteina è esclusivamente citoplasmatica, il che impedisce una scissione prematura del sito bersaglio da parte dell'endonucleasi I-SceI . Con l'aggiunta di TA, la proteina di fusione inizia a migrare nel nucleo cellulare (indicato da una linea tratteggiata) e inizia ad accumularsi tra 5-15 minuti. Scalebar = 10 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Selezione delle celle per l'imaging time-lapse 3D dei siti di trascrizione. La foto in (A) mostra una parabola con fondo di vetro da 35 mm utilizzata per l'imaging di cellule vive, con un coperchio modificato personalizzato, in cui è stato praticato un foro di 3 mm di diametro per aggiungere direttamente il TA diluito nel mezzo di crescita. La posizione del foro è contrassegnata da un cerchio rosso. Il pannello in (B) mostra uno screenshot della finestra "Focus" del software di controllo del microscopio per impostare il tempo di esposizione della vista dal vivo, l'impostazione del filtro, l'intensità del laser e la visualizzazione dell'immagine in scala per lo schermo per le cellule per la successiva imaging time-lapse in (C), lo screenshot della corrispondente finestra "Capture" per regolare tutte le impostazioni per l'acquisizione time lapse 3D delle cellule vive. Le impostazioni specifiche per i riquadri Filtro, Tipo di acquisizione, Acquisizione time-lapse e Acquisizione 3D sono descritte nella sezione 3. Nella vista mostrata qui, le impostazioni sono regolate per acquisire un time-lapse 3D della linea genica reporter PROM trasfetta con i costrutti MS2-GFP e I-SceI-GR-iRFP per la trascrizione dell'imaging dopo l'induzione di una rottura del doppio filamento del DNA nella regione promotore-prossimale del gene reporter. L'immagine in (D) è unita per i canali GFP e iRFP e mostra un campo visivo visto attraverso il sistema del microscopio, con diverse cellule della linea cellulare del gene reporter 293-PROM. Le cellule sono state co-trasfettate con il costrutto della proteina del rivestimento MS2 in tandem dimero fuso in una sequenza di localizzazione nucleare, due proteine fluorescenti verdi (GFP-MS2CP) e il costrutto I-SceI-GR-iRFP. Diverse cellule mostrano l'espressione del costrutto GFP-MS2CP, evidenziando così i nuclei e il costrutto I-SceI-GR-iRFP evidenziando il citoplasma. Il quadrato tratteggiato indica la regione ingrandita mostrata nella (E). Per l'imaging time-lapse 3D, le cellule vengono selezionate in base ai requisiti conferiti nella discussione, come la cella con il nucleo più grande nella regione ingrandita in (D). Questa cellula viene trasfetta con entrambi i costrutti fluorescenti e mostra un sito di trascrizione brillantemente marcato (punta di freccia) accumulando il GFP-MS2CP sui pre-mRNA del gene reporter trascritto de novo (immagine a sinistra). Il mezzo di crescita delle cellule non contiene TA; pertanto, il costrutto I-SceI-GR-iRFP è esclusivamente citoplasmatico (immagine a destra). In (F), la parabola con fondo di vetro è montata nella camera di incubazione dello stadio del microscopio per esperimenti di imaging time-lapse 3D e dotata del coperchio personalizzato contenente il foro di carico TA. La punta della micropipetta da 200 μL viene accuratamente inserita nel foro per applicare l'TA diluito al mezzo di crescita delle cellule. Scalebar = 10 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Software di acquisizione e analisi delle immagini. Il pannello in (A) mostra uno screenshot dello strumento STaQTool: Spot tracking and quantification. L'immagine mostra una serie temporale di esempio della linea cellulare del gene reporter PROM con sito di trascrizione etichettato contrassegnato con un cerchio verde / quadrato bianco nel display di proiezione di massima intensità al centro. Le finestre sul lato destro mostrano una vista ingrandita del punto del sito di trascrizione selezionato, il corrispondente grafico della superficie di intensità ombreggiata 3D con la griglia di adattamento gaussiana 2D per il punto temporale corrente, nonché i grafici della posizione Z del punto Z del sito di trascrizione all'interno dello z-stack, la larghezza di adattamento gaussiana (W) e la misurazione TFI nel tempo. L'immagine microscopica in (B) mostra un singolo piano ottico ingrandito di un nucleo di una linea cellulare genica reporter PROM trasfettato con MS2-GFP. L'immagine rappresenta un punto una tantum di una serie temporale di calibrazione 2D con 120 punti temporali. Il nucleo mostra diversi trascritti marcati fluorescentemente che appaiono come oggetti limitati alla diffrazione nel nucleoplasma (contrassegnati da quadrati bianchi). Il pannello laterale destro mostra uno screenshot dello strumento TFI e W Distributions in STaQTool per analizzare più punti nelle acquisizioni time-lapse 2D. In questa analisi di esempio, lo strumento ha rilevato 408 punti limitati alla diffrazione che rappresentano i trascritti genici reporter etichettati con MS2-GFP che si diffondono nel nucleoplasma. I grafici a destra mostrano gli istogrammi di distribuzione della larghezza di adattamento TFI e gaussiano degli oggetti e le curve di adattamento gaussiano. I valori medi TFI e W derivati dalla posizione del picco centrale della curva di adattamento gaussiana e gli intervalli di confidenza calcolati vengono visualizzati nel rispettivo riquadro. Scalebar = 10 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi del rilevamento della trascrizione nei siti di rotture a doppio filamento del DNA. I grafici in (A) a (D) rappresentano la curva TFI calibrata di un sito di trascrizione nel tempo. I valori TFI vengono convertiti in trascritti utilizzando la TFI media di singoli trascritti misurati negli esperimenti di calibrazione per il rispettivo costrutto del gene reporter e la proteina legante l'RNA stem-loop marcata fluorescentemente MS2 o PP7 utilizzata nel rispettivo esperimento. In (A), viene mostrato un grafico di un esperimento di controllo che utilizza il gene reporter PROM senza aggiunta di TA. I trascritti etichettati con MS2-GFP indicano un'attività trascrizionale continua durante l'intero periodo di osservazione. Il grafico in (B) rappresenta il gene reporter PROM dopo l'aggiunta di TA e l'induzione di un DSB che porta ad una soppressione della trascrizione per il tempo di osservazione rimanente. Il grafico del gene reporter EX2 in (C) mostra una soppressione della trascrizione guidata dal promotore canonico dopo l'aggiunta di TA. Più tardi nello stesso lasso di tempo, emerge solo l'attività trascrizionale etichettata PP7-RFP. Nel grafico in (D), la trascrizione del gene reporter EX2-AS dal promotore canonico nella direzione dei sensi è analogamente soppressa con l'aggiunta di TA al gene reporter EX2 in (C). Tuttavia, l'aspetto di trascrizioni marcate MS2-RFP provenienti dalla sequenza stem-loop MS2 inserita inversa indica una trascrizione antisenso assente durante l'attività di trascrizione sensoriale prima dell'aggiunta di TA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Linea cellulare reporter	EX2 e EX2-AS	BALLO
Plasmidi da trasfettare	1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP	1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP
	0,65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry	0,5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP
	0,35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP

Tabella 1: Trasfezione delle linee cellulari del gene reporter. La tabella descrive gli schemi di trasfezione e le quantità dei diversi plasmidi utilizzati per trasfettare le diverse linee cellulari del gene reporter in modo transitorio.

Discussione

I conflitti tra processi biologici essenziali come la replicazione, la trascrizione, il danno al DNA e la riparazione del DNA sono stati identificati come una fonte critica di instabilità del ^genoma22. Questi studi hanno anche portato alla scoperta della trascrizione nei siti di danno al DNA e hanno attribuito un ruolo funzionale ai trascritti indotti dalla rottura nella regolazione dei processi di riparazione del danno al ^DNA23. I nuovi strumenti e il protocollo qui descritto consentono ulteriori indagini sulle dinamiche di trascrizione dell'RNA Pol II presso i DSB. Un punto critico in questo protocollo è la generazione di linee cellulari che contengono una singola copia del gene reporter integrato nel genoma. Questa caratteristica chiave elimina il rumore creato dalla trascrizione di diversi geni reporter integrati con più copie all'interno di un singolo locus genomico e consente la raccolta di parametri cinetici delle dinamiche di trascrizione e dei singoli trascritti di RNA. Un requisito tecnico cruciale per osservare la trascrizione di singole integrazioni geniche reporter è la disponibilità di un sistema al microscopio che consenta la rilevazione di singoli trascritti di RNA etichettati con il sistema MS2 o PP7 in cellule ^vive4,12. Qui, la microscopia a cellule vive viene eseguita su un sistema Confocal Spinning Disk montato su un microscopio invertito, dotato di laser a stato solido da 100 mW accoppiati a un filtro sintonizzabile acustico-ottico come descritto ^altrove24. Inoltre, per studiare la trascrizione in un singolo DSB utilizzando i reporter, le singole cellule devono essere attentamente monitorate per ottenere la massima risoluzione temporale, che richiede l'imaging delle cellule per diverse ore, rendendo questo un test a basso rendimento. Tuttavia, osserviamo diverse cellule in parallelo con il posizionamento controllato da uno stadio di microscopio piezo-guidato. Per garantire condizioni ambientali ottimali per l'osservazione di cellule vive per ore, il corpo del microscopio, compreso lo stadio del campione, viene posizionato all'interno di una camera ambientale in plexiglass. Inoltre, una camera di incubazione a stadio chiuso è montata sullo stadio del microscopio e collegata ai controller di alimentazione di _CO2 e umidità.

Il primo passo critico nel protocollo è la selezione delle regioni di interesse con le cellule per l'imaging. Ogni posizione XY contrassegnata per l'imaging deve contenere una o più cellule che mostrano la trasfezione con le proteine leganti l'anello staminale dell'RNA fluorescente secondo il gene reporter e lo schema di trasfezione descritti nella Sezione 1, Tabella 1, nonché nella Figura 2D, E. Inoltre, le cellule devono presentare siti di trascrizione luminosi etichettati devono essere co-trasfettati con il costrutto I-SceI-GR-iRFP713 e la proteina deve essere localizzata inizialmente nel citoplasma (Figura 2D ed E).

Le cellule dovrebbero mostrare un livello di intensità di fluorescenza della proteina MS2 e/o PP7 marcata fluorescentemente non legata abbastanza bassa da rilevare singoli trascritti marcati sul livello di fluorescenza di fondo. Allo stesso tempo, è necessario un robusto livello di intensità di fluorescenza delle proteine del mantello MS2 e/o PP7 marcate fluorescentemente per consentire l'imaging per almeno 60 minuti senza perdere troppa fluorescenza a causa di uno sbiancamento che si verifica. Il "Display di immagini in scala" con un intervallo fisso come descritto nella Sezione 3.7 viene utilizzato per consentire una selezione standardizzata delle celle in base al loro livello di intensità di fluorescenza.

Un secondo passo critico del protocollo è l'aggiunta del TA alle celle in posizioni XY predeterminate attraverso il piccolo foro nel coperchio del piatto di fondo di vetro. Qualsiasi manipolazione del piatto di fondo di vetro causerebbe uno spostamento dalla posizione XY marcata delle cellule e deve essere evitata. Pertanto, maneggiare attentamente la micropipetta mentre si aggiunge l'AT diluito nel mezzo di crescita cellulare è vitale per l'osservazione di successo delle cellule preselezionate, come dimostrato nella Figura 2F. L'adattamento di diversi sistemi per aggiungere farmaci alle cellule montate su uno stadio di microscopio, come un sistema di perfusione, richiederebbe una camera di incubazione dello stadio separata con aperture di ingresso e uscita del tubo e una pompa o un sistema di iniezione per somministrare farmaci. Altri metodi come le diapositive del canale con superfici inferiori simili a coverslip provocano una lenta diffusione dei farmaci somministrati nel canale e causano un ulteriore ritardo tra l'aggiunta di farmaci e l'effetto. Infine, il pipettaggio incauto in un'apertura a scorrimento del canale può spostare anche la posizione del campione. Pertanto, l'attuale sistema con un foro praticato personalizzato nel coperchio di un piatto con fondo di vetro è semplice da adattare, a basso costo e adatto per la somministrazione di diversi mezzi di crescita, farmaci e componenti. Il piccolo diametro del foro e l'atmosfera umidificata nella camera di incubazione dello stadio impediscono anche l'essiccazione del mezzo cellulare.

Un terzo passo critico in questo protocollo è l'analisi dei dati, che richiede un'ispezione manuale dei punti temporali quando la trascrizione cessa a causa dell'induzione di un DSB. Il punto temporale di terminare la trascrizione è indicato rilasciando le ultime trascrizioni dal sito precedentemente brillante della trascrizione del gene reporter. Allo stesso modo, gli eventi di inizio della trascrizione indotta da rottura devono essere ispezionati con cura per rilevare singoli eventi di trascrizione con il rapporto segnale-rumore relativamente basso dei singoli mRNA marcati fluorescentemente.

La dinamica di riparazione del DSB indotto aggiunge un ulteriore livello di complessità alle analisi dei dati generati utilizzando questi reporter, limitandoli ai primi minuti immediatamente dopo l'induzione del DSB. La natura transgenica dei geni reporter e la natura ricca di ripetizioni degli array stem-loop MS2 e PP7 possono assemblare un paesaggio cromatinico unico, interferendo con la creazione di presunti programmi di trascrizione indotta da rottura stabili. Tuttavia, rispetto all'irradiazione ionizzante o UV, l'induzione mediata da I-SceI di un DSB nei geni reporter è un sistema molto più robusto per studiare la trascrizione nei singoli DSB.

Diversi sistemi di endonucleasi come I-CreI, I-PpoI o AsiSI che hanno o non hanno siti di riconoscimento aggiuntivi all'interno del genoma umano possono essere combinati con gli attuali sistemi genici reporter per una possibile maggiore efficienza di generazione di DSB. Tuttavia, richiedono prima l'introduzione del sito di riconoscimento dell'endonucleasi nei geni reporter. In secondo luogo, possono avere una variabilità simile sull'induzione dei tempi e dell'efficienza di un DSB nelle singole cellule. D'altra parte, l'inserimento di copie in tandem di siti di riconoscimento dell'endonucleasi può aumentare l'efficienza dell'induzione DSB. Inoltre, testare i sistemi genici reporter presentati in diverse linee cellulari consentirebbe il confronto delle dinamiche di trascrizione nei siti DSB tra diversi background cellulari e la disponibilità di diversi percorsi di riparazione del danno al DNA come nelle cellule tumorali, nelle cellule primarie e nelle cellule differenziate non cicliche. Tuttavia, la costruzione dei geni reporter per essere compatibili con il sistema Flp/FRT sta attualmente limitando l'integrazione nelle linee cellulari ospiti Flp/FRT disponibili.

Oltre alle applicazioni basate sulla microscopia, gli attuali geni reporter possono anche essere combinati con saggi biochimici, come l'immunoprecipitazione della cromatina, per studiare il reclutamento di fattori di riparazione o trascrizione del DNA in un singolo DSB o per valutare l'occupazione del nucleosoma, le modifiche degli istoni e lo stato della cromatina intorno al sito DSB. Inoltre, una combinazione con diversi sistemi di reporter consentirebbe lo studio dei collegamenti funzionali tra il danno al DNA e processi come l'organizzazione del genoma o la replicazione del DNA.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mW solid-state Lasers	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system	Intelligent Imaging Innovations Inc.
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512	Photometrics, Tucson, AZ USA
Axio Observer Z1 inverted microscope	Carl Zeiss MicroImaging, Germany
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-1
charcoal-stripped fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F6765-500 ML
CO2 module S	PeCon GmbH, Erbach, Germany
CSU-X1 confocal spinning disk unit	Yokogawa Electric, Tokyo, Japan
DMEM	Gibco	41966029
DMEM with Hepes no PhenolRed	Gibco	21063-029
Doxicyclin	Sigma-Aldrich	D9891	for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium
FBS	Gibco	10270106
Flp-In T-REx 293 cell line	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	R75007
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence	GeneArt, Thermo Fischer Scientific		custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences
Heating Device Humidity 2000	PeCon GmbH, Erbach, Germany
Hygromycin B	Roche	10843555001
Immersion oil Immersol 518 F	Carl Zeiss MicroImaging Inc.)	444960-0000-000
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001	transfection helper reagent
Lipofectamine 3000 reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001	lipid-based transfection reagent
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-10-C
microscope incubation chamber	PeCon GmbH, Erbach, Germany
pcDNA5/FRT/TO	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	V652020
pOG44 plasmid	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	V600520
SlideBook 6.0 Software	Intelligent Imaging Innovations Inc.
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000	PeCon GmbH, Erbach, Germany
StaQtool Software	iMM-JLA Lisbon, Portugal		available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip
triamcinolone acetonide (TA)	Sigma-Aldrich	T6501	synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus
Trypsin/EDTA Solution (TE)	Thermo Fisher Scientific	R001100