Microdissezione a strati di foglietti valvolari tricuspidi per caratterizzazione meccanica biassiale e quantificazione microstrutturale

Riepilogo

Questo protocollo descrive la caratterizzazione meccanica biassiale, la quantificazione del collagene basata sull'imaging del dominio della frequenza spaziale polarizzata e la microdissezione dei lembi della valvola tricuspide. Il metodo fornito chiarisce come gli strati del volantino contribuiscono ai comportamenti olistici del volantino.

Abstract

La valvola tricuspide (TV) regola il flusso unidirezionale di sangue non ossidato dall'atrio destro al ventricolo destro. Il televisore è composto da tre volantini, ognuno con comportamenti meccanici unici. Queste variazioni tra i tre volantini TV possono essere ulteriormente comprese esaminando i loro quattro strati anatomici, che sono l'atriale (A), la spongiosa (S), la fibrosa (F) e la ventricolare (V). Mentre questi strati sono presenti in tutti e tre i volantini TV, ci sono differenze nei loro spessori e costituenti microstrutturali che influenzano ulteriormente i loro rispettivi comportamenti meccanici.

Questo protocollo include quattro passaggi per chiarire le differenze specifiche dello strato: (i) caratterizzare i comportamenti architettonici meccanici e delle fibre di collagene del foglietto TV intatto, (ii) separare gli strati compositi (A / S e F / V) del volantino TV, (iii) eseguire le stesse caratterizzazioni per gli strati compositi e (iv) eseguire post-hoc valutazione istologica. Questo quadro sperimentale consente in modo univoco il confronto diretto del tessuto TV intatto con ciascuno dei suoi strati compositi. Di conseguenza, con questo protocollo è possibile raccogliere informazioni dettagliate sulla microstruttura e sulla funzione biomeccanica dei foglietti illustrativi. Tali informazioni possono potenzialmente essere utilizzate per sviluppare modelli computazionali televisivi che cercano di fornire indicazioni per il trattamento clinico della malattia tv.

Introduzione

La TV si trova tra l'atrio destro e il ventricolo destro del cuore. Durante tutto il ciclo cardiaco, il televisore regola il flusso sanguigno unidirezionale tramite l'apertura e la chiusura ciclica del volantino anteriore TV (TVAL), del volantino posteriore TV (TVPL) e del volantino settale TV (TVSL). Questi foglietti sono complessi e hanno quattro strati anatomici distinti - l'atriale (A), la spongiosa (S), la fibrosa (F) e la ventricolare (V) - con costituenti microstrutturali unici. Le fibre di elastina nell'atriale e nel ventricolare aiutano a ripristinare il tessuto alla sua geometria non deformata dopo il carico meccanico¹. Al contrario, la fibrosa contiene una fitta rete di fibre di collagene ondulate che contribuiscono alla capacità portante delle foglioline². Costituita principalmente da glicosaminoglicani, la spongiosa è stata ipotizzata per consentire la cesoiatura tra gli strati del foglietto durante la funzione della valvola cardiaca³. Mentre tutti e tre i tipi di volantini hanno gli stessi strati anatomici, ci sono variazioni negli spessori degli strati e nei rapporti costitutivi che hanno implicazioni per i comportamenti meccanici specifici del volantino.

I ricercatori hanno esplorato le proprietà dei volantini televisivi utilizzando caratterizzazioni meccaniche planari, valutazioni istomorfologiche e caratterizzazioni ottiche dell'architettura delle fibre di collagene. Ad esempio, le caratterizzazioni meccaniche biassiali planari cercano di emulare il carico fisiologico applicando spostamenti perpendicolari al tessuto e registrando le forze associate. Le osservazioni risultanti forza-spostamento (o stress-stretch) hanno rivelato che tutti e tre i volantini TV mostrano comportamenti meccanici non lineari, specifici della direzione con risposte più evidenti specifiche del volantino nella direzione del tessuto radiale ^4,5,6. Si ritiene che questi comportamenti specifici del volantino derivino da differenze nelle proprietà microstrutturali osservate utilizzando tecniche istologiche standard ^6,7. Inoltre, l'imaging di seconda generazione armonica⁶, lo scattering della luce a piccolo angolo⁸ e l'imaging del dominio della frequenza spaziale polarizzata⁷ (pSFDI) mirano a comprendere queste proprietà microstrutturali e hanno mostrato differenze specifiche del volantino nell'orientamento della fibra di collagene e nella crimpatura delle fibre che hanno implicazioni per i comportamenti meccanici osservati a livello tissutale. Questi studi hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione della microstruttura tissutale e del suo ruolo nei comportamenti a livello tissutale. Tuttavia, molto resta da affrontare nel collegare sperimentalmente la meccanica dei tessuti e la microstruttura sottostante.

Recentemente, questo laboratorio ha eseguito caratterizzazioni meccaniche degli strati di volantini TV separati in due strati compositi (A / S e F / V) utilizzando una tecnica di microdissezione⁹. Quel lavoro precedente ha evidenziato le differenze nelle proprietà meccaniche degli strati e ha contribuito a fornire informazioni su come la microstruttura stratificata contribuisce ai comportamenti meccanici dei tessuti. Sebbene questa indagine abbia migliorato la nostra comprensione della microstruttura del volantino TV, la tecnica aveva diverse limitazioni. In primo luogo, le proprietà degli strati compositi non sono state direttamente confrontate con il tessuto intatto, portando a una mancanza di comprensione completa della relazione meccanica-microstruttura. In secondo luogo, l'architettura delle fibre di collagene degli strati compositi non è stata esaminata. In terzo luogo, solo gli strati del TVAL sono stati studiati a causa delle difficoltà nel raccogliere gli strati compositi dagli altri due volantini TV. Il metodo qui descritto fornisce un quadro di caratterizzazione olistico che supera queste limitazioni e fornisce caratterizzazioni complete dei volantini TV e dei loro strati compositi.

Questo articolo descrive la tecnica di microdissezione che separa i tre foglietti TV nei loro strati compositi (A/S e F/V) per caratterizzazioni biassiali meccaniche e microstrutturali 10,11,12. Questo protocollo iterativo include (i) test meccanici biassiali e caratterizzazione pSFDI del foglietto intatto, (ii) una tecnica di microdissezione nuova e riproducibile per ottenere in modo affidabile gli strati TV compositi e (iii) test meccanici biassiali e caratterizzazione pSFDI degli strati TV compositi. Il tessuto è stato esposto a carico di trazione biassiale con vari rapporti di forza per prove meccaniche. Quindi, pSFDI è stato utilizzato per determinare l'orientamento e l'allineamento delle fibre di collagene in varie configurazioni caricate. pSFDI preserva l'architettura nativa delle fibre di collagene, consente l'analisi dipendente dal carico e aggira la tipica necessità di fissare o cancellare il tessuto per l'analisi dell'architettura delle fibre di collagene, come nell'imaging di seconda generazione armonica o nella diffusione della luce a piccolo angolo. Infine, i tessuti sono stati preparati utilizzando tecniche istologiche standard per visualizzare la microstruttura tissutale. Questo quadro iterativo e olistico consente il confronto diretto delle proprietà meccaniche e microstrutturali del foglietto TV con i suoi strati compositi.

Protocollo

Tutti i metodi descritti nel presente documento sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università dell'Oklahoma. I tessuti animali sono stati acquisiti da un macello approvato dall'USDA.

1. Caratterizzazione meccanica biassiale

1. Preparazione dei tessuti
   1. Recupera un volantino TV dal congelatore, lame di rasoio, una penna chirurgica, una pinza, una pipetta con acqua deionizzata (DI) e un tappetino da taglio. Scongelare il volantino TV usando 2-3 gocce di acqua DI a temperatura ambiente.
      NOTA: l'acqua DI viene utilizzata al posto della soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per evitare qualsiasi difficoltà indotta da PBS per la microdissezione dello strato.
   2. Appoggiare il campione piatto sul tappetino da taglio con lo strato ventricolare (cioè la superficie con le inserzioni delle corde) rivolto verso l'alto. Posizionate il campione in modo che la direzione radiale si allinei con la direzione Y e la direzione circonferenziale si allinei con la direzione X.
      NOTA: la direzione circonferenziale è orientata lungo la circonferenza della valvola.
   3. Esaminare le posizioni di inserimento delle corde del tessuto. Determinare un'area, idealmente ~ 12 x 12 mm, con la minima quantità di grandi inserzioni di corde evitando aree estremamente sottili (cioè trasparenti) (Figura 1).
   4. Capovolgere il campione in modo che la superficie atriale (cioè la superficie senza inserzioni di corde) sia rivolta verso l'alto. Assicurarsi che le direzioni del volantino circonferenziale e radiale rimangano allineate rispettivamente con gli assi X e Y.
   5. Tagliare un campione quadrato di 12 x 12 mm dal tessuto del foglietto che eviti le grandi inserzioni di corde o le aree sottili identificate nel punto 1.1.3. Rimuovere le parti tagliate del tessuto del foglietto illustrativo con la pinza e metterle in un contenitore per i rifiuti.
      1. Se non è possibile evitare completamente le grandi inserzioni di corde, tagliare i tessuti in modo che siano lungo il bordo del campione quadrato. Evitare le inserzioni di corde è importante in quanto aiuta a prevenire problemi per la successiva microdissezione.
   6. Utilizzare una penna chirurgica per posizionare un piccolo punto nell'angolo in alto a destra per tracciare l'orientamento del campione. Lasciare asciugare l'inchiostro per circa 30 s.
   7. Capovolgere il campione con la superficie ventricolare (cioè la superficie con inserzioni cordali) rivolta verso l'alto. Tagliare gli attacchi cordali sul retro del tessuto allungando le corde dal foglietto e usando una lama di rasoio per tagliare vicino alla sua posizione di inserimento. Capovolgere nuovamente il campione in modo che la superficie atriale (cioè la superficie liscia) sia rivolta verso l'alto.
2. Misurazione dello spessore
   1. Recuperate un sensore di spostamento laser senza contatto. Azzerare il sensore di spostamento su una sezione piatta del tappetino di taglio vicino al tessuto tagliato.
      ATTENZIONE: Non far brillare direttamente il laser negli occhi.
   2. Posizionare il laser sulla regione centrale del campione. Rimuovere l'aria intrappolata sotto la superficie del foglietto in quanto può causare errori di misurazione. Per rilasciare l'aria intrappolata, utilizzare una pinzetta per spingere la bolla sul bordo del tessuto o sollevare un angolo del tessuto.
   3. Registrare lo spessore visualizzato sul display del sensore di spostamento. Ripetere altre due misurazioni in altre posizioni del campione.
   4. Calcola lo spessore medio del volantino utilizzando le tre misurazioni registrate nel passaggio precedente. Utilizzare questo valore quando si creano i protocolli di caratterizzazione meccanica biassiale.
3. Configurazione del tester biassiale e montaggio su tessuto
   1. Preparare un bagno d'acqua DI a 37 °C, seguendo le linee guida del sistema di test, per garantire la temperatura in condizioni fisiologiche in vivo .
   2. Recuperare pinze, il campione di tessuto, l'hardware di montaggio, uno strumento a punta fine, colla cianoacrilica liquida e perle di vetro verniciato nero (diametro: 300-500 μm).
      NOTA: l'hardware di montaggio include i denti, il ponte di montaggio e la gomma di montaggio.
   3. Montare il campione di tessuto al sistema di test. Assicurarsi che la direzione circonferenziale del tessuto sia allineata con la direzione X, che può essere assistita dal punto precedentemente posizionato nel passaggio 1.1.6.
      NOTA: i denti utilizzati qui devono essere distanziati uniformemente su tutta la lunghezza del bordo del tessuto. La lunghezza effettiva del bordo è impostata su 10 mm per il tessuto intatto e >3,3 mm per gli strati compositi.
4. Posizionamento del marcatore fiduciale
   1. Identificare la regione centrale di un terzo quadrato del tessuto montato. Utilizzate gli angoli approssimativi di quest'area per il posizionamento del marcatore fiduciale.
   2. Posizionare le perle di vetro in una barca di pesatura a faccia aperta e creare una piccola piscina di colla liquida cianoacrilata in una barca di pesatura separata. Rivestire la parte superiore dello strumento a punta fine con una piccola quantità di colla. Tamponare la colla in eccesso sul lato della barca di pesatura.
   3. Creare un angolo della matrice centrale di un terzo quadrato premendo delicatamente la punta rivestita di colla sul tessuto. Usando una pinza, prendi una perla di vetro e posizionala con cura sopra il punto di colla. Utilizzare la fotocamera del dispositivo di test biassiale per assistenza con il posizionamento del tallone.
   4. Ripetere i passaggi 1.4.2 e 1.4.3 per tre perline aggiuntive fino al completamento della matrice quadrata. Assicurarsi che le perline siano saldamente attaccate e che i rispettivi punti di colla non si tocchino o si attacchino. Asciugare la colla prima di abbassare il tessuto nel bagno d'acqua.
      1. Se le perline sono attaccate insieme, attendere che la colla si asciughi, quindi utilizzare la pinza per afferrare delicatamente la perla o la colla e tirarla fuori dal tessuto.
         NOTA: la colla e le perline dovrebbero staccarsi, consentendo di ritentare il posizionamento delle perline.
5. Precondizionamento
   1. Creare un protocollo di precondizionamento controllato dalla forza, in cui il tessuto con lunghezza e spessore del bordo subirà sei ripetizioni di carico equibiassiale a un _picco di tensione della membrana T di 40 N / m con un precarico del 3% × T_picco¹⁰ e tempi di allungamento e recupero di 30 s ciascuno.
      1. Costruire una directory di test arbitraria che memorizzerà temporaneamente i dati per i calcoli futuri. Impostare la velocità di caricamento su 4,42 N/m.
      2. Costruire un nuovo set di parametri di test con il nome Preconditioning0. Impostare le modalità di controllo dell'asse X e dell'asse Y per forzare e impostare le funzioni di controllo su step. Definire la magnitudo del carico come la forza associata al _picco T, cioè picco f = _picco T · L. Definire la magnitudine del precarico come 3% del _picco f solo per la prima ripetizione e definire sia la durata dell'allungamento che la durata del recupero come 30 s. Definite il numero di ripetizioni come 10.
         NOTA: Il picco calcolato prima dello stress di Piola-Kirchhoff, cioè picco P = _picco T_{/ t}, può superare i 200 kPa per i tessuti più sottili, il che potrebbe causare lacerazione dei tessuti durante il test. In questi scenari, la tensione di picco della membrana è stata regolata a una prima sollecitazione massima di Piola-Kirchhoff di 200 kPa.
   2. Eseguire il protocollo di precondizionamento. Dopo il precondizionamento, registrare le attuali dimensioni X e Y del campione per l'uso nei protocolli di prova biassiale.
6. Creazione ed esecuzione di protocolli di test biassiali
   1. Determinare il tempo necessario per ottenere la configurazione equibiassale di picco dalla configurazione post-precondizionata con la velocità di spostamento desiderata. Considerando una velocità di spostamento costante, calcolare i tempi di caricamento per i rapporti di carico rimanenti (ad esempio, T_XX: T_YY = 1: 0,5 e T_XX: T_YY = 0,5: 1).
   2. Eseguire manualmente gli attuatori lineari in modo che corrispondano alle forze target per un determinato rapporto di carico. Ripetere questo processo e registrare le dimensioni del foglio illustrativo per tutti i rapporti di carico.
   3. Preparare un protocollo di prova a spostamento controllato che sposti biassialmente il tessuto dalla configurazione post-precondizionata alle configurazioni registrate nel passaggio 1.6.2 (ad esempio, T_XX:T_YY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1) entro i tempi determinati nel passaggio 1.6.1. Assicurarsi che ogni protocollo abbia tre cicli di carico/scarico per la ripetibilità del comportamento meccanico.
      1. Costruire una directory di test che memorizzerà i dati per i calcoli futuri. Assicurarsi che il nome della directory corrisponda al campione corrente.
      2. Costruire un nuovo set di parametri di test con il nome 1:1, impostare le modalità di controllo dell'asse X e dell'asse Y sullo spostamento e impostare le funzioni di controllo su rampa. Definite la magnitudine dell'allungamento come configurazione registrata nel passaggio 1.6.1. Definire la magnitudo del precarico come 3% del _picco f solo per la prima ripetizione e definire sia la durata del tratto che la durata del recupero come il tempo registrato nel passaggio 1.6.1. Definite il numero di ripetizioni come 3.
      3. Ripetere il passaggio 1.6.3.2 per i rapporti di carico rimanenti (ad esempio, T_XX:T_YY = 1:0.5 e T_XX:T_YY = 0,5:1), tranne definire la magnitudo del precarico come non applicata. Assicurarsi che l'entità dell'allungamento, la durata dell'allungamento e la durata del recupero corrispondano a quelle registrate nel passaggio 1.6.2.
         NOTA: solo i dati del (terzo) ciclo finale saranno utilizzati per le analisi delle sollecitazioni e delle deformazioni.
   4. Eseguire i protocolli a spostamento controllato. Dopo il completamento del test biassiale, riportare il tessuto alle sue dimensioni post-precondizionate.
      NOTA: Il test deve essere immediatamente interrotto se il tessuto inizia a lacerarsi.
7. Ulteriori caratterizzazioni
   1. Lasciare il tessuto immerso in acqua DI e montato sul sistema di test biassiale. Eseguire l'imaging pSFDI come descritto nei passaggi 2.1-2.3.
   2. Smontare il tessuto. Se si tratta di un tessuto intatto, procedere alla microdissezione descritta nei passaggi 3.1-3.7. In caso contrario, raccogliere l'istologia seguendo il passaggio 3.7.
      NOTA: Il bagno d'acqua DI può essere utilizzato per successive caratterizzazioni entro lo stesso giorno.
   3. Ripetere i passaggi 1.2-1.7 con gli strati A/S e F/V acquisiti dopo la microdissezione (passi 3.1-3.6).
      NOTA: La ripetizione del protocollo di test per gli strati consente il confronto diretto del tessuto intatto con i propri strati.
8. Procedure di post-elaborazione dei dati di test biassiali
   1. Eseguire la correlazione delle immagini digitali delle immagini di test biassiali acquisite per determinare le posizioni dei marcatori dipendenti dal tempo. Calcolare gli spostamenti del marcatore fiduciale tramite Eq (1). ⁵
      (1)
      Qui, x_i(t), X_i e d_i(t) sono la posizione dipendente dal tempo, la posizione iniziale (di riferimento) e lo spostamento del marcatore i.
   2. Calcolare il gradiente di deformazione F considerando i marcatori fiduciali come un elemento finito bilineare a quattro nodi, come mostrato in Eq (2)⁵
      (2)
      Dove B_Xi e B_Yi sono le derivate delle funzioni di forma per il nodo i nelle direzioni X e Y, rispettivamente, e u_i(t) e v_i(t) sono le componenti di d_i(t): d_i(t) = [u_i(t), v_i(t)]^T.
   3. Calcolare la prima sollecitazione di Piola-Kirchhoff applicata P utilizzando le forze registrate, come in Eq (3)⁵
      (3)
      P_XX e P_YY sono le componenti X e Y di P; L e t sono la lunghezza e lo spessore del bordo del tessuto; f_X e f_Y sono le forze registrate nelle direzioni X e Y.
   4. Determinare altre misure di deformazione e sollecitazione secondo necessità,13 che includono la deformazione destra di Cauchy-Green C = F^T /F, la deformazione di Green-Lagrange E = (C - I)/2, la σ di sollecitazione di Cauchy = ^J-1PF^T e la seconda sollecitazione di Piola-Kirchhoff S = ^F-1P.
      NOTA: Qui, I è un tensore di identità del secondo ordine, e J = det(F) è il jacobiano del gradiente di deformazione F.

2. Imaging del dominio della frequenza spaziale polarizzata

1. Preparazione del sistema
   NOTA: Se lo si desidera, i marcatori fiduciali possono essere rimossi dal tessuto prima dei seguenti passaggi.
   1. Centrare il dispositivo pSFDI sul campione (Figura 2). Accendere il proiettore e illuminare il campione con una luce a 490 nm (ciano).
   2. Aprire il software della fotocamera e ispezionare il campo visivo della telecamera. Assicurarsi che il campione sia centrato nel fotogramma e sia completamente contenuto nel campo visivo.
   3. Se il campione montato è un foglietto intatto, regolare la luminosità del proiettore DLP (Digital Light Processing) per garantire che il tessuto sia completamente illuminato senza riflessi sulla superficie del tessuto. Non regolare la luminosità se il campione è uno degli strati compositi.
   4. Ruota il polarizzatore sulla sua gamma completa di movimenti per rilevare possibili abbagliamenti o sporcizia sulla lente polarizzatore. Pulire accuratamente la lente polarizzata con un panno in microfibra, se necessario.
2. Raccolta dei dati
   NOTA: la seguente raccolta di dati può essere automatizzata utilizzando software, come LabVIEW o Python.
   1. Spostare il polarizzatore nella posizione di partenza, idealmente allineato con uno degli assi di prova biassiali. Cattura un'immagine in scala di grigi e salvala sul computer con la posizione del polarizzatore (cioè 0°).
   2. Ruotare il polarizzatore di 5° e acquisire un'altra immagine in scala di grigi. Ripeti questo processo per acquisire 37 immagini che vanno da 0° a 180° con un incremento di 5°.
      NOTA: Le immagini della prima sequenza di imaging pSFDI possono essere analizzate preliminarmente per garantire la risposta ottica desiderata dal tessuto. Fare riferimento al passaggio 2.3 per istruzioni.
   3. Ripetere la sequenza di imaging pSFDI per altre configurazioni tissutali desiderate, ad esempio le configurazioni di picco dei protocolli di carico considerati per i test meccanici biassiali.
3. Procedure di post-elaborazione dei dati pSFDI
   NOTA: il seguente metodo include i passaggi per il linguaggio del programma MATLAB. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi linguaggio preferito (ad esempio, Python, C ++).
   1. Utilizza la funzione MATLAB imread() per costruire array contenenti le intensità pixel-wise delle 37 immagini acquisite. Per comodità, disponeteli come un array tridimensionale n × m × 37, dove n e m sono i numeri di pixel lungo i due assi.
   2. Definire la regione di interesse del tessuto (ROI) utilizzando la funzione grabit() definita dall'utente.
   3. Adatta i dati sull'intensità rispetto all'angolo del polarizzatore per ciascun pixel ROI utilizzando una serie di Fourier a 3 termini, come in Eq (4):
      (4)
      Qui, I(θ) è l'intensità pixel-saggio in funzione dell'angolo del polarizzatore, e b_i sono le costanti di Fourier. Utilizzare la regressione lineare standard dei minimi quadrati per determinare b_i.
   4. Determinare l'orientamento della fibra in pixel come angolo polarizzatore associato al valore massimo di I(θ). Calcolare il grado di anisotropia ottica (DOA) tramite Eq (5).
      (5)
   5. Utilizzare plot() e histogram() per visualizzare l'orientamento delle fibre acquisite e i valori DOA. Salvare i risultati elaborati per un uso successivo.

3. Microdissezione di strati compositi di fogliettino valvolare tricuspide

1. Attacco del tessuto alla tavola di cera
   1. Raccogli i materiali richiesti: tavola di cera, acqua DI, pipetta, bisturi, micro forbici, pinze sottili, pinze curve, pinze spesse e perni.
      NOTA: Utilizzare solo pinzette senza denti o impugnature, poiché pinze di questo tipo possono facilmente strappare il tessuto sottile dello strato A / S durante l'esecuzione della dissezione.
   2. Smontare il tessuto dal tester biassiale e misurarne lo spessore utilizzando il sensore di spostamento laser descritto al punto 1.2. Posizionare il tessuto sulla tavola di cera.
   3. Esaminare il lato ventricolare del tessuto per grandi inserzioni di corde. Si noti la posizione di queste inserzioni per evitarle durante la dissezione (Figura supplementare S1). Scatta una fotografia come riferimento.
   4. Stendere il tessuto piatto sulla tavola di cera con l'atriale rivolto verso l'alto. Apporre il tessuto alla scheda usando i perni:
      1. In ogni angolo del tessuto, posizionare un perno che è inclinato lontano dal tessuto (per una migliore visualizzazione) e tira leggermente il tessuto teso (Figura 3A). Esegui questa operazione in senso orario o antiorario. Assicurarsi che i perni siano all'esterno dei fori creati dai denti durante il montaggio del tessuto.
      2. Regolare leggermente il posizionamento del perno per assicurarsi che il tessuto sia teso e in una configurazione quadrata (Figura 3B) in modo che il tessuto rimanga piatto e non si sposti durante la micro-dissezione dello strato.
      3. Se necessario, posizionare i perni lungo il lato del tessuto durante la dissezione per allungare maggiormente il tessuto. Tieni presente quando posizioni e incingi perni aggiuntivi che devono essere lavorati durante la dissezione.
      4. Rimuovere i marcatori fiduciali di perline di vetro.
         NOTA: il passaggio seguente è facoltativo. L'acqua DI aggiunta aiuta a mantenere l'idratazione dei tessuti e impedisce al tessuto di attaccarsi a se stesso durante la microdissezione.
      5. Usando una pipetta, posizionare l'acqua DI sulla superficie del tessuto in modo che copra completamente il tessuto in modo simile a una bolla. Ricostituire l'acqua DI secondo necessità durante la dissezione.
2. Fai l'angolo iniziale.
   1. Selezionate un angolo del campione bloccato per iniziare la dissezione. Evitare grandi inserzioni di corde e aree estremamente sottili.
   2. Effettuare un taglio nello strato A / S trascinando leggermente il bisturi sulla superficie del tessuto lungo i fori di montaggio dai test meccanici (Figura 3C). Assicurarsi che il taglio sia lungo almeno 5 mm e che i bordi del taglio inizino a staccarsi, rivelando lo strato F/V sottostante.
   3. Utilizzare la pinza sottile (senza punta affilata) per strofinare saldamente lungo il taglio e separare i bordi del taglio (Figura supplementare S2).
      1. Se il taglio nello strato A / S non inizia a staccarsi, tracciare leggermente lo stesso taglio di nuovo con il bisturi fino a quando non inizia a farlo. Fare attenzione a non tagliare troppo in profondità nel tessuto (oltre lo strato composito A / S) in quanto rende più difficile separare in modo pulito gli strati.
   4. Ripetete i passaggi 3.2 e 3.2.3 per effettuare un secondo taglio perpendicolare al primo taglio (Figura 3D). Assicurarsi che i due tagli siano collegati e formino un angolo.
      1. Se i due tagli non sono collegati, eseguire le pinzette sottili sotto la piccola area di tessuto che separa i due tagli (Figura supplementare S3). Quindi, utilizzare con attenzione le forbici per tagliare il tessuto.
3. Sbucciare il tessuto dall'angolo.
   1. Strofinare lungo i tagli usando la pinza sottile fino a quando il tessuto inizia a separarsi dallo strato F / V. Non appena un piccolo pezzo di tessuto viene separato, afferrarlo con le pinzette e tirarlo delicatamente per separare ulteriormente gli strati compositi.
      NOTA: Posizionare sempre la punta delle pinzette sottili oltre il bordo del tessuto durante la presa. Altrimenti, potrebbero accidentalmente praticare un foro nello strato composito A / S.
   2. Continuare a sbucciare il tessuto e strofinare la cucitura fino a raggiungere la fine dei due tagli fatti per l'angolo. Durante questo processo, passare a pinzette più grandi per afferrare il tessuto per il processo di peeling per evitare strappi e strappi indesiderati dello strato composito A / S.
      1. Se la prima curva tentata presenta problemi importanti con la separazione, prova un'altra curva come punto di partenza (torna al passaggio 3.2).
4. Estendere i tagli, sbucciare il tessuto e fare un secondo angolo.
   1. Estendere i due tagli effettuati per il primo angolo posizionando la punta del bisturi nella parte inferiore di ogni taglio e trascinandola leggermente lungo la superficie del tessuto (Figura 4A). Assicurarsi che tutti i tagli di estensione siano di almeno 5 mm e che le prolunghe di taglio si colleghino ai tagli originali e continuino a seguire i fori di tina o di sutura.
      NOTA: se il taglio dell'estensione è troppo profondo, il peeling imminente deve essere attentamente monitorato per garantire che le sezioni della fibrosa non siano separate con lo strato composito A / S (Figura 5A).
   2. Continuare ad estendere i tagli e sbucciare lo strato A/S composito superiore mentre si strofina la cucitura fino a quando un lato non è finito. Osserva che il tessuto sarà separato completamente lungo un taglio; assicurarsi che la cucitura tra gli strati compositi A/S e F/V sia diritta (Figura 4B).
   3. Ripetere le istruzioni nei passaggi 3.2 e 3.3 per creare un secondo angolo perpendicolare all'estremità del lato completamente sbucciato (Figura 4C).
5. Separare completamente il livello A/S.
   1. Estendere i tagli rimanenti evitando grandi inserzioni di corde. Continuare a separare gli strati A/S e F/V utilizzando le tecniche di sfregamento e trazione utilizzate per la prima curva. Prendi nota di diverse considerazioni o problemi che possono sorgere durante questo processo:
      1. Escludere le inserzioni di corde dall'area di separazione A/S (Figura 5B) solo quando questa esclusione consentirà un campione A/S abbastanza grande per caratterizzazioni sperimentali (>3,3 mm).
      2. Se il tessuto si strappa o si forma un foro, smettere immediatamente di separare il tessuto. Per evitare che le pinzette vengano catturate, posizionare le forbici in qualsiasi foro che si forma e tagliare il tessuto lontano dal centro. Se il difetto si forma lungo la cucitura di separazione, iniziare a separare il tessuto lungo un altro bordo per evitare ulteriori strappi (Figura 5C).
      3. Cercare connessioni interstrato che possono apparire durante la separazione del tessuto e prevenire un'ulteriore separazione del tessuto senza un alto rischio di strappo (Figura 5D). Osserva che questi sono fili sottili ma forti che devono essere tagliati con cura usando le forbici. Evitare di creare un foro nello strato A/S o di tagliare verso il basso nello strato F/V, in quanto ciò causerebbe una separazione non uniforme.
      4. Continuare questo processo fino a quando il campione più grande possibile dello strato A/S non è stato separato. Contrassegnare l'orientamento del campione utilizzando la penna chirurgica (Figura 6A).
6. Termina la dissezione.
   1. Utilizzare le forbici per tagliare lungo la cucitura di separazione per il bordo del tessuto rimanente (Figura 6B). Assicurarsi che questo taglio sia il più vicino possibile alla cucitura di separazione.
   2. Posizionare lo strato composito A/S separato piatto sul tappetino di taglio. Se necessario, utilizzare il bisturi per raddrizzare i bordi del tessuto e creare una forma di tessuto quadrato adatta per i test meccanici biassiali. Posizionare lo strato A / S in acqua DI fino a quando non è pronto per essere testato.
   3. Contrassegnare l'orientamento dello strato F/V che rimane sulla tavola di cera. Tagliare il quadrato più grande possibile dall'area in cui è stato rimosso lo strato A/S (Figura 6C), quindi posizionarlo in acqua DI.
7. Istologia
   1. Asportare due strisce di tessuto, allineate con le direzioni circonferenziale e radiale, per l'uso in istologia. Utilizzare protocolli diversi per gli strati intatti e compositi (ad esempio, A / S e F / V).
      1. Per lo strato intatto, prendi i campioni dal tessuto che rimane appuntato alla tavola di cera. Utilizzare il tessuto al di fuori dei fori di tino/sutura, poiché questa porzione del tessuto non è stata sezionata e rappresenterà il foglietto intatto.
      2. Per gli strati compositi A/S e F/V, raccogliere i campioni istologici solo dopo aver completato completamente il test e l'imaging. Smontare il campione dal sistema di prova biassiale, posare il tessuto piatto su un tappetino da taglio e asportare le strisce circonferenziali e radiali usando una lama di rasoio.
   2. Posizionare le strisce asportate in cassette di tessuto e immergere le cassette in formalina al 10%.
   3. Scartare il tessuto rimanente. Pulire gli strumenti di dissezione utilizzando il composto detergente (vedere la tabella dei materiali).
   4. Dopo 24-48 ore di fissazione, trasferire le cassette in etanolo, dove possono essere conservate indefinitamente fino all'elaborazione istologica e alla colorazione.
      NOTA: Questa analisi istologica può confermare che la microdissezione ha esito positivo. ATTENZIONE: il 10% di formalina provoca irritazione cutanea e gravi danni agli occhi. Può anche causare una reazione allergica o cancro attraverso l'inalazione. Durante la manipolazione, indossare dispositivi di protezione individuale appropriati, come guanti, occhiali e un camice da laboratorio, e utilizzare solo in spazi ben ventilati, come in una cappa aspirante. Quando non è in uso, assicurarsi che il contenitore di stoccaggio sia ben chiuso.

Risultati

La microdissezione produrrà campioni A/S e F/V con spessori relativamente uniformi che possono essere montati su un dispositivo di prova biassiale (commerciale). L'analisi istologica del foglietto intatto e dei due strati sezionati verificherà se il tessuto è stato correttamente separato lungo il confine tra spongiosa e fibrosa (Figura 7). Inoltre, le micrografie istologiche possono essere utilizzate per determinare gli spessori degli strati di tessuto e le frazioni di massa costituenti u...

Discussione

I passaggi critici per il protocollo includono: (i) la microdissezione dello strato, (ii) il montaggio del tessuto, (iii) il posizionamento del marcatore fiduciale e (iv) la configurazione pSFDI. La microdissezione a strati appropriata è l'aspetto più importante e difficile del metodo qui descritto. Prima di avviare un'indagine che utilizza questa tecnica, il dissettore (i) dovrebbe avere una pratica a lungo termine con la tecnica di microdissezione e tutti e tre i volantini TV. Il dissettore deve garantire che i campi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Solution, Neutral Buffered	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Alconox Detergent	Alconox		cleaning compound
BioTester - Biaxial Tester	CellScale Biomaterials Testing		1.5 N Load Cell Capacity
Cutting Mat	Dahle	B0027RS8DU
Deionized Water	N/A
Fine-Tipped Tool	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
Forceps - Curved	Scientific Labwares	16122
Forceps - Thick	Scientific Labwares	161001078
Forceps - Thin	Scientific Labwares	16127
LabJoy	CellScale Biomaterials Testing	Version 10.66
Laser Displacement Sensor	Keyence	IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	Version 2020a
Micro Scissors	HTI Instruments	CAS55C
Pipette	Belmaks	360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device	N/A		Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.
Scalpel	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)	VWR International	H3515541105024
Surgical Pen	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	Business Source	BSN32351
Wax Board	N/A		Made in-house using modeling wax and baking tray
Weigh Boat	Pure Ponta	mdo-azoc-1030