Визуализация транскрипционной активности живыми клетками при двухцепочечных разрывах ДНК

Резюме

Этот протокол представляет новую репортерную генную систему и экспериментальную установку для обнаружения транскрипции при двухцепочечных разрывах ДНК с чувствительностью к одной молекуле.

Аннотация

Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) являются наиболее серьезным типом повреждения ДНК. Несмотря на катастрофические последствия для целостности генома, до сих пор остается неуловимым, как DSB влияют на транскрипцию. Причиной этого стало отсутствие подходящих инструментов для одновременного мониторинга транскрипции и индукции генного DSB с достаточным временным и пространственным разрешением. Эта работа описывает набор новых репортеров, которые непосредственно визуализируют транскрипцию в живых клетках сразу после индукции DSB в шаблоне ДНК. Стволовые петли РНК бактериофага используются для мониторинга транскрипции с одномолекулярной чувствительностью. Для нацеливания DSB на определенную область гена гены-репортеры спроектированы так, чтобы содержать одну последовательность распознавания самонаводящейся эндонуклеазы I-SceI, в противном случае отсутствующей в геноме человека. Одна копия каждого гена-репортера была интегрирована в геном клеточных линий человека. Эта экспериментальная система позволяет обнаруживать одиночные молекулы РНК, генерируемые канонической транскрипцией гена или инициацией транскрипции, вызванной разрывом ДНК. Эти репортеры предоставляют беспрецедентную возможность для интерпретации взаимных взаимодействий между транскрипцией и повреждением ДНК и раскрытия до сих пор неоцененных аспектов транскрипции, вызванной разрывом ДНК.

Введение

Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) представляют собой токсичные поражения ДНК, которые нарушают функцию клеток и способствуют возникновению ряда заболеваний и ^{старению1}. Мутации, возникающие в результате неточного восстановления DSB, влияют на экспрессию генов и закладывают основу для функционального упадка клетки. Возникающее мнение о том, что DSB управляют de novo прерываемой транскрипцией в месте поражения2,3,4,5,6,7, предполагает, что DSB могут также влиять на клеточную функцию через РНК, индуцированные разрывом. Несколько недавних исследований показывают, что DSB достаточны для инициирования запрограммированной (например, у генов, индуцируемых стимулами) и незапланированной (например, у неканонических промоторов) транскрипции4,5,7. Однако, несмотря на несколько исследований, изучающих связи между повреждением ДНК и транскрипцией, область все еще отставала в своей способности обеспечить точную (то есть одномолекулярную) характеристику транскрипционных событий в местах разрыва ДНК. Одной из важных причин этого было отсутствие соответствующих экспериментальных инструментов. Облучение клеток (γ лучей, рентгеновских лучей, тяжелых ионов) и медикаментозное лечение (например, ингибиторы топоизомеразы или интеркалирующие агенты) не имеют пространственной точности и индуцируют поражения ДНК, отличные от DSB, включая одноцепочечные разрывы и аддукты ^ДНК8. Эндонуклеазы, такие как I-PpoI и AsiSI, генерируют локус-специфические DSB, но не были объединены с системой, которая позволяет одновременно визуализировать транскрипцию в одном локусе с высокой временной ^{точностью8}. Чтобы обойти это ограничение, наша лаборатория возглавила разработку набора передовых репортеров, которые непосредственно визуализируют транскрипцию с разрешением одной молекулы при контролируемой индукции уникального ^DSB4. Здесь мы описываем этих репортеров, предоставляем подробный протокол для визуализации транскрипции живыми клетками в DSB и показываем данные, раскрывающие инициацию транскрипции в одном DSB.

Репортерные генные системы, используемые в этом протоколе, основаны на хорошо охарактеризованном мышином гене-репортере IgM и содержат экзоны M1 и M2 мембранно-связанной формы (мкм) тяжелой ^цепи IgM μ ^9,10,11. Гибридный интрон разделяет два экзона сильным аденовирусным основным поздним транскриптом (AdML) PY ^tract12. Экспрессия генов-репортеров контролируется промотором цитомегаловируса человека (ЦМВ), в который вставлены две тандемные копии последовательности оператора Тета (ТетО). Каждый из генов-репортеров вставляется в плазмидный вектор, содержащий сайт Flp Recombination Target (FRT), и вставляется в определенный целевой сайт FRT в геноме клеточной линии хозяина HEK293. Эта клеточная линия также конститутивно экспрессирует белок репрессора Тета для регулирования экспрессии репортерного гена через присутствие или отсутствие тетрациклина / доксициклина. Чтобы обеспечить визуализацию транскрипции репортерного гена, 24 тандемных повтора последовательности стволовой петли MS2 и 24 тандемных повтора последовательности стволовой петли PP7 были вставлены в разные положения по отношению к месту начала транскрипции и структуре экзона/интрона репортерного гена. Стволовые петли РНК MS2/PP7 образуются при транскрипции и специфически связаны эктопически экспрессированными белками оболочки MS2/PP7, помеченными зелеными и красными флуоресцентными белками, стратегия, широко используемая ранее для визуализации транскрипции13,14,15. Кроме того, была вставлена единственная копия последовательности распознавания 18 bp для самонаводящейся эндонуклеазы I-SceI, которая непосредственно окружена массивами последовательностей стволовой петли РНК в генах-репортерах. Для генерации всех плазмид использовались стандартные методы клонирования, фрагмент, содержащий стволовую петлю I-SceI-24xMS2 репортерного гена PROP, был синтезирован коммерческим сервисом синтеза генов.

Промоторно-проксимальный ген-репортер DSB (PROP) был построен путем вставки сайта резки I-SceI 45 пар оснований (bp) ниже по потоку предполагаемого начального сайта транскрипции в экзоне I, за которым следовал 149 bp до начала 24x MS2 стволовой петли кассеты, которая была de novo разработана с двумя чередующимися неидентичными последовательностями стволовых ^{петель16} и дополнительные пять неповторяющихся последовательностей спейсеров 20 bp для уменьшения избыточности. За массивом стволовой петли MS2 следуют 72 bp до начала интрона 1844 bp и экзон II 1085 bp до расщепления и участка полиаденилирования. Экзон II кодирует голубой флуоресцентный белок (CFP), слитый с C-концевой пероксисомальной целевой последовательностью (PTS) из пероксисомальной ацилКоА-оксидазы человека, чтобы обеспечить независимый скрининг экспрессии репортерного гена (рисунок 1A).

Репортерный ген exon II DSB (EX2) состоит из экзона 167 bp I, за которым следуют интрон и экзон II, кодирующие CFP-PTS. Далее вниз по течению на расстоянии 169 bp была вставлена кассета, содержащая 24 штефонные петли MS2, за которой следовала последовательность линкера 84 bp с участком I-SceI в центре, за которой следовали 24x PP7 стволовые петли и 221 bp до расщепления и участка полиаденилирования17 (рисунок 1B).

Наконец, репортерный ген exon II DSB с антисмысловой транскрипцией (EX2AS) основан на транскрипте гена убиквитина B (UBB) человека UBB-201 и содержит два экзона и один интрон. Экзон I имеет общую длину 1534 bp с обратной вставкой последовательности 24x MS2 stem-loop. Таким образом, правильная последовательность стволовой петли РНК MS2 будет транскрибирована в антисмысловом направлении по отношению к чувственной транскрипции репортерного гена от промотора ЦМВ. Интрон имеет длину 490 bp, за которым следует экзон II с сайтом I-SceI , и область кодирования была вставлена для двух субъединиц убиквитина в кадре. Ниже по течению гена UBB находится последовательность, которая образует 24x PP7 стволовую петлю при транскрипции репортерного гена в смысловом направлении (рисунок 1C).

Транзиторная трансфекция индуцируемой конструкции самонаводящейся эндонуклеазы I-SceI позволяет контролировать создание DSB во вставленном месте распознавания в каждом гене-репортере18. Эндонуклеаза I-SceI сливается в рамке с лигандсвязывающим доменом глюкокортикоидного рецептора и дальнекрасным флуоресцентным белком iRFP713. Эта конструкция цитоплазматическая в отсутствие триамцинолона ацетонида (ТА), но быстро мигрирует в ядро при добавлении ТА к среде роста клеток (рисунок 1D). Индукция DSB системой I-SceI является надежной, как было продемонстрировано ранее18,19,20. Транскрипцию репортерного гена можно контролировать параллельно, визуализируя флуоресцентно помеченные системы стволовых петель РНК MS2 и PP7.

протокол

1. Подготовка и трансфекция клеток для микроскопии живых клеток

1. Подготовьте колбу с культурой клеток объемом ^{25 см2} репортерной клеточной линии (EX2, EX2-AS или PROM) с 5 мл DMEM для достижения 80-90% слияния за день до эксперимента по микроскопии живых клеток.
2. Аспирируйте среду пипеткой из колбы для культивирования клеток объемом ^{25 см2} и промывайте клетки 2,5 мл 1x PBS.
3. Добавляют 1 мл трипсина-ЭДТА (0,05%) и инкубируют при 37 °C в течение 2-3 мин для отслоения клеток.
4. После отслоения клеток добавляют 4 мл DMEM без фенольного красного, содержащего буфер HEPES, дополненный 10% (v/v) очищенной от древесного угля фетальной бычьей сывороткой, и осторожно повторно суспендируют клетки.
5. Пластину 1 мл клеточного раствора в круглой посуде диаметром 35 мм со стеклянно-донным колодцем диаметром 10 мм (диаметр No 1,5) и гомогенизировать. Храните круглую посуду диаметром 35 мм внутри стандартной чашки для культивирования клеток толщиной 100 мм и инкубируйте ее при 37 °C во увлажненной атмосфере с 5% _CO2.
6. ~6 ч после посева переведите ячейки в стеклянную нижнюю посуду. Для каждой трансфекционной смеси готовят два раствора следующим образом:
   1. В пробирке микроцентрифуги объемом 1,5 мл готовят раствор А, содержащий 150 мкл восстановленной сывороточной минимальной существенной среды (MEM), плазмидную ДНК (как описано в таблице 1) и 2,5 мкг/мкл ДНК реагента-помощника трансфекции (см. Таблицу материалов).
   2. Параллельно готовят раствор В, содержащий 150 мкл восстановленного MEM сыворотки и 1,5 мкг/мкл ДНК трансфектного реагента на основе липидов (см. Таблицу материалов).
   3. Инкубировать оба раствора при комнатной температуре (РТ) в течение 5 мин. Затем осторожно добавляют раствор А к раствору В и инкубируют 20 мин при РТ.
   4. Чтобы трансфектировать клетки, добавьте 300 мкл раствора A +B по каплям в каждое блюдо и аккуратно распределите. Храните стеклянную нижнюю посуду внутри стандартной чашки для клеточных культур толщиной 100 мм и инкубируйте ее при 37 °C во увлажненной атмосфере с 5% _CO2.
7. Приготовьте микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл с 200 мкл DMEM с HEPES, без фенольного красного, дополненного 10% (v/v) очищенной от древесного угля сывороткой крупного рогатого скота и добавьте TA до концентрации 7,5 х ^10-7 М.

2. Экспериментальная установка

1. Установите температуру инкубационной камеры большого плексигласового микроскопа и инкубационной камеры верхней ступени на уровне 37 °C на общем блоке управления. Установите условия окружающей среды внутри сценической инкубационной камеры на 5% _CO2 и 100% влажность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура клетки микроскопа и инкубатора должна быть установлена не менее чем за 1 ч до начала эксперимента, чтобы обеспечить нагрев всей системы для минимизации колебаний температуры. Запустите все остальные блоки управления и управления микроскопом одновременно.
2. Индуцировать транскрипцию репортерных генов путем добавления доксициклина (0,5 мкг/мл) в питательную среду и осторожно смешивать, пипетируя вверх и вниз микропипеттом 200 мкл ~ 1 ч перед началом микроскопического наблюдения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите стеклянную нижнюю чашку с трансфектированными клетками внутри 100 мм стандартной чашки для клеточных культур для легкой обработки и транспортировки из клеточной культуры в комнату микроскопа в контейнере из пенополистирола для поддержания максимально стабильной температуры.
3. Транспортируйте клетки к микроскопу не менее чем за 30 минут до начала наблюдения, а по прибытии поместите 100-миллиметровую чашку с клетками непосредственно внутрь предварительно нагретой инкубационной камеры большого микроскопа.
4. Поместите микроцентрифужную трубку с предварительно разбавленной ТА из шага 1.7. внутри камеры окружающей среды большого микроскопа для нагрева до 37 °C.
5. Замените крышку стеклянной нижней тарелки, аналогичную той, что была приготовлена ранее, отверстием диаметром 3 мм, просверленным в крышке (рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: ТА будет добавлена позже в ячейки через небольшое отверстие в крышке без манипулирования тарелкой, установленной на ступени микроскопа.
6. Выберите 100-кратный (апохроматический объектив, 1,4-я числовая диафрагма) масляный погружной объектив на панели управления микроскопом. Нанесите каплю погружного масла на объектив.
   1. Установите стеклянную тарелку с ячейками внутри инкубационной камеры микроскопа и зафиксируйте ее на месте. Закройте крышку сценического инкубатора и все дверцы корпуса микроскопа.
7. Запустите программное обеспечение для управления и управления микроскопом, откройте окно Focus Control (рисунок 2B), щелкните панель Scope (Область применения ) и на панели Emission Selection (Выбор излучения ) щелкните поле 100% Eye(100%), чтобы задать траекторию глазного пучка для прямого наблюдения образца глазами.
   1. В меню «Набор фильтров» переключитесь на «Набор фильтров глаз», выберите « Брайтфилд» и нажмите кнопку «Открыть Брайтфилд ».
8. Переместите объектив микроскопа к стеклянной нижней чашке, пока масло не коснется стекла. Затем посмотрите через глаз и вручную сосредоточьтесь на плоскости клеток. Отключите кнопку Открыть Brightfield .
9. Оставьте клетки на 30 минут перед началом экспериментальных наблюдений, чтобы адаптироваться к условиям окружающей среды и предотвратить фокальный дрейф во время визуализации по температурным градиентам.
10. Поместите готовые к использованию наконечники фильтра емкостью 200 мкл и 200 мкл при комнатной температуре.

3. Получение изображений

1. В окне Focus Control программного обеспечения управления микроскопом установите интенсивность лазера на 5% и введите значение 50 мс для времени экспозиции (рисунок 2B).
2. Откройте окно Захват , чтобы настроить параметры для выполнения автоматического получения изображения трехмерных (3D) таймлапсов (рисунок 2C).
3. Выберите тип захвата 3D и установите от 12 до 16 оптических срезов, разделенных 0,4 мкм, установите флажки Диапазон вокруг тока и Вернуться в текущее положение после захвата.
4. В области Timelapse Capture введите значение 120 для числа точек времени и 30 с для интервала.
5. Выберите набор конфокальных фильтров в соответствии с трансфектированными флуоресцентными белковыми метками с λ = 488 нм для GFP, λ = 561 нм для TagRFPt и λ = 640 нм для iRFP713 и установите время экспозиции для каждого канала равным 50 мс.
6. Используйте параметр Current для мощности лазера, чтобы использовать значение 5%, выбранное в окне фокусировки (рисунок 2C).
7. В окне Управление фокусировкой перейдите на панель Камера , выберите элемент управления Масштабировать отображение изображения и нажмите кнопку Вручную , чтобы настроить фиксированный диапазон интенсивности изображения для отображения. Введите значения для параметров Low: 500 и High: 5000 (см. рисунок 2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот параметр ограничивает динамический диапазон захвата камеры, отображаемый в режиме реального времени, для выбора ячеек в том же диапазоне интенсивности флуоресценции (рисунок 2D).
8. Выберите ячейки для 3D-покадровой визуализации участков транскрипции при индукции DSB. Откройте ячейки и выберите три поля зрения в соответствии с условиями, описанными в обсуждении.
9. Сфокусируйте каждую выделенную ячейку, ранее расположенную в центре поля зрения, с сайтом транскрипции в средней плоскости Z-стека.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Центрирование клетки и сайта транскрипции в XYZ приспосабливается к некоторому движению клетки.
10. Отметьте каждую позицию XYZ на панели XY окна Focus Control (Управление фокусом ), щелкнув Set Point (Задать точку).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторно посещайте выбранные позиции 2-3 раза в течение следующих 5 минут для подтверждения непрерывной транскрипции генов-репортеров и относительной позиционной стабильности положений клеток в размерах XYZ.
11. Добавьте 200 мкл предварительно разбавленного ТА со стадии 1.7. в ячейки, как показано на рисунке 2F.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте предельно осторожны, чтобы не касаться стеклянного дна тарелки или крышки при добавлении TA, чтобы предотвратить любое смещение из отмеченных положений XY. После индукции DSB подтвердите, что клетки центрированы в поле зрения, а место транскрипции находится в центре Z-плоскости. Перефокусировка и обновление положения должны занять не более 1-2 мин.
12. Запустите 3D-образ времени, нажав кнопку Пуск в окне Захват .
13. Сохраните данные изображения в формате данных программного обеспечения управления микроскопом на жестком диске компьютера управления микроскопом.

4. Анализ данных

1. Откройте данные визуализации в программном обеспечении управления микроскопом и экспортируйте их в виде 16-битных файлов формата TIFF.
2. Откройте экспортированные файлы с помощью программного обеспечения ^StaQtool21 . Выберите режим Single Spot 3D и загрузите файлы изображений, нажав кнопку Go.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный временной ряд открывается в Max Projection Timelapse Viewer, показывая проекцию максимальной интенсивности z-стека первой точки времени (рисунок 3A).
3. Отрегулируйте отображение интенсивности изображения с помощью вертикального ползунка MAX с левой стороны.
4. Выберите точку времени для анализа с помощью горизонтального ползунка «Точка времени ».
5. Наведите курсор на позицию помеченного сайта транскрипции для ручной маркировки или воспользуйтесь функцией Автоматическое обнаружение и нажмите на соответствующий сайт транскрипции, если было обнаружено несколько объектов.
6. Используйте функцию Auto Track для определения позиций XYZ сайта транскрипции с течением времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если данная позиция была отслежена неправильно, выберите сайт транскрипции вручную в соответствии с руководством по программному обеспечению StaQtool.
7. Нажмите кнопку Auto , чтобы выполнить установку Gauss для каждой точки времени и измерить общую интенсивность флуоресценции (TFI).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если транскрипционная активность прекращается, инструмент отслеживания остается на последнем месте, где был обнаружен объект с ограничением дифракции (меченый сайт транскрипции). Если ячейка движется в направлении XY после исчезновения метки сайта транскрипции, требуется ручное изменение положения квадрата поиска .
8. После завершения установки значения TFI для каждой точки времени нажмите кнопку End timelapse , чтобы закрыть текущий файл изображения временных рядов и перейти к следующему файлу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения TFI автоматически экспортируются и сохраняются в файле Excel.

5. Калибровка и анализ микроскопии

1. Засевайте клетки в 35-миллиметровые стеклянные нижние тарелки и трансфектируйте флуоресцентно помеченные белки ms2 и PP7, как описано в разделе 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для калибровочных измерений используйте те же репортерные линии генных клеток, описанные во Введении.
2. Добавьте 0,5 мкг/мл доксициклина в питательную среду клеток за 1 ч до начала получения изображения микроскопии.
3. Установите стеклянную нижнюю чашку внутри инкубационной камеры микроскопа и подготовьте получение изображения, как и раньше (см. Раздел 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оригинальная крышка стеклянной нижней чашки не заменяется для калибровочных экспериментов.
4. Используйте те же настройки интенсивности и экспозиции лазера, которые описаны в пункте 3.1.
5. Установите параметры захвата для временных рядов 2D (снимите флажок 3D на панели «Тип захвата ») и установите 120 точек времени с интервалом 500 мс на панели Timelapse Capture (рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта настройка получения изображения приведет к образованию временных рядов в пределах одной оптической плоскости через очень короткие промежутки времени.
6. Получите десятки калибровочных временных рядов из нескольких позиций для создания наборов данных для подсчета нескольких сотен одиночных транскриптов измерений TFI.
7. Для анализа калибровочных временных рядов преобразуйте файлы в 16-битные файлы формата TIFF соответственно пункту 4.1.
8. Откройте экспортированные файлы с помощью программного обеспечения ^StaQtool21 (рисунок 3). Нажмите кнопку Выбрать файл LOG , выберите Файл журнала соответствующего 2D-временного ряда, полученного, как описано в пункте 4.2.
9. Установите флажок Multiple Spots 2D и нажмите кнопку GO , чтобы загрузить временные ряды в программное обеспечение для анализа.
10. В окне просмотра Timelapse (рисунок 3A) в PSF FWHM поле ввода вставляет значение, рассчитанное для системы микроскопа и объектива, как описано21.
11. Чтобы начать процесс анализа, нажмите кнопку Auto Detect (Автоматическое обнаружение ), чтобы обнаружить все объекты с ограничением дифракции для текущей отображаемой точки времени. Затем нажмите autoFit (AutoFit), чтобы выполнить гауссовскую примерку, чтобы определить значение TFI для каждого объекта (рисунок 3A).
12. Кроме того, можно навести курсор на объект с дифракционным ограничением и щелкнуть, чтобы выделить его (появляется зеленый круг в белом квадрате), а также нажать кнопку Gaussian Fit для ручного выбора и процедуры подгонки Gauss.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последний режим рекомендуется для исключения объектов, которые не учитываются, таких как яркие сайты транскрипции с несколькими зарождающимися транскриптами, присутствующими в одном ядре.
13. Нажмите кнопку Завершить таймлапс , чтобы завершить предыдущий шаг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты автоматически сохраняются в формате файла Microsoft Excel в той же папке, что и файл изображения.
14. Запустите модуль TFI и W Distributions для нескольких точек, нажав соответствующую кнопку (рисунок 3B).
15. Загрузите файлы Excel с помощью кнопки Добавить файл и начните анализ TFI, нажав кнопку Go.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные данные представляют собой среднее значение TFI, определяемое из нескольких измеренных одиночных транскриптов TFI.
16. Начните анализ W, вставив PSF FWHM, ранее использовавшийся в пункте 5.10. и нажмите кнопку Перейти , используя значение по умолчанию для Bin.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметр W является контролем качества для измерений TFI с одним транскриптом для соответствия правильному значению PSF FWHM для используемой системы микроскопа.

6. Слияние данных и калибровки

1. Введите значения TFI временных рядов, полученные из листа Excel, сохраненного в пункте 4.8. в новый лист Excel и разделить каждое значение точки времени на среднее значение TFI для отдельных расшифровок, полученных в пункте 5.15.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для стандартизации этого процесса использовались специально подготовленные шаблонные формы Excel.

Результаты

Клеточные линии, содержащие репортерные гены, описанные на рисунке 1A-C, позволяют изучать динамику транскрипции при одном DSB в живых клетках. Цифры на рисунке 1A-C под каждым графическим репортерным представлением гена указывают на длину в парах килобазов (kbp). ЦМВ указывает на промотор цитомегаловируса, TetO — последовательности тет-оператора, pA выделяет 3'-расщепление и участок полиаденилирования на конце гена. CFP-PTS представляет собой закодированный голубой флуоресцентный белок, слитый с пероксисомальным сигналом нацеливания, а 2UBB - кодируемый человеческий убиквитин B тандем единицы. Следуя протоколу и процедурам анализа, описанным выше, можно получить графики, отображающие количество флуоресцентно меченых репортерных транскриптов генов с течением времени с временным разрешением секунд в течение периодов до часов (рисунок 4A-D). График на рисунке 4A отображает временной ход значений TFI сайта транскрипции гена-репортера PROM, помеченного накоплением молекул MS2-GFP на зарождающихся транскриптах. Этот конкретный граф представляет собой контрольный эксперимент без добавления ТА; поэтому DSB не индуцируется. Транскрипция продолжается с всплескообразными пиками и 2-8 транскриптами за раз в течение всего периода наблюдения в 60 минут. Аналогичные результаты были получены для репортерных генов EX2 и EX2-AS (данные здесь не показаны)⁴. Индукция одного DSB в генах-репортерах (с использованием I-SceI-GR-iRFP) позволяет изучать влияние DSB на текущую репортерную транскрипцию генов и мониторинг событий транскрипции, возникающих с сайта DSB, а именно прерываемой транскрипции (рисунок 4B-D).

Динамика транскрипции, вызванной разрывом ДНК, зависит от расположения DSB в гене
Индукция одного DSB I-SceI-GR-iRFP в репортерном гене с промоторно-проксимальным сайтом распознавания I-SceI приводит к транскрипционному глушению репортерного гена примерно через 11 мин после добавления ТА, и транскрипция не восстанавливается в течение 60-минутного периода наблюдения (рисунок 4B). При наблюдении за транскрипцией гена-репортера EX2 полное подавление канонической транскрипции, управляемой промотором, было обнаружено одновременно полной потерей сигналов MS2-GFP и PP7-RFP примерно через 30 минут после добавления ТА. Однако в течение 10 минут транскрипция возобновляется, о чем свидетельствуют вновь появляющиеся пики флуоресценции PP7-RFP. Полное восстановление сигнала PP7-RFP (а не флуоресценции MS2-GFP) показывает инициацию транскрипции, вызванную разрывом (рисунок 4C). Транскрипция, вызванная разрывом, нестабильна в течение длительных периодов времени; он выглядит как всплеск и низкая пиковая интенсивность, что указывает на то, что только несколько транскриптов, вызванных разрывом, были инициированы с сайта DSB.

Ген-репортер EX2AS, который содержит 24-кратный массив стволовой петли PP7 в экзоне II ниже по течению от сайта I-SceI для обнаружения транскрипции смысла, показывает каноническую транскрипцию, управляемую промотором, заканчивающуюся в репортерном гене EX2AS в течение примерно 25 минут после добавления TA. Затем он заменяется антисмысловой транскрипцией, вызванной разрывом, что проявляется в накоплении связывания белка MS2-GFP с РНК, генерируемой антисмысловыми последовательностями стволовой петли MS2 (рисунок 4D). Антисмысловая транскрипционная активность отсутствовала до прерывания чувственной транскрипции из-за индукции DSB и показывает в этом примере, что несколько транскриптов были инициированы с места разрыва в течение примерно 15 минут. Репрезентативные данные, полученные здесь, показывают, что DSB оказывают различное влияние на транскрипцию в зависимости от их местоположения в гене, как было недавно ^{сообщено4}. Данные также показывают изменчивость от клетки к клетке во времени индукции DSB I-SceI-GR-iRFP, которая колеблется от 12 до 30 мин после добавления ТА. Кроме того, обнаружение отдельных транскриптов позволяет обнаружить различия между клетками и местами разрыва в отношении интенсивности транскрипционной активности, вызванной разрывом. Транскрипция, вызванная разрывом, обнаруживается только в DSB внутри гена. Он отсутствует в промоутер-проксимальных DSB, где каноническая транскрипция прекращается на DSB на оставшийся период наблюдения.

Рисунок 1: Гены-репортеры и система, индуцирующая двухцепочечные разрывы ДНК. Схематическое изображение в (A) - (C) показывает структуру трех генов-репортеров, используемых для изучения транскрипции при индукции двухцепочечного разрыва ДНК. Ген-репортер с промоторно-проксимальным сайтом I-SceI в первом экзоне (PROM), окруженным нисходящим потоком 24-кратным массивом последовательностей MS2 stem-loop (MS2-SL), изображен в (A). Ген-репортер с сайтом I-SceI во втором экзоне (EX2), окруженном вверх по течению с 24-кратной последовательностью стволовой петли MS2 и вниз по течению 24x массивом PP7 stem-loop (PP7-SL), показан в (B). Ген-репортер с сайтом I-SceI , расположенным в экзоне II с антипараллельной вставкой 24x последовательности стволовой петли MS2 перед сайтом I-SceI для обнаружения антисмысловой транскрипции (EX2-AS), показан в (C). Функция конструкции белка слияния I-SceI-GR-iRFP изображена в (D) графическом дисплее и соответствующих изображениях живых клеток ниже. При преходящей экспрессии конструкции (красный цвет) в репортерных линиях генных клеток белок становится исключительно цитоплазматическим, что предотвращает преждевременное расщепление целевого участка эндонуклеазой I-SceI . При добавлении ТА слитый белок начинает мигрировать в ядро клетки (обозначенное пунктирной линией) и начинает накапливаться между 5-15 мин. Scalebar = 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Выбор ячеек для 3D-покадровой визуализации сайтов транскрипции. На фотографии в (A) показана 35-миллиметровая тарелка со стеклянным дном, используемая для визуализации живых клеток, с специально модифицированной крышкой, в которой было просверлено отверстие диаметром 3 мм для добавления ТА, разбавленного в питательной среде напрямую. Расположение отверстия отмечено красным кружком. Панель в (B) показывает снимок экрана окна «Фокус» программного обеспечения управления микроскопом для настройки времени экспозиции в режиме реального времени, настройки фильтра, интенсивности лазера и масштабирования отображения изображения на экране для клеток для последующей покадровой визуализации в (C), снимок экрана соответствующего окна «Захват» для настройки всех настроек для получения 3D-таймлапса живых клеток. Конкретные параметры для панелей Фильтр, Тип захвата, Покадровый захват и 3D-захват описаны в разделе 3. В представлении, показанном здесь, настройки корректируются для получения 3D-таймлапса репортерной генной линии PROM, трансфектированной конструкциями MS2-GFP и I-SceI-GR-iRFP для визуализации транскрипции при индукции двухцепочечного разрыва ДНК в промоторно-проксимальной области репортерного гена. Изображение в (D) объединяется для каналов GFP и iRFP и показывает поле зрения, видимое через систему микроскопа, с несколькими клетками 293-PROM репортерной генной клеточной линии. Клетки были котрансфектированы тандемной димерной конструкцией белка оболочки MS2, слитой с последовательностью ядерной локализации, двумя зелеными флуоресцентными белками (GFP-MS2CP) и конструкцией I-SceI-GR-iRFP. Несколько клеток демонстрируют экспрессию конструкции GFP-MS2CP, тем самым выделяя ядра, а конструкция I-SceI-GR-iRFP выделяет цитоплазму. Пунктирный квадрат указывает на увеличенную область, показанную в (E). Для 3D-покадровой визуализации клетки выбираются в соответствии с требованиями, изложенными в Обсуждении, такими как клетка с более крупным ядром в увеличенной области в (D). Эта клетка трансфектируется обеими флуоресцентными конструкциями и показывает ярко меченый сайт транскрипции (наконечник стрелки) путем накопления GFP-MS2CP на де ново транскрибированных репортерных генах премРНК (левое изображение). Среда роста клеток не содержит ТА; поэтому конструкция I-SceI-GR-iRFP является исключительно цитоплазматической (правое изображение). В (F) стеклянная нижняя тарелка установлена в инкубационной камере ступени микроскопа для экспериментов с 3D-покадровой визуализацией и оснащена специальной крышкой, содержащей загрузочное отверстие TA. Наконечник микропипетки объемом 200 мкл осторожно вставляется в отверстие, чтобы нанести разбавленный ТА на питательную среду клеток. Scalebar = 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Программное обеспечение для сбора и анализа изображений. На панели в (A) показан снимок экрана инструмента отслеживания и количественной оценки STaQTool: Spot. На изображении показан пример временного ряда клеточной линии гена-репортера PROM с меченым участком транскрипции, отмеченным зеленым кругом/белым квадратом на проекционном дисплее максимальной интенсивности в центре. Окна с правой стороны отображают увеличенный вид выбранного пятна сайта транскрипции, соответствующий 3D-затененный участок поверхности интенсивности с 2D-гауссовской сеткой соответствия для текущей точки времени, а также графики положения Z пятна сайта транскрипции в z-стеке, ширины гауссовского соответствия (W) и измерения TFI с течением времени. Микроскопическое изображение в (B) показывает увеличенную одиночную оптическую плоскость ядра репортерной генной клеточной линии PROM, трансфектированной MS2-GFP. Изображение представляет собой одноразовую точку 2D-калибровочного временного ряда со 120 временными точками. Ядро показывает несколько флуоресцентно меченых транскриптов, появляющихся как дифракционные ограниченные объекты в нуклеоплазме (отмеченные белыми квадратами). На правой боковой панели показан снимок экрана инструмента TFI и W Distributions в STaQTool для анализа нескольких пятен в 2D-покадровых приобретениях. В этом примере анализа инструмент обнаружил 408 дифракционных ограниченных пятен, представляющих репортерные транскрипты генов, помеченные MS2-GFP, которые диффундируют в нуклеоплазме. Графики справа отображают гистограммы распределения ширины TFI и Gaussian fit объектов и кривые гаусса. Средние значения TFI и W, полученные из положения центрального пика кривой соответствия Гаусса и рассчитанных доверительных интервалов, отображаются на соответствующей панели. Scalebar = 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Репрезентативные результаты обнаружения транскрипции на участках двухцепочечных разрывов ДНК. Графики в (A) - (D) представляют калиброванную кривую TFI одного сайта транскрипции с течением времени. Значения TFI преобразуются в транскрипты с использованием среднего TFI одиночных транскриптов, измеренных в калибровочных экспериментах для соответствующей конструкции гена-репортера и флуоресцентно помеченного белка, связывающего стволовую петлю РНК MS2 или PP7, используемого в соответствующем эксперименте. В (A) показан график контрольного эксперимента с использованием репортерного гена PROM без добавления TA. Транскрипты, помеченные MS2-GFP, указывают на непрерывную транскрипционную активность в течение всего периода наблюдения. График в (B) представляет репортерный ген PROM при добавлении ТА и индукции DSB, что приводит к подавлению транскрипции в течение оставшегося времени наблюдения. Граф генов-репортеров EX2 в (C) показывает подавление транскрипции канонической транскрипции, управляемой промотором, при добавлении ТА. Позже, в тот же период времени, появляется только транскрипционная активность, обозначенная PP7-RFP. На графике в (D) репортерная транскрипция гена EX2-AS от канонического промотора в смысловом направлении аналогично подавляется при добавлении TA к гену-репортеру EX2 в (C). Однако появление меченых MS2-RFP транскриптов, происходящих из обратно вставленной последовательности стволовой петли MS2, указывает на отсутствие антисмысловой транскрипции во время активности транскрипции чувств до добавления ТА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Репортерная клеточная линия	EX2 и EX2-AS	ПРОМ
Плазмиды для трансфекции	1,5 мкг pI-SceI-GR-iRFP	1,5 мкг pI-SceI-GR-iRFP
	0,65 мкг pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry	0,5 мкг pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP
	0,35 мкг pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP

Таблица 1: Трансфекция репортерных генных клеточных линий. В таблице описаны схемы трансфекции и количества различных плазмид, используемых для транзиторной трансфекции различных репортерных генных клеточных линий.

Обсуждение

Конфликты между основными биологическими процессами, такими как репликация, транскрипция, повреждение ДНК и восстановление ДНК, были идентифицированы как критический источник нестабильности ^{генома22}. Эти исследования также привели к открытию транскрипции на участках повреждения ДНК и придали функциональную роль транскриптам, индуцированным разрывом, в регулировании процессов восстановления повреждений ^ДНК23. Новые инструменты и протокол, описанный здесь, позволяют продолжить исследование динамики транскрипции РНК Pol II на DSB. Критической точкой в этом протоколе является генерация клеточных линий, которые содержат одну копию гена-репортера, интегрированного в геном. Эта ключевая особенность устраняет шум, создаваемый транскрипцией нескольких репортерных генов, интегрированных с несколькими копиями в пределах одного геномного локуса, и позволяет собирать кинетические параметры динамики транскрипции и отдельные транскрипты РНК. Важнейшим техническим требованием для наблюдения за транскрипцией интеграций генов-репортеров является наличие системы микроскопа, которая позволяет обнаруживать одиночные транскрипты РНК, помеченные системой MS2 или PP7 в живых ^{клетках4,12}. Здесь микроскопия живых клеток выполняется на системе Confocal Spinning Disk, установленной на инвертированном микроскопе, оснащенном твердотельными лазерами мощностью 100 мВт, соединенными с акустическо-оптическим перестраиваемым фильтром, как описано в другом ^месте24. Кроме того, чтобы изучить транскрипцию в одном DSB с использованием репортеров, отдельные клетки должны тщательно контролироваться для достижения наивысшего временного разрешения, что требует визуализации клеток в течение нескольких часов, что делает это анализом с низкой пропускной способностью. Тем не менее, мы наблюдаем несколько клеток параллельно с позиционированием, контролируемым ступенью пьезоуправляемого микроскопа. Для обеспечения оптимальных условий окружающей среды для наблюдения за живыми клетками в течение нескольких часов корпус микроскопа, включая стадию образца, помещают внутрь камеры окружающей среды из плексигласа. Кроме того, на ступени микроскопа установлена инкубационная камера с закрытой стадией и подключена к контроллерам подачи _CO2 и влажности.

Первым критическим шагом в протоколе является выбор областей, представляющих интерес, с клетками для визуализации. Каждое положение XY, отмеченное для визуализации, должно содержать одну или несколько клеток, демонстрирующих трансфекцию флуоресцентных белков, связывающих стволовую петлю РНК в соответствии с репортерным геном и схемой трансфекции, описанной в разделе 1, таблица 1, а также на рисунке 2D, E. Кроме того, клетки должны иметь ярко меченые участки транскрипции, которые должны быть котрансфицированы конструкцией I-SceI-GR-iRFP713, и белок должен быть локализован первоначально в цитоплазме (рисунок 2D и E).

Клетки должны показывать уровень интенсивности флуоресценции несвязанного флуоресцентно помеченного белка MS2 и/или PP7, достаточно низкий, чтобы обнаружить одиночные меченые транскрипты на уровне фоновой флуоресценции. В то же время, устойчивый уровень интенсивности флуоресценции флуоресцентно помеченных белков покрытия MS2 и / или PP7 необходим, чтобы обеспечить визуализацию в течение не менее 60 минут без потери слишком большой флуоресценции из-за некоторого отбеливания, которое происходит. «Масштабный дисплей изображения» с фиксированным диапазоном, как описано в разделе 3.7, используется для стандартизированного выбора ячеек в соответствии с их уровнем интенсивности флуоресценции.

Вторым критическим этапом протокола является добавление TA в ячейки в заранее определенных положениях XY через небольшое отверстие в крышке стеклянной нижней чашки. Любые манипуляции со стеклянной нижней тарелкой приведут к смещению клеток от отмеченного положения XY и их следует избегать. Поэтому тщательное обращение с микропипеткой при добавлении ТА, разбавленной в клеточной среде роста, имеет жизненно важное значение для успешного наблюдения за предварительно отобранными клетками, как показано на рисунке 2F. Адаптация различных систем для добавления лекарств в клетки, установленные на стадии микроскопа, таких как перфузионная система, потребует отдельной инкубационной камеры с входными и выходными отверстиями для трубок и насосной или инъекционной системы для введения лекарств. Другие методы, такие как слайды каналов с покрытыми нижними поверхностями, приводят к медленной диффузии вводимых лекарств в канал и вызывают дополнительную задержку между добавлением и эффектом лекарственного средства. Наконец, неосторожное пипетирование в отверстие скольжения канала также может сместить положение образца. Таким образом, настоящая система с специально просверленным отверстием в крышке тарелки со стеклянным дном проста в адаптации, имеет низкую стоимость и подходит для введения различных питательных сред, лекарств и компонентов. Малый диаметр отверстия и увлажненная атмосфера в инкубационной камере стадии также предотвращает высыхание клеточной среды.

Третьим критическим шагом в этом протоколе является анализ данных, который требует ручной проверки временных точек, когда транскрипция прекращается из-за индукции DSB. Временная точка прекращения транскрипции указывается высвобождением последних транскриптов с ранее ярко обозначенного участка транскрипции репортерного гена. Аналогичным образом, события инициации транскрипции, вызванной разрывом, должны быть тщательно проверены для обнаружения отдельных событий транскрипции с относительно низким отношением сигнал/шум одиночных флуоресцентно меченых мРНК.

Динамика восстановления индуцированного DSB добавляет дополнительный уровень сложности к анализу данных, генерируемых с помощью этих репортеров, ограничивая их первыми минутами сразу после индукции DSB. Трансгенная природа репортерных генов и богатая повторяемостью природа стержневых матриц MS2 и PP7 могут собрать уникальный ландшафт хроматина, мешая созданию предполагаемых стабильных программ транскрипции, вызванных разрывом. Тем не менее, по сравнению с ионизирующим или УФ-облучением, Опосредованная I-SceI индукция DSB в репортерных генах является гораздо более надежной системой для исследования транскрипции в отдельных DSB.

Различные эндонуклеазные системы, такие как I-CreI, I-PpoI или AsiSI , которые имеют или не имеют дополнительные сайты распознавания в геноме человека, могут быть объединены с существующими репортерными генными системами для возможной более высокой эффективности генерации DSB. Тем не менее, они требуют сначала введения сайта распознавания эндонуклеазы в гены-репортеры. Во-вторых, они могут иметь аналогичную изменчивость по срокам и эффективности индукции DSB в отдельных клетках. С другой стороны, вставка тандемных копий сайтов распознавания эндонуклеазы может повысить эффективность индукции DSB. Кроме того, тестирование представленных репортерных генных систем в разных клеточных линиях позволит сравнить динамику транскрипции на участках DSB между различными клеточными фонами и наличие различных путей восстановления повреждений ДНК, таких как раковые клетки, первичные клетки и дифференцированные нециклические клетки. Однако построение генов-репортеров, совместимых с системой Flp/FRT, в настоящее время ограничивает интеграцию в доступные клеточные линии хозяина Flp/FRT.

В дополнение к приложениям, основанным на микроскопии, текущие гены-репортеры также могут быть объединены с биохимическими анализами, такими как иммунопреципитация хроматина, для изучения набора факторов репарации ДНК или транскрипции в один DSB или для оценки занятости нуклеосом, модификаций гистонов и состояния хроматина вокруг сайта DSB. Кроме того, комбинация с различными репортерными системами позволит изучать функциональные связи между повреждением ДНК и такими процессами, как организация генома или репликация ДНК.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mW solid-state Lasers	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system	Intelligent Imaging Innovations Inc.
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512	Photometrics, Tucson, AZ USA
Axio Observer Z1 inverted microscope	Carl Zeiss MicroImaging, Germany
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-1
charcoal-stripped fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F6765-500 ML
CO2 module S	PeCon GmbH, Erbach, Germany
CSU-X1 confocal spinning disk unit	Yokogawa Electric, Tokyo, Japan
DMEM	Gibco	41966029
DMEM with Hepes no PhenolRed	Gibco	21063-029
Doxicyclin	Sigma-Aldrich	D9891	for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium
FBS	Gibco	10270106
Flp-In T-REx 293 cell line	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	R75007
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence	GeneArt, Thermo Fischer Scientific		custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences
Heating Device Humidity 2000	PeCon GmbH, Erbach, Germany
Hygromycin B	Roche	10843555001
Immersion oil Immersol 518 F	Carl Zeiss MicroImaging Inc.)	444960-0000-000
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001	transfection helper reagent
Lipofectamine 3000 reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001	lipid-based transfection reagent
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-10-C
microscope incubation chamber	PeCon GmbH, Erbach, Germany
pcDNA5/FRT/TO	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	V652020
pOG44 plasmid	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	V600520
SlideBook 6.0 Software	Intelligent Imaging Innovations Inc.
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000	PeCon GmbH, Erbach, Germany
StaQtool Software	iMM-JLA Lisbon, Portugal		available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip
triamcinolone acetonide (TA)	Sigma-Aldrich	T6501	synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus
Trypsin/EDTA Solution (TE)	Thermo Fisher Scientific	R001100