Respirometria ad alta risoluzione per valutare la bioenergetica nelle cellule e nei tessuti utilizzando respirometri a camera e a piastre

Riepilogo

La valutazione della fosforilazione ossidativa mediante respirometri ad alta risoluzione è diventata parte integrante dell'analisi funzionale dei mitocondri e del metabolismo energetico cellulare. Qui, presentiamo protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare utilizzando respirometri ad alta risoluzione basati su camera e micropiastre e discutiamo i principali vantaggi di ciascun dispositivo.

Abstract

La respirometria ad alta risoluzione (HRR) consente di monitorare la fosforilazione ossidativa in tempo reale per l'analisi dei singoli stati energetici cellulari e la valutazione dei complessi respiratori utilizzando protocolli diversificati di titolazione substrato-disaccoppiatore-inibitore (SUIT). Qui viene dimostrato l'uso di due dispositivi di respirometria ad alta risoluzione e viene presentata una raccolta di base di protocolli applicabili per l'analisi di cellule in coltura, fibre muscolari scheletriche e cardiache e tessuti molli come il cervello e il fegato. I protocolli per cellule e tessuti in coltura sono forniti per un respirometro a camera e cellule coltivate per un respirometro basato su micropiastre, entrambi comprendenti protocolli di respirazione standard. A scopo comparativo, le cellule HEK293 ingegnerizzate con CRISPR carenti di traduzione mitocondriale che causano una carenza multipla del sistema respiratorio vengono utilizzate con entrambi i dispositivi per dimostrare difetti cellulari nella respirazione. Entrambi i respirometri consentono una misurazione completa della respirazione cellulare con i rispettivi meriti tecnici e l'idoneità a seconda della domanda di ricerca e del modello in studio.

Introduzione

I mitocondri soddisfano la fornitura chiave di energia e sono un organello compartimentato che contribuisce a processi bioenergetici e metabolici cellulari essenziali come l'anabolismo di nucleotidi, lipidi e amminoacidi, biogenesi del cluster ferro-zolfo e sono implicati nella segnalazione come la morte cellulare controllata ^1,2,3 . La bioenergetica mitocondriale attraverso la fosforilazione ossidativa contribuisce a quasi tutti i processi cellulari all'interno della cellula e, di conseguenza, le disfunzioni mitocondriali di origine primaria o secondaria

Protocollo

Tutta la sperimentazione animale viene eseguita in conformità con il National Animal Experiment Review Board e l'Agenzia amministrativa regionale statale per la Finlandia meridionale. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6JOlaHsd (4-6 mesi) Il consenso per l'uso di linee cellulari umane è stato ottenuto dal comitato etico istituzionale dell'Università di Helsinki.

1. Respirometria ad alta risoluzione: respirometro a camera (cHRR)

NOTA: Gli esperimenti in questa sezione del protocollo sono stati eseguiti utilizzando l'Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Tabella dei materiali<....

Risultati

Qui, forniamo protocolli per determinare la bioenergetica mitocondriale nelle cellule eucariotiche, nel tessuto non fibroso (ad esempio, cervelletto) e nel tessuto fibroso (ad esempio, muscolo scheletrico). Per le cellule eucariotiche, HEK293 con knockout ingegnerizzato CRISPR di due diverse proteine associate alla traduzione mitocondriale con conseguente deficit multiplo (CRISPR^KO1) e grave/completo di OXPHOS (CRISPR^KO2) è stato misurato con cHRR (Figura 3A-C<.......

Discussione

Tradizionalmente, la bioenergetica mitocondriale è stata studiata con elettrodi di ossigeno di tipo Clark. Una mancanza di risoluzione e throughput, tuttavia, giustificata per il progresso tecnologico. Ad oggi, l'O2k (indicato come cHRR) e il Seahorse XF96 Flux Analyzer (denominato mHRR) sono stati ampiamente adottati nel campo della bioenergetica cellulare. Qui, presentiamo una raccolta comprensibile di protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare attraverso la valutazione della respirazione mitocondri.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer	Omni International	07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixture			Potter for tissue grinding
ADP	Sigma	A 4386
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical
Ascorbate	Merck	PHR1279-1G	Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free)	Sigma	A 6003	Chemical
CaCO3	Sigma	C 4830	Chemical
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical
Dithiothreitol	Sigma	D 0632	Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose	Roth	4621.1	Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose)	Fisher Scientific	41965-039	Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose)	Fisher Scientific	A14430-01
EGTA	Sigma	E 4378
Etomoxir	Sigma	E1905	Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	AM12500	Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	AM12501
FCCP	Sigma	C 2920
Glucose	Sigma	G7021	Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate	Sigma	G 1626	Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Fisher Scientific	35050061	Chemical
HEK293 cells	ATTC	CRL-1573
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B	Instrument for cell counting
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
Imidazole	Fluka	56750	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
L-carnitine	Sigma	C0283	Chemical
Malate	Sigma	M 1000	Chemical
MES hydrate	Sigma	M8250	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Na2ATP	Sigma	A 2383	Chemical
Na2Phosphocreatine	Sigma	P 7936	Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x)	Fisher Scientific	11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x	Fisher Scientific	11140035
Normal FBS (10x)	Fisher Scientific	10500064
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
O2k-Titration Set	Oroboros Instruments	20820-03	Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine	Sigma	P 4509	Chemical
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit	Fisher Scientific	23227
Pyruvate	Sigma	P 2256	Chemical
RIPA-Buffer	Fisher Scientific	89900	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Saponin	Sigma	S7900	Chemical
Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4	Agilent, Santa Clara, CA	103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA		High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent, Santa Clara, CA		Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypan Blue solution	Merck	72-57-1	Chemical
Trypsin 0.25% EDTA	Fisher Scientific	25200056
Two thin-edged forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Uridine stock (500x)	Sigma	U3750	Chemical