Imagem de células vivas da atividade transcricional no DNA Double-Strand Breaks

Resumo

Este protocolo apresenta um novo sistema genético repórter e a configuração experimental para detectar transcrição em quebras de dupla cadeia de DNA com sensibilidade de molécula única.

Resumo

As quebras de dois fios de DNA (DSB) são o tipo mais grave de dano de DNA. Apesar das consequências catastróficas sobre a integridade do genoma, permanece até agora evasivo como os DSBs afetam a transcrição. Uma razão para isso foi a falta de ferramentas adequadas para monitorar simultaneamente a transcrição e a indução de um DSB gênico com resolução temporal e espacial suficiente. Este trabalho descreve um conjunto de novos repórteres que visualizam diretamente a transcrição em células vivas imediatamente após a indução de um DSB no modelo de DNA. Os loops-tronco bacteriophage RNA são empregados para monitorar a transcrição com sensibilidade de molécula única. Para direcionar o DSB para uma região genética específica, os genes repórteres são projetados para conter uma única sequência de reconhecimento do endonuclease I-SceI homing, caso contrário ausente do genoma humano. Uma única cópia de cada gene repórter foi integrada ao genoma das linhas celulares humanas. Este sistema experimental permite a detecção de moléculas de RNA únicas geradas pela transcrição genética canônica ou pela iniciação de transcrição induzida por dna. Esses repórteres oferecem uma oportunidade sem precedentes para interpretar as interações recíprocas entre transcrição e dano de DNA e divulgar aspectos até então não apreciados da transcrição induzida por quebra de DNA.

Introdução

As quebras de dupla-vertente de DNA (DSBs) são lesões tóxicas de DNA que interrompem a função celular e contribuem para a insurgência de várias doenças e ^{envelhecimento1}. Mutações resultantes do reparo impreciso dos DSBs impactam a expressão genética e definem a base para o declínio funcional da célula. A visão emergente de que os DSBs conduzem de nova transcrição induzida por arrombamento no local da lesão2,3,4,5,6,7 sugere que os DSBs também podem afetar a função celular através de RNAs induzidas por ruptura. Vários estudos recentes indicam que os DSBs são suficientes para iniciar transcrição programada (por exemplo, em genes indutíveis por estímulo) e não programada (por exemplo, em promotores não canônicos) transcrição4,5,7. No entanto, apesar de vários estudos explorando as ligações entre danos no DNA e transcrição, o campo ainda defasado em sua capacidade de entregar uma caracterização precisa (ou seja, única molécula) dos eventos transcricionais em locais de quebra de DNA. Uma razão importante para isso foi a falta de ferramentas experimentais adequadas. A irradiação celular (γ-raios, raios-X, íons pesados) e tratamentos medicamentosos (por exemplo, inibidores de topoisomerase ou agentes intercalantes) carecem de precisão espacial e induzem lesões de DNA além de DSBs, incluindo quebras de fios únicos e adutos de ^DNA8. Endonucleases, como I-PpoI e AsiSI, geram DSBs específicos do lócus, mas não foram combinados com um sistema que permite visualização simultânea de células vivas de transcrição em um único lócus com alta precisão ^temporal8. Para contornar essa limitação, nosso laboratório liderou o desenvolvimento de um conjunto de repórteres de ponta que visualizam diretamente a transcrição com resolução de molécula única após a indução controlada de um ^DSB4 único. Aqui, descrevemos esses repórteres, fornecemos um protocolo detalhado para imagens de células ao vivo de transcrição em DSBs e mostramos dados revelando iniciação de transcrição em um único DSB.

Os sistemas genéticos repórteres usados neste protocolo são baseados no bem caracterizado gene repórter IgM do mouse e contêm os exons M1 e M2 da forma ligada à membrana (μm) do IgM μ cadeia pesada9,10,11. Um intron híbrido separa os dois exons com o forte adenovírus grande transcrição tardia (AdML) PY ^tract12. A expressão dos genes repórteres é controlada pelo promotor de citomegalovírus humano (CMV), no qual duas cópias tandem da sequência do operador Tet (TetO) foram inseridas. Os genes do repórter são inseridos em um vetor plasmídeo contendo um local de Alvo de Recombinação de Flp (FRT) e inseridos em um local específico de destino FRT no genoma de uma linha de células hospedeiras HEK293. Esta linha celular também expressa constitutivamente a proteína repressora Tet para regular a expressão do gene repórter através da presença ou ausência de tetraciclina/doxiciclina. Para permitir a visualização da transcrição do gene repórter, 24 repetições tandem da sequência do loop de haste MS2 e 24 repetições tandem da sequência de loop de haste PP7 foram inseridas em diferentes posições em relação ao local de início da transcrição e estrutura exon/intron do gene repórter. Os loops de haste MS2/PP7 se formam após a transcrição e são especificamente vinculados por proteínas de casaco MS2/PP7 expressas em êxtase marcadas com proteínas fluorescentes verdes e vermelhas, uma estratégia amplamente utilizada antes para transcrição ^{de imagem13,14,15}. Além disso, uma única cópia da sequência de reconhecimento de 18 bps foi inserida para o endonuclease i-SceI homing que é diretamente ladeado pelas matrizes de sequência de loop-tronco RNA nos genes do repórter. Técnicas padrão de clonagem foram usadas para gerar todos os plasmídeos, o fragmento contendo o loop-tronco I-SceI-24xMS2 do gene prop reporter foi sintetizado por um serviço de sintetização de genes comerciais.

O gene de repórter DSB (PROP) promotor-proximal foi construído inserindo o site de corte I-SceI 45 pares de base (bp) a jusante do local inicial de transcrição putativa em exon I, seguido por 149 bp até o início do de loop de haste 24x MS2, que foi projetado de novo com duas sequências alternadas não idênticas de tronco-loop16 e cinco sequências espaciais não repetitivas de 20 bp para reduzir a redundância. A matriz de loop-tronco MS2 é seguida por 72 bp até o início do intron de 1844 bp e o exon II de 1085 bp até o local de decote e poliadenilização. O exon II codifica uma proteína fluorescente ciano (CFP) fundida a uma sequência de alvo peroxisomal terminal C (PTS) do acicl humano Acyl CoA oxidase para permitir uma triagem independente da expressão genética repórter (Figura 1A).

O gene repórter exon II DSB (EX2) consiste em um exon de 167 bp I seguido pelo intron e exon II codificando o CFP-PTS. Mais a jusante a uma distância de 169 bp, um contendo alças-tronco MS2 24x foi inserido, seguido por uma sequência de linker de 84 bp com um site I-SceI no centro, seguido por alças-tronco 24x PP7 e 221 bp até o local de decote e poliadenilização17 (Figura 1B).

Por fim, o gene repórter exon II DSB com rotulagem de transcrição antissense (EX2AS) é baseado na transcrição genética ubiquitina humana UBB-201 e contém dois exons e um intron. O exon I tem um comprimento total de 1534 bp com uma inserção inversa da sequência de loop-tronco MS2 24x. Portanto, a sequência de RNA de loop-tronco MS2 correta será transcrita em uma direção antissamerada no que diz respeito à transcrição do sentido do gene repórter do promotor do CMV. O intron tem um comprimento de 490 bp, seguido por exon II com o site I-SceI , e uma região de codificação foi inserida para duas subunidades de ubiquitina no quadro. A jusante do gene UBB é uma sequência que forma um loop de haste 24x PP7 após a transcrição do gene repórter em uma direção de sentido (Figura 1C).

A transfecção transitória de uma construção indutível do endonuclease homing I-SceI permite a criação controlada de um DSB no local de reconhecimento inserido dentro de cada gene ^repórter18. A endonuclease I-SceI é fundida em quadro com o domínio de ligação de ligantes do receptor glicocorticoide e uma proteína fluorescente vermelha e iRFP713. Esta construção é citoplasmática na ausência de acetonida triamcinolone (TA), mas migra rapidamente para o núcleo após a adição de TA ao meio de crescimento das células (Figura 1D). A indução de DSBs pelo sistema I-SceI é robusta, como demonstrado antes ^{de 18,19,20}. A transcrição genética do repórter pode ser monitorada em paralelo visualizando os sistemas de loop-tronco RNA fluorescentemente marcados MS2 e PP7.

Protocolo

1. Preparação e transfecção de células para microscopia de células vivas

1. Prepare um frasco de cultura celular de ^{25 cm2} da linha celular repórter (EX2, EX2-AS ou PROM) com 5 mL de DMEM para alcançar 80-90% de confluência no dia anterior ao experimento de microscopia de células vivas.
2. Aspire o meio com uma pipeta do frasco de cultura celular de ^{25 cm2} e lave as células com 2,5 mL de 1x PBS.
3. Adicione 1 mL de trippsina-EDTA (0,05%) e incubar a 37 °C por 2-3 min para descolamento celular.
4. Após o descolamento celular, adicione 4 mL de DMEM sem vermelho fenol contendo tampão HEPES, complementado com 10% (v/v) soro bovino fetal despojado de carvão, e levemente resuspenque as células.
5. Placa 1 mL da solução celular em um prato redondo de 35 mm com poço de fundo de vidro de 10 mm (diâmetro nº 1,5) e homogeneizar. Armazene o prato redondo de 35 mm dentro de um prato de cultura celular padrão de 100 mm e incuba-o a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de _CO2.
6. ~6 h após a semeadura, transfem as células no prato de fundo de vidro. Para cada mistura de transfecção, prepare duas soluções da seguinte maneira:
   1. Em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL, prepare a solução A contendo 150 μL de meio essencial mínimo de soro reduzido (MEM), DNA plasmídeo (como descrito na Tabela 1) e 2,5 μg/μL de DNA de reagente auxiliar de transfeção (ver Tabela de Materiais).
   2. Em paralelo, prepare a solução B, contendo 150 μL de MEM de soro reduzido e 1,5 μg/μL de DNA de um reagente de transfecção à base de lipídio (ver Tabela de Materiais).
   3. Incubar ambas as soluções à temperatura ambiente (RT) por 5 minutos. Em seguida, adicione suavemente a solução A à solução B e incubar 20 min na RT.
   4. Para transfetar as células, adicione 300 μL de solução A+B dropwise a cada prato e distribua suavemente. Armazene o prato de fundo de vidro dentro de um prato de cultura celular padrão de 100 mm e incuba-o a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de _CO2.
7. Prepare um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 200 μL de DMEM com HEPES, sem vermelho fenol suplementado com 10% (v/v) soro bovino fetal despojado de carvão e adicione TA a uma concentração de 7,5 x ^10-7 M.

2. Configuração experimental

1. Coloque a temperatura da grande câmara de incubação de microscópio plexiglass e a câmara de incubação do estágio superior para 37 °C na unidade de controle comum. Coloque as condições ambientais dentro da câmara de incubação do palco para 5% de _CO2 e 100% de umidade.
   NOTA: A gaiola do microscópio e a temperatura da incubadora de estágio devem ser configuradas pelo menos 1h antes de iniciar o experimento para permitir o aquecimento do sistema completo para minimizar as flutuações de temperatura. Inicie todas as outras unidades de controle de microscópio e operação ao mesmo tempo.
2. Induzir a transcrição dos genes repórteres adicionando doxiciclina (0,5 μg/mL) ao meio de crescimento e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo com uma micropipette de 200 μL ~1 h antes de iniciar a observação da microscopia.
   NOTA: Mantenha o prato de fundo de vidro com as células transfeinadas está dentro de um prato de cultura celular padrão de 100 mm para fácil manuseio e transporte da cultura celular para a sala de microscópio em um recipiente de isopor para manter a temperatura o mais estável possível.
3. Transporte as células para o microscópio pelo menos 30 minutos antes de iniciar a observação e, ao chegar, coloque a antena de 100 mm com as células imediatamente dentro da câmara de incubação de microscópios grandes pré-aquecidas.
4. Coloque o tubo de microcentrifutura com o TA pré-diluído a partir do passo 1.7. dentro da grande câmara ambiental do microscópio para aquecer até 37 °C.
5. Substitua a tampa da tampa inferior do vidro semelhante à preparada antes por um orifício de 3 mm de diâmetro perfurado na tampa (Figura 2A).
   NOTA: O TA será adicionado posteriormente às células através do pequeno orifício na tampa sem manipular o prato montado no estágio do microscópio.
6. Selecione o objetivo de imersão de óleo 100x (objetivo apoquiático, 1,4 abertura numérica) no painel de controle do microscópio. Aplique uma gota de óleo de imersão ao objetivo.
   1. Coloque o prato de fundo de vidro com as células dentro da câmara de incubação do estágio do microscópio e bloqueie-o no lugar. Feche a tampa da incubadora de palco e todas as portas da carcaça do microscópio.
7. Inicie o software de operação e controle do microscópio, abra a janela Controle de Foco (Figura 2B), clique no painel escopo e, no painel de seleção de emissões , clique na caixa 100% olho para definir o caminho do feixe ocular para observação direta da amostra por olho.
   1. No menu Filter Set , mude para o conjunto do filtro Eye e clique em Brightfield e pressione o botão Open Brightfield .
8. Mova o objetivo do microscópio em direção ao prato de fundo de vidro até que o óleo toque o vidro. Em seguida, olhe através dos oculares e se concentre manualmente no plano das células. Desligue o botão Open Brightfield .
9. Deixe as células por 30 minutos antes de iniciar as observações experimentais para se adaptar às condições ambientais e evitar a deriva focal durante a imagem por gradientes de temperatura.
10. Coloque uma micropipette de 200 μL e 200 dicas de filtro μL prontas para usar de lado à temperatura ambiente.

3. Aquisição de imagens

1. Na janela Controle de Foco do software de controle de microscópio, defina a intensidade do laser para 5% e digite um valor de 50 ms para o tempo de exposição (Figura 2B).
2. Abra a janela Capturar para ajustar as configurações para realizar uma aquisição automatizada de imagens de lapsos de tempo tridimensionais (3D) (Figura 2C).
3. Selecione o tipo de aquisição de captura 3D e defina de 12 a 16 fatias ópticas separadas por 0,4 μm, marque as caixas de seleção de Range em torno da corrente e retorne à posição atual após a captura.
4. No painel de captura timelapse , digite um valor de 120 para o #de pontos de tempo e 30 s para o intervalo.
5. Selecione o conjunto de filtro confocal de acordo com os rótulos de proteína fluorescente transfectada com λ = 488 nm para GFP, λ = 561 nm para TagRFPt e λ = 640 nm para iRFP713 e defina o tempo de exposição para cada canal para 50 ms.
6. Use a corrente de configuração para a potência laser para usar o valor de 5% selecionado na janela de foco (Figura 2C).
7. Na janela Controle de foco , vá para o painel da câmera , selecione o controle de exibição de imagem Escala e escolha o botão Manual para configurar uma faixa fixa de intensidades de imagem a serem exibidas. Digite valores para Baixo: 500 e Alto: 5000 (ver Figura 2B).
   NOTA: Esta configuração limita o alcance dinâmico da captura da câmera exibida na visualização ao vivo para selecionar células dentro da mesma faixa de intensidades de fluorescência (Figura 2D).
8. Selecione as células para a imagem de lapso de tempo 3D dos locais de transcrição após a indução de um DSB. Trie as células e selecione três campos de visão de acordo com as condições descritas na Discussão.
9. Concentre cada célula selecionada previamente localizada no centro do campo de visão com o local de transcrição no plano médio da pilha Z.
   NOTA: Centralizar a célula e o local de transcrição em XYZ acomoda algum movimento da célula.
10. Marque cada posição XYZ no painel XY da janela Controle de Foco clicando em Set Point.
    NOTA: Re-visite as posições selecionadas 2-3 vezes ao longo dos 5 minutos seguintes para confirmar a transcrição contínua dos genes do repórter e estabilidade posicional relativa das posições das células nas dimensões XYZ.
11. Adicione 200 μL do TA pré-diluído da etapa 1.7. para as células como mostrado na Figura 2F.
    NOTA: Tome muito cuidado para não tocar no prato de fundo de vidro ou na tampa enquanto adiciona o TA para evitar qualquer mudança das posições XY marcadas. Após a indução do DSB, confirme se as células estão centradas no campo de visão, e o local de transcrição está no plano Z central. O refoque e a atualização de posição não devem levar mais de 1-2 minutos.
12. Inicie a imagem da série de tempo 3D clicando em Iniciar na janela Capturar .
13. Salve os dados de imagem no formato de dados do software de controle de microscópio no disco rígido do computador de controle de microscópio.

4. Análise de dados

1. Abra os dados de imagem no software de controle de microscópio e exporte como arquivos em formato TIFF de 16 bits.
2. Abra os arquivos exportados com o software ^StaQtool21 . Selecione o modo 3D single spot e carregue os arquivos de imagem pressionando Go.
   NOTA: A série de tempo selecionada é aberta no Visualizador de Timelapse de Projeção Máxima, mostrando uma projeção de intensidade máxima da pilha z do primeiro ponto de tempo (Figura 3A).
3. Ajuste o display de intensidade da imagem com o controle deslizante MAX vertical no lado esquerdo.
4. Selecione o ponto de tempo para analisar com o controle deslizante horizontal do ponto de tempo .
5. Passe o cursor até a posição do local de transcrição rotulado para marcar manualmente ou usar a função de detecção automática e pressione no respectivo local de transcrição se vários objetos forem detectados.
6. Use a função Auto Track para determinar as posições XYZ do site de transcrição ao longo do tempo.
   NOTA: Se uma determinada posição não for rastreada corretamente, selecione o site de transcrição manualmente de acordo com o manual do software StaQtool.
7. Pressione o botão Auto para executar o encaixe gauss para cada ponto de tempo e meça a intensidade total de fluorescência (TFI).
   NOTA: Se a atividade transcricional cessar, a ferramenta de rastreamento permanece na última posição onde um objeto limitado à difusão (um local de transcrição rotulado) foi detectado. Se a célula se mover na direção XY após o rótulo do site de transcrição desaparecer, um reposicionamento manual do quadrado de pesquisa será necessário.
8. Depois de terminar o ajuste de valor TFI para cada ponto de tempo, pressione o botão End timelapse para fechar o arquivo de imagem da série de tempo atual e continuar para o próximo arquivo.
   NOTA: Os valores TFI são exportados automaticamente e salvos em um arquivo Excel.

5. Medições e análises de calibração de microscopia

1. Células de sementes em pratos de fundo de vidro de 35 mm e transfectam com as proteínas de revestimento MS2 e PP7 fluorescentes, conforme descrito na Seção 1.
   NOTA: Para as medidas de calibração, use as mesmas linhas de células genéticas de repórter descritas na Introdução.
2. Adicione 0,5 μg/mL de doxiciclina ao meio de crescimento das células 1h antes de iniciar a aquisição de imagens de microscopia.
3. Monte a placa de fundo de vidro dentro da câmara de incubação do estágio do microscópio e prepare a aquisição da imagem como antes (ver Seção 2).
   NOTA: A tampa original do prato de fundo de vidro não é substituída para os experimentos de calibração.
4. Use as mesmas configurações de intensidade e exposição do laser descritas no ponto 3.1.
5. Defina as configurações de captura para séries temporais 2D (desmarque a opção 3D no painel Tipo captura ) e defina 120 pontos de tempo em intervalos de 500 ms no painel Timelapse Capture (Figura 2C).
   NOTA: Esta configuração de aquisição de imagem resultará em séries temporentais dentro de um único plano óptico em intervalos muito curtos.
6. Adquira dezenas de séries temporais de calibração de várias posições para gerar conjuntos de dados para contar várias centenas de medições TFI de transcrições únicas.
7. Para a análise da série de tempo de calibração, converta os arquivos em arquivos em formato TIFF de 16 bits de acordo com o ponto 4.1.
8. Abra os arquivos exportados com o software StaQtool21 (Figura 3). Pressione o botão de arquivo Select LOG, escolha o Arquivo Log da respectiva série de tempo 2D adquirida conforme descrito no ponto 4.2.
9. Selecione a caixa de seleção 2D de várias manchas e pressione o botão GO para carregar a série de tempo no software de análise.
10. Na janela de visualização Timelapse (Figura 3A), no PSF FWHM, o campo de entrada insere o valor calculado para o sistema de microscópio e objetivo como ^descrito21.
11. Para iniciar o processo de análise, pressione o botão Detectar automaticamente para detectar todos os objetos limitados à difração para o ponto de tempo atual exibido. Em seguida, clique em AutoFit para executar o Encaixe gaussiano para determinar o valor de TFI para cada objeto (Figura 3A).
12. Alternativamente, aponte o cursor sobre um objeto limitado à difração e clique para selecioná-lo (o círculo verde dentro de um quadrado branco aparece) e pressione o botão Gaussian Fit para a seleção manual e o procedimento de montagem de Gauss.
    NOTA: Recomenda-se que o último modo exclua objetos não contados, como sites de transcrição brilhantes com várias transcrições nascentes presentes no mesmo núcleo.
13. Pressione o botão End timelapse para terminar a etapa anterior.
    NOTA: Os resultados são salvos automaticamente em um formato de arquivo Microsoft Excel na mesma pasta do arquivo de imagem.
14. Inicie o módulo TFI e W Distributions para vários pontos pressionando o respectivo botão (Figura 3B).
15. Carregue os arquivos do Excel através do botão Adicionar arquivo e inicie a análise TFI pressionando o botão Go.
    NOTA: A saída é o valor TFI médio determinado a partir de múltiplas transcrições únicas medidas TFIs.
16. Inicie a análise W inserindo o PSF FWHM anteriormente utilizado no ponto 5.10. e pressione o botão Ir usando o valor padrão da Lixeira.
    NOTA: O parâmetro W é o controle de qualidade das medições TFI de transcrição única para cumprir o valor FWHM correto para o sistema de microscópio utilizado.

6. Fusão de dados e calibração

1. Digite os valores TFI da série temporal obtidos na folha excel salvos no ponto 4.8. em uma nova folha do Excel e divida cada valor de ponto de tempo pela FI média para transcrições únicas obtidas no ponto 5.15.
   NOTA: Para padronizar esse processo, foram utilizados formulários de modelo Excel preparados sob medida.

Resultados

As linhas celulares que abrigam os genes de repórteres descritos na Figura 1A-C permitem o estudo da dinâmica de transcrição em um único DSB em células vivas. Os números na Figura 1A-C abaixo de cada representação genética de repórter gráfico indicam o comprimento em pares de quilobase (kbp). CMV indica que o promotor de citomegalovírus, TetO é as sequências de operador de Tet, pA destaca o decote de 3' e o local de poli-adenylation na extremidade genética. CFP-PTS é a proteína fluorescente de ciano codificada fundida a um sinal de alvo peroxisomal, e 2UBB é a unidade de tandem ubiquitina humana codificada. Seguindo os procedimentos de protocolo e análise descritos acima, é possível obter gráficos exibindo o número de transcrições genéticas de repórter fluorescentes rotuladas ao longo do tempo, com uma resolução temporal de segundos durante períodos de até horas (Figura 4A-D). O gráfico na Figura 4A exibe o curso de tempo dos valores de TFI de um site de transcrição genética de repórter PROM rotulado pelo acúmulo de moléculas MS2-GFP em transcrições nascentes. Este gráfico em particular representa um experimento de controle sem adição de TA; portanto, nenhum DSB é induzido. A transcrição continua com picos de explosão e 2-8 transcrições de cada vez durante todo o período de observação de 60 min. Resultados semelhantes foram obtidos para os genes de repórter EX2 e EX2-AS (dados não mostrados aqui)⁴. A indução de um único DSBs nos genes repórteres (usando I-SceI-GR-iRFP) permite estudar o impacto do DSB na transcrição genética do repórter em curso e o monitoramento de eventos de transcrição emergindo do site DSB, ou seja, transcrição induzida por quebra (Figura 4B-D).

A dinâmica da transcrição induzida por quebra de DNA depende da localização do DSB dentro do gene
A indução de um único DSB por I-SceI-GR-iRFP no gene repórter com um site de reconhecimento I-SceI promotor-proximal leva ao silenciamento transcricional do gene repórter após cerca de 11 minutos após a adição de TA, e a transcrição não é restaurada dentro do período de observação de 60 minutos (Figura 4B). Ao observar a transcrição do gene do repórter EX2, a supressão completa da transcrição cônica orientada pelo promotor foi detectada por uma perda simultaneamente completa de sinais MS2-GFP e PP7-RFP em torno de 30 minutos após a adição de TA. No entanto, dentro de 10 minutos, a transcrição reinicia, como revelado por picos reaparecendo de fluorescência PP7-RFP. A recuperação completa do sinal PP7-RFP (e não da fluorescência MS2-GFP) mostra iniciação de transcrição induzida por ruptura (Figura 4C). A transcrição induzida por invasão não é estável por longos períodos; parece explosão e baixa intensidade de pico, indicando que apenas algumas transcrições induzidas por invasão foram iniciadas a partir do site DSB.

O gene repórter EX2AS, que contém uma matriz de loop-tronco 24x PP7 em exon II a jusante do site I-SceI para detectar a transcrição do sentido, mostra a transcrição cônica impulsionada pelo promotor terminando dentro do gene repórter EX2AS dentro de aproximadamente 25 minutos após a adição de TA. É então substituído por transcrição induzida por ruptura antissense, como revelado pelo acúmulo de proteína MS2-GFP vinculante ao RNA gerado a partir de sequências antissenses MS2 stem-loop (Figura 4D). A atividade transcricional antissentida estava ausente antes da interrupção da transcrição do sentido devido à indução do DSB e mostra neste exemplo que várias transcrições foram iniciadas a partir do local de ruptura em cerca de 15 minutos. Os dados representativos obtidos aqui mostram que os DSBs têm efeitos diferentes na transcrição, dependendo de sua localização dentro do gene, como foi relatado ^{recentemente4}. Os dados também revelam uma variabilidade celular para célula no tempo da indução DSB por I-SceI-GR-iRFP, que varia de 12 a 30 minutos após a adição de TA. Além disso, a detecção de transcrições individuais permite a descoberta de células para células e diferenças de local para a intensidade da atividade transcricional induzida pela invasão. A transcrição induzida por invasão só é detectada em DSBs dentro do gene. Está ausente nos DSBs promotor-proximal, onde a transcrição canônica cessa sobre um DSB durante o período de observação restante.

Figura 1: Genes repórteres e o sistema para induzir quebras de dna de dois fios. A representação esquemática em (A) para (C) mostra a estrutura dos três genes repórteres usados para estudar a transcrição após a indução de uma quebra de duplo fio de DNA. O gene repórter com o site promotor-proximal I-SceI no primeiro exon (PROM) flanqueado rio abaixo por uma matriz de sequência de 24x MS2 -SL é retratado em (A). O gene repórter com o site I-SceI no segundo exon (EX2) flanqueado rio acima com uma sequência de loop-tronco MS2 24x e rio abaixo por uma matriz de loop-tronco PP7 (PP7-SL) 24x é mostrado em (B). O gene repórter com o site I-SceI localizado no exon II com uma inserção anti-paralelo da sequência de loop-tronco MS2 24x a montante do site I-SceI para detectar transcrição antisentamada (EX2-AS) é mostrado em (C). A função da construção da proteína de fusão I-SceI-GR-iRFP é retratada em (D) por uma tela gráfica e imagens correspondentes de células vivas abaixo. Após a expressão transitória da construção (cor vermelha) nas linhas celulares do gene repórter, a proteína é exclusivamente citoplasmática, o que impede um decote prematuro do local alvo pela endonuclease I-SceI . Após a adição de TA, a proteína de fusão começa a migrar para o núcleo celular (indicado por uma linha tracejada) e começa a se acumular entre 5-15 min. Scalebar = 10 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Selecionando células para imagens de lapso de tempo 3D de locais de transcrição. A foto em (A) mostra um prato de fundo de vidro de 35 mm usado para a imagem de célula viva, com uma tampa modificada personalizada, na qual um orifício de 3 mm de diâmetro foi perfurado para adicionar o TA diluído em meio de crescimento diretamente. A localização do buraco está marcada com um círculo vermelho. O painel em (B) mostra uma captura de tela da janela "Focus" do software de controle de microscópio para configurar o tempo de exposição ao vivo, a configuração do filtro, a intensidade do laser e a exibição de imagem em escala para tela para células para imagens subsequentes de lapso de tempo (C), a captura de tela da janela correspondente "Capture" para ajustar todas as configurações para a aquisição de lapso de tempo 3D das células vivas. As configurações específicas para os painéis Filter, Capture Type, Time-Lapse Capture e 3D Capture estão descritas na seção 3. Na visão aqui mostrada, as configurações são ajustadas para adquirir um lapso de tempo 3D da linha genética do repórter PROM transfeinada com as construções MS2-GFP e I-SceI-GR-iRFP para transcrição de imagens após a indução de uma quebra de duplo fio de DNA na região promotor-proximal do gene repórter. A imagem em (D) é mesclada para os canais GFP e iRFP e mostra um campo de visão visto através do sistema de microscópio, com várias células da linha de células genéticas de repórter 293-PROM. As células foram co-transfeinadas com a proteína tandem dimer ms2 coat construída fundida a uma sequência de localização nuclear, duas proteínas fluorescentes verdes (GFP-MS2CP), e a construção I-SceI-GR-iRFP. Várias células mostram expressão do construto GFP-MS2CP, destacando assim os núcleos e a construção I-SceI-GR-iRFP destacando o citoplasma. O quadrado tracejado indica a região ampliada mostrada em (E). Para a imagem de lapso de tempo 3D, as células são selecionadas de acordo com os requisitos conferidos na Discussão, como a célula com o núcleo maior na região ampliada em (D). Esta célula é transfeinada com ambas as construções fluorescentes e mostra um local de transcrição brilhantemente rotulado (ponta de flecha) acumulando o GFP-MS2CP em de novo transcrito gene repórter pré-mRNAs (imagem esquerda). O meio de crescimento das células não contém TA; portanto, a construção I-SceI-GR-iRFP é exclusivamente citoplasmática (imagem direita). Em (F), o prato de fundo de vidro é montado na câmara de incubação do estágio do microscópio para experimentos de imagem em lapso de tempo 3D e equipado com a tampa personalizada contendo o orifício de carregamento ta. A ponta de micropipette de 200 μL é cuidadosamente inserida no orifício para aplicar o TA diluído ao meio de crescimento das células. Scalebar = 10 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Software de aquisição e análise de imagens. O painel em (A) mostra uma captura de tela da ferramenta STaQTool: Spot tracking and quantification. A imagem exibe um exemplo de série temporal da linha de células genéticas do repórter PROM com site de transcrição rotulado marcado com um círculo verde/quadrado branco no display de projeção de intensidade máxima no centro. As janelas do lado direito exibem uma visão ampliada do local de transcrição selecionado, o gráfico de superfície de intensidade 3D correspondente com a grade de ajuste gaussiana 2D para o ponto de tempo atual, bem como parcelas da posição Z do local de transcrição dentro da pilha z, a largura de ajuste gaussiana (W) e a medição TFI ao longo do tempo. A imagem microscópica em (B) mostra um plano óptico único ampliado de um núcleo de uma linha de células genéticas de repórter PROM transfeinada com MS2-GFP. A imagem representa um ponto único de uma série de tempo de calibração 2D com 120 pontos de tempo. O núcleo mostra várias transcrições fluorescentes rotuladas aparecendo como objetos limitados à difração no nucleoplasma (marcado por quadrados brancos). O painel do lado direito mostra uma captura de tela da ferramenta TFI e W Distributions no STaQTool para analisar vários pontos em aquisições de lapso de tempo 2D. Nesta análise de exemplo, a ferramenta detectou 408 pontos limitados de difração representando transcrições genéticas de repórteres rotuladas com MS2-GFP que difundem no nucleoplasma. Os gráficos à direita exibem os histogramas de distribuição de largura de ajuste TFI e Gaussian dos objetos e das curvas de ajuste gaussiana. Os valores médios TFI e W derivados da posição do pico central da curva de ajuste gaussiana e os intervalos de confiança calculados são exibidos no respectivo painel. Scalebar = 10 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados representativos da detecção de transcrição em locais de quebras de dupla vertente de DNA. Os gráficos em (A) para (D) representam a curva TFI calibrada de um local de transcrição ao longo do tempo. Os valores de TFI são convertidos em transcrições usando a TFI média de transcrições únicas medidas nos experimentos de calibração para a respectiva construção genética repórter e a proteína de ligação de RNA de RNA fluorescente MS2 ou PP7 usada no respectivo experimento. Em (A), um gráfico de um experimento de controle usando o gene repórter PROM sem adição de TA é mostrado. As transcrições rotuladas com MS2-GFP indicam atividade transcricional contínua durante todo o período de observação. O gráfico em (B) representa o gene do repórter PROM sobre a adição de TA e indução de um DSB que leva a uma supressão da transcrição para o tempo de observação restante. O gráfico genético do repórter EX2 em (C) mostra uma supressão de transcrição da transcrição cônica orientada pelo promotor após a adição de TA. Mais tarde, no mesmo lapso de tempo, apenas a atividade transcricional rotulada pp7-RFP emerge. No gráfico em (D), a transcrição do gene do repórter EX2-AS do promotor canônico na direção do sentido é igualmente suprimida após a adição de TA ao gene repórter EX2 em (C). No entanto, o aparecimento de transcrições rotuladas MS2-RFP originárias da sequência inserida de loop de haste MS2 inserida indica transcrição antisentusida ausente durante a atividade de transcrição do sentido antes da adição de TA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Linha celular repórter	EX2 e EX2-AS	BAILE
Plasmids para transfetá-lo	1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP	1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP
	0,65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry	0,5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP
	0,35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP

Tabela 1: Transfecção das linhas de células genéticas dos repórteres. A tabela descreve os esquemas de transfecção e quantidades dos diferentes plasmídeos usados para transfetar as diferentes linhas de células genéticas de repórteres transitoriamente.

Discussão

Conflitos entre processos biológicos essenciais como replicação, transcrição, dano de DNA e reparação de DNA foram identificados como uma fonte crítica de instabilidade do ^genoma22. Esses estudos também levaram à descoberta da transcrição em locais de danos no DNA e atribuíram um papel funcional às transcrições induzidas por invasões na regulação dos processos de reparação de danos de ^DNA23. As novas ferramentas e o protocolo aqui descrito permitem uma investigação mais aprofundada da dinâmica de transcrição do RNA Pol II nos DSBs. Um ponto crítico neste protocolo é a geração de linhas celulares que contêm uma única cópia do gene repórter integrado ao genoma. Este recurso-chave elimina o ruído criado pela transcrição de vários genes de repórteres integrados com múltiplas cópias dentro de um único lócus genômico e permite a coleta de parâmetros cinéticos da dinâmica de transcrição e transcrições individuais de RNA. Um requisito técnico crucial para observar a transcrição de integrações genéticas de um único repórter é a disponibilidade de um sistema de microscópio que permite a detecção de transcrições de RNA únicas rotuladas com o sistema MS2 ou PP7 em células ^vivas4,12. Aqui, a microscopia de células vivas é realizada em um sistema confocal spinning disk montado em um microscópio invertido, equipado com lasers de estado sólido de 100 mW acoplados a um filtro acústico-óptico tunable como descrito em outros ^lugares24. Além disso, para estudar a transcrição em um único DSB usando os repórteres, as células individuais devem ser cuidadosamente monitoradas para alcançar a resolução de maior tempo, o que requer células de imagem por várias horas, tornando este um ensaio de baixo rendimento. Ainda assim, observamos várias células em paralelo com o posicionamento controlado por um estágio de microscópio orientado por piezo. Para garantir condições ambientais ideais para observação de células vivas durante horas, o corpo do microscópio, incluindo o estágio amostral, é colocado dentro de uma câmara ambiental plexiglass. Além disso, uma câmara de incubação de estágio fechado é montada no estágio do microscópio e conectada aos controladores de _co2 e umidade.

O primeiro passo crítico no protocolo é a seleção de regiões de interesse com células para imagem. Cada posição XY marcada para imagem deve conter uma ou mais células que mostrem transfecção com as proteínas fluorescentes de ligação de alça-tronco RNA de acordo com o gene repórter e esquema de transfecção descrito na Seção 1, Tabela 1, bem como na Figura 2D, E. Além disso, as células devem apresentar locais de transcrição rotulados brilhantes devem ser co-transfecidos com a construção I-SceI-GR-iRFP713, e a proteína deve ser localizada inicialmente no citoplasma (Figura 2D e E).

As células devem mostrar um nível de intensidade de fluorescência de proteína de casaco MS2 e/ou PP7 com marca fluorescente desvinculação baixa o suficiente para detectar transcrições rotuladas únicas sobre o nível de fluorescência de fundo. Ao mesmo tempo, um nível robusto de intensidade de fluorescência das proteínas fluorescentes de revestimento MS2 e/ou PP7 é necessário para permitir imagens ao longo de pelo menos 60 min sem perder muita fluorescência devido a algum branqueamento que ocorre. O "Display de imagem escala" com um intervalo fixo como descrito na Seção 3.7 é usado para permitir uma seleção padronizada de células de acordo com seu nível de intensidade de fluorescência.

Um segundo passo crítico do protocolo é adicionar o TA às células em posições XY pré-determinadas através do pequeno orifício na tampa do prato de fundo de vidro. Qualquer manipulação do prato de fundo de vidro causaria uma mudança da posição XY marcada das células e deve ser evitada. Portanto, manusear cuidadosamente a micropipette ao adicionar o TA diluído no meio de crescimento celular é vital para a observação bem sucedida das células pré-selecionadas, como demonstrado na Figura 2F. A adaptação de diferentes sistemas para adicionar drogas às células montadas em um estágio de microscópio, como um sistema de perfusão, exigiria uma câmara de incubação de estágio separado com aberturas de entrada e saída de tubos e um sistema de bomba ou injeção para administrar drogas. Outros métodos, como slides de canal com superfícies inferiores semelhantes a deslizamentos, resultam em uma difusão lenta de drogas administradas no canal e causam um atraso adicional entre a adição e o efeito da droga. Finalmente, a tubulação incauto em uma abertura de slides de canal também pode mudar a posição da amostra. Portanto, o sistema atual com um orifício personalizado na tampa de um prato de fundo de vidro é simples de se adaptar, de baixo custo e adequado para administrar diferentes mídias de crescimento, drogas e componentes. O pequeno diâmetro do orifício e a atmosfera umidificada na câmara de incubação do estágio também impede a secagem do meio celular.

Um terceiro passo crítico neste protocolo é a análise de dados, que requer uma inspeção manual dos pontos de tempo quando a transcrição cessa devido à indução de um DSB. O ponto de tempo de transcrição terminante é indicado pela liberação das últimas transcrições do site anteriormente brilhante rotulado da transcrição genética do repórter. Da mesma forma, os eventos de iniciação de transcrição induzida por invasão devem ser inspecionados com cuidado para detectar eventos de transcrição individuais com a relação sinal-ruído relativamente baixa de mRNAs rotulados fluorescentes.

A dinâmica de reparação do DSB induzido adiciona uma camada extra de complexidade às análises dos dados gerados usando esses repórteres, limitando-os aos primeiros minutos imediatamente após a indução do DSB. A natureza transgênica dos genes repórteres e a natureza rica em repetição das matrizes de loop-tronco MS2 e PP7 podem montar uma paisagem cromatina única, interferindo no estabelecimento de programas de transcrição estável e estável putativos. No entanto, em comparação com a irradiação ionizante ou UV, a indução mediada pelo I-SceI de um DSB em genes de repórteres é um sistema muito mais robusto para investigar a transcrição em DSBs individuais.

Diferentes sistemas de endonuclease, como I-CreI, I-PpoI ou AsiSI que têm ou não locais de reconhecimento adicionais dentro do genoma humano podem ser combinados com os atuais sistemas genéticos repórteres para uma possível maior eficiência de gerar DSBs. No entanto, eles exigem primeiro introduzir o site de reconhecimento de endonuclease nos genes dos repórteres. Em segundo lugar, eles podem ter uma variabilidade semelhante no tempo e indução de eficiência de um DSB em células individuais. Por outro lado, inserir cópias tandem de sites de reconhecimento de endonuclease pode aumentar a eficiência da indução de DSB. Além disso, testar os sistemas genéticos de repórteres apresentados em diferentes linhas celulares permitiria a comparação da dinâmica de transcrição em locais DSB entre diferentes origens celulares e a disponibilidade de diferentes vias de reparação de danos de DNA, como em células cancerosas, células primárias e células não ciclistas diferenciadas. No entanto, a construção dos genes repórteres para ser compatível com o sistema Flp/FRT está atualmente limitando a integração em linhas de células hospedeiras Flp/FRT disponíveis.

Além das aplicações baseadas em microscopia, os genes atuais do repórter também podem ser combinados com ensaios bioquímicos, como a imunoprecipitação de cromatina, para estudar o recrutamento de fatores de reparação de DNA ou transcrição para um único DSB ou para avaliar a ocupação nucleossomo, modificações de histona e estado de cromatina ao redor do local do DSB. Além disso, uma combinação com diferentes sistemas de repórteres permitiria o estudo de ligações funcionais entre danos ao DNA e processos como organização do genoma ou replicação de DNA.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mW solid-state Lasers	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system	Intelligent Imaging Innovations Inc.
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512	Photometrics, Tucson, AZ USA
Axio Observer Z1 inverted microscope	Carl Zeiss MicroImaging, Germany
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-1
charcoal-stripped fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F6765-500 ML
CO2 module S	PeCon GmbH, Erbach, Germany
CSU-X1 confocal spinning disk unit	Yokogawa Electric, Tokyo, Japan
DMEM	Gibco	41966029
DMEM with Hepes no PhenolRed	Gibco	21063-029
Doxicyclin	Sigma-Aldrich	D9891	for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium
FBS	Gibco	10270106
Flp-In T-REx 293 cell line	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	R75007
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence	GeneArt, Thermo Fischer Scientific		custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences
Heating Device Humidity 2000	PeCon GmbH, Erbach, Germany
Hygromycin B	Roche	10843555001
Immersion oil Immersol 518 F	Carl Zeiss MicroImaging Inc.)	444960-0000-000
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001	transfection helper reagent
Lipofectamine 3000 reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001	lipid-based transfection reagent
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-10-C
microscope incubation chamber	PeCon GmbH, Erbach, Germany
pcDNA5/FRT/TO	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	V652020
pOG44 plasmid	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	V600520
SlideBook 6.0 Software	Intelligent Imaging Innovations Inc.
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000	PeCon GmbH, Erbach, Germany
StaQtool Software	iMM-JLA Lisbon, Portugal		available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip
triamcinolone acetonide (TA)	Sigma-Aldrich	T6501	synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus
Trypsin/EDTA Solution (TE)	Thermo Fisher Scientific	R001100