이축 기계적 특성화 및 미세 구조 정량화를 위한 Tricuspid 밸브 전단지의 층 미세 해부

요약

이 프로토콜은 이축 기계적 특성화, 편광 공간 주파수 영역 이미징 기반 콜라겐 정량화 및 트리쿠스피드 밸브 전단지의 미세 해부를 설명합니다. 제공된 방법은 전단지 레이어가 전체 론적 전단지 동작에 어떻게 기여하는지 설명합니다.

초록

트리쿠스피드 밸브 (TV)는 우심방에서 우심실로 산소가 공급되지 않은 혈액의 단방향 흐름을 조절합니다. TV는 세 개의 전단지로 구성되어 있으며 각 전단지는 독특한 기계적 동작을 가지고 있습니다. 세 개의 TV 전단지 사이의 이러한 변형은 심방 (A), 해면첩 (S), 섬유사 (F) 및 심실 (V) 인 네 개의 해부학 적 층을 조사함으로써 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 층들은 세 개의 TV 전단지에 모두 존재하지만, 각각의 기계적 거동에 더 많은 영향을 미치는 두께와 미세 구조 구성 요소에는 차이가 있습니다.

이 프로토콜에는 층별 차이점을 설명하는 네 가지 단계가 포함되어 있습니다 : (i) 손상되지 않은 TV 전단지의 기계적 및 콜라겐 섬유 건축 거동을 특성화하고, (ii) TV 전단지의 복합 층 (A / S 및 F / V)을 분리하고, (iii) 복합 레이어에 대해 동일한 특성화를 수행하고, (iv) 사후 촬영을 수행합니다. 조직학 평가. 이 실험 프레임 워크는 고유하게 손상되지 않은 TV 조직을 각각의 복합 층과 직접 비교할 수있게합니다. 결과적으로, TV 전단지의 미세 구조 및 생체 역학 기능에 관한 자세한 정보는이 프로토콜을 통해 수집 될 수 있습니다. 이러한 정보는 잠재적으로 TV 질환의 임상 치료를 위한 지침을 제공하고자 하는 TV 계산 모델을 개발하는 데 사용될 수 있다.

서문

TV는 심장의 우심방과 우심실 사이에 있습니다. 심장 주기 전반에 걸쳐 TV는 TV 전단지 (TVAL), TV 후부 전단지 (TVPL) 및 TV 중격 전단지 (TVSL)의 순환 개폐를 통해 단방향 혈류를 조절합니다. 이 전단지는 복잡하며 심방 (A), 해면질 (S), 섬유사 (F) 및 심실 (V)의 네 가지 해부학 적 층을 가지고 있으며 독특한 미세 구조 구성 요소가 있습니다. 심방과 심실의 엘라스틴 섬유는 기계적 하중 후 변형되지 않은 기하학으로 조직을 복원하는 데 도움이됩니다¹. 대조적으로, 섬유사는 전단지²의 하중 지지 능력에 기여하는 물결 모양의 콜라겐 섬유의 조밀 한 네트워크를 함유한다. 주로 글리코사미노글리칸으로 구성된 스폰지오사는 심장 판막 기능³ 동안 전단지층 사이의 전단을 가능하게 하는 가설을 세웠다. 세 가지 전단지 유형 모두 해부학 적 층이 동일하지만 층의 두께와 구성 비율에 차이가 있으며 전단지 별 기계적 행동에 영향을 미칩니다.

연구자들은 평면 기계적 특성화, 조직 형태 학적 평가 및 콜라겐 섬유 아키텍처의 광학 특성화를 사용하여 TV 전단지의 특성을 탐구했습니다. 예를 들어, 평면 이축 기계....

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 오클라호마 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 동물 조직은 USDA가 승인 한 도살장에서 획득했습니다.

1. 이축 기계적 특성화

1. 조직 준비
   1. 냉동실, 면도날, 수술 펜, 포셉, 탈 이온화 (DI) 물이 든 피펫 및 절단 매트에서 TV 전단지를 검색하십시오. 실온 DI 물 2-3 방울을 사용하여 TV 전단지를 해동하십시오.
      참고: DI 물은 층 미세 해부를위한 PBS 유도 어려움을 피하기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS) 대신 사용됩니다.
   2. 시편을 심실 층 (즉, 화음 삽입이있는 표면)이 위쪽을 향하게하여 절단 매트 위에 평평하게 놓습니다. 반경 방향이 Y 방향과 정렬되고 원주 방향이 X 방향과 정렬되도록 시편을 배치합니다.
      참고: 원주 방향은 밸브의 둘레를 따라 배향됩니다.
   3. 조직의 화음 삽입 위치를 검사하십시오. 매우 얇은(즉, 투명한) 영역을 피하면서 큰 코드 삽입을 최소화하면서 이상적으로는 ~12mm 크기의 영역을 결정합니다(그림 1).
   4. 심방 표면(즉, 화음 삽입이 없는 표....

결과

미세 해부는 (상용) 이축 테스트 장치에 장착 할 수있는 비교적 균일 한 두께의 A / S 및 F / V 표본을 생산합니다. 무손상 전단지와 두 해부된 층의 조직학 분석은 조직이 해면질과 섬유사 사이의 경계를 따라 정확하게 분리되었는지를 검증할 것이다(도 7). 추가적으로, 조직학 현미경 사진은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 조직층 두께 및 구성 질량 분율을 결정하는데 사용될 수 .......

토론

프로토콜에 대한 중요한 단계는 (i) 층 미세 해부, (ii) 조직 장착, (iii) 신탁 마커 배치, 및 (iv) pSFDI 셋업을 포함한다. 적절한 층 미세해부는 본원에 기재된 방법의 가장 중요하고 어려운 측면이다. 이 기술을 활용한 조사를 시작하기 전에, 해체(들)는 미세 해부 기술과 세 개의 TV 전단지를 모두 사용하여 장기적인 연습을 해야 한다. 디스섹터는 복합 층 시편이 충분히 크고 (>3.3mm) 균일 한 두께를 갖도.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Solution, Neutral Buffered	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Alconox Detergent	Alconox		cleaning compound
BioTester - Biaxial Tester	CellScale Biomaterials Testing		1.5 N Load Cell Capacity
Cutting Mat	Dahle	B0027RS8DU
Deionized Water	N/A
Fine-Tipped Tool	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
Forceps - Curved	Scientific Labwares	16122
Forceps - Thick	Scientific Labwares	161001078
Forceps - Thin	Scientific Labwares	16127
LabJoy	CellScale Biomaterials Testing	Version 10.66
Laser Displacement Sensor	Keyence	IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	Version 2020a
Micro Scissors	HTI Instruments	CAS55C
Pipette	Belmaks	360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device	N/A		Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.
Scalpel	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)	VWR International	H3515541105024
Surgical Pen	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	Business Source	BSN32351
Wax Board	N/A		Made in-house using modeling wax and baking tray
Weigh Boat	Pure Ponta	mdo-azoc-1030