이축 기계적 특성화 및 미세 구조 정량화를 위한 Tricuspid 밸브 전단지의 층 미세 해부

요약

이 프로토콜은 이축 기계적 특성화, 편광 공간 주파수 영역 이미징 기반 콜라겐 정량화 및 트리쿠스피드 밸브 전단지의 미세 해부를 설명합니다. 제공된 방법은 전단지 레이어가 전체 론적 전단지 동작에 어떻게 기여하는지 설명합니다.

초록

트리쿠스피드 밸브 (TV)는 우심방에서 우심실로 산소가 공급되지 않은 혈액의 단방향 흐름을 조절합니다. TV는 세 개의 전단지로 구성되어 있으며 각 전단지는 독특한 기계적 동작을 가지고 있습니다. 세 개의 TV 전단지 사이의 이러한 변형은 심방 (A), 해면첩 (S), 섬유사 (F) 및 심실 (V) 인 네 개의 해부학 적 층을 조사함으로써 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 층들은 세 개의 TV 전단지에 모두 존재하지만, 각각의 기계적 거동에 더 많은 영향을 미치는 두께와 미세 구조 구성 요소에는 차이가 있습니다.

이 프로토콜에는 층별 차이점을 설명하는 네 가지 단계가 포함되어 있습니다 : (i) 손상되지 않은 TV 전단지의 기계적 및 콜라겐 섬유 건축 거동을 특성화하고, (ii) TV 전단지의 복합 층 (A / S 및 F / V)을 분리하고, (iii) 복합 레이어에 대해 동일한 특성화를 수행하고, (iv) 사후 촬영을 수행합니다. 조직학 평가. 이 실험 프레임 워크는 고유하게 손상되지 않은 TV 조직을 각각의 복합 층과 직접 비교할 수있게합니다. 결과적으로, TV 전단지의 미세 구조 및 생체 역학 기능에 관한 자세한 정보는이 프로토콜을 통해 수집 될 수 있습니다. 이러한 정보는 잠재적으로 TV 질환의 임상 치료를 위한 지침을 제공하고자 하는 TV 계산 모델을 개발하는 데 사용될 수 있다.

서문

TV는 심장의 우심방과 우심실 사이에 있습니다. 심장 주기 전반에 걸쳐 TV는 TV 전단지 (TVAL), TV 후부 전단지 (TVPL) 및 TV 중격 전단지 (TVSL)의 순환 개폐를 통해 단방향 혈류를 조절합니다. 이 전단지는 복잡하며 심방 (A), 해면질 (S), 섬유사 (F) 및 심실 (V)의 네 가지 해부학 적 층을 가지고 있으며 독특한 미세 구조 구성 요소가 있습니다. 심방과 심실의 엘라스틴 섬유는 기계적 하중 후 변형되지 않은 기하학으로 조직을 복원하는 데 도움이됩니다¹. 대조적으로, 섬유사는 전단지²의 하중 지지 능력에 기여하는 물결 모양의 콜라겐 섬유의 조밀 한 네트워크를 함유한다. 주로 글리코사미노글리칸으로 구성된 스폰지오사는 심장 판막 기능³ 동안 전단지층 사이의 전단을 가능하게 하는 가설을 세웠다. 세 가지 전단지 유형 모두 해부학 적 층이 동일하지만 층의 두께와 구성 비율에 차이가 있으며 전단지 별 기계적 행동에 영향을 미칩니다.

연구자들은 평면 기계적 특성화, 조직 형태 학적 평가 및 콜라겐 섬유 아키텍처의 광학 특성화를 사용하여 TV 전단지의 특성을 탐구했습니다. 예를 들어, 평면 이축 기계적 특성화는 조직에 수직 변위를 적용하고 관련 힘을 기록함으로써 생리적 하중을 에뮬레이트하는 것을 추구한다. 그 결과 힘-변위(또는 응력-스트레치) 관찰에 따르면 세 개의 TV 전단지 모두 방사형 조직 방향 ^4,5,6에서 보다 명백한 전단지 특이적 반응과 함께 비선형^, 방향별 기계적 거동을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이러한 전단지-특이적 거동은 표준 조직학적 기술^6,7을 사용하여 관찰된 미세구조적 특성의 차이로부터 기인하는 것으로 여겨진다. 또한, 초고조파 생성 이미징⁶, 소각 광 산란⁸, 및 편광 공간 주파수 영역 이미징⁷ (pSFDI)은 이러한 미세 구조적 특성을 이해하는 것을 목표로하며 관찰 된 조직 수준의 기계적 거동에 영향을 미치는 콜라겐 섬유 배향 및 섬유 크림프의 전단지 특이적 차이를 보여주었습니다. 이 연구는 조직 미세 구조에 대한 우리의 이해와 조직 수준의 행동에서의 역할을 상당히 향상 시켰습니다. 그러나 조직 역학과 기본 미세 구조를 실험적으로 연결하는 데있어 해결해야 할 사항이 많이 남아 있습니다.

최근에이 실험실은 미세 해부 기술⁹를 사용하여 두 개의 복합 층 (A / S 및 F / V)으로 분리 된 TV 전단지 층의 기계적 특성화를 수행했습니다. 그 이전의 연구는 층의 기계적 특성의 차이를 강조하고 층상 미세 구조가 조직 기계적 거동에 어떻게 기여하는지에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이되었습니다. 이 조사는 TV 전단지 미세 구조에 대한 우리의 이해를 향상 시켰지만이 기술에는 몇 가지 한계가있었습니다. 첫째, 복합 층의 특성은 손상되지 않은 조직과 직접 비교되지 않았으며, 이는 역학 - 미세 구조 관계에 대한 완전한 이해의 부족으로 이어졌다. 둘째, 복합층의 콜라겐 섬유 구조는 조사되지 않았다. 셋째, 다른 두 TV 전단지에서 복합 층을 수집하는 데 어려움이 있기 때문에 TVAL의 층 만 조사되었습니다. 본원에 기술된 방법은 이러한 한계를 극복하고 TV 전단지 및 이들의 복합 층의 완전한 특성화를 제공하는 전체론적 특성화 프레임워크를 제공한다.

이 백서에서는 이축 기계 및 미세 구조 특성^10,11,12를 위해 세 개의 TV 전단지를 복합 층 (A / S 및 F / V)으로 분리하는 미세 해부 기술을 설명합니다. 이러한 반복적 프로토콜은 (i) 무손상 전단지의 이축 기계적 테스트 및 pSFDI 특성화, (ii) 복합 TV 층을 신뢰성 있게 획득하기 위한 신규하고 재현 가능한 미세 해부 기술, 및 (iii) 복합 TV 층의 이축 기계적 테스트 및 pSFDI 특성화를 포함한다. 조직을 기계적 시험을 위해 다양한 힘 비율로 이축 인장 하중에 노출시켰다. 이어서, pSFDI를 사용하여 다양한 로딩된 구성에서 콜라겐 섬유 배향 및 정렬을 결정하였다. pSFDI는 천연 콜라겐 섬유 아키텍처를 보존하고, 부하 의존적 분석을 허용하며, 초고조파 생성 이미징 또는 소각 광산란과 같은 콜라겐 섬유 아키텍처 분석을 위해 조직을 고정하거나 맑게 해야 하는 일반적인 필요성을 회피합니다. 마지막으로, 조직은 조직 미세조직을 시각화하기 위해 표준 조직학 기술을 사용하여 준비되었다. 이 반복적이고 전체적인 프레임 워크는 TV 전단지의 기계적 및 미세 구조적 특성을 복합 층과 직접 비교할 수있게합니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 오클라호마 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 동물 조직은 USDA가 승인 한 도살장에서 획득했습니다.

1. 이축 기계적 특성화

1. 조직 준비
   1. 냉동실, 면도날, 수술 펜, 포셉, 탈 이온화 (DI) 물이 든 피펫 및 절단 매트에서 TV 전단지를 검색하십시오. 실온 DI 물 2-3 방울을 사용하여 TV 전단지를 해동하십시오.
      참고: DI 물은 층 미세 해부를위한 PBS 유도 어려움을 피하기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS) 대신 사용됩니다.
   2. 시편을 심실 층 (즉, 화음 삽입이있는 표면)이 위쪽을 향하게하여 절단 매트 위에 평평하게 놓습니다. 반경 방향이 Y 방향과 정렬되고 원주 방향이 X 방향과 정렬되도록 시편을 배치합니다.
      참고: 원주 방향은 밸브의 둘레를 따라 배향됩니다.
   3. 조직의 화음 삽입 위치를 검사하십시오. 매우 얇은(즉, 투명한) 영역을 피하면서 큰 코드 삽입을 최소화하면서 이상적으로는 ~12mm 크기의 영역을 결정합니다(그림 1).
   4. 심방 표면(즉, 화음 삽입이 없는 표면)이 위쪽을 향하도록 시편을 뒤집습니다. 원주 및 방사형 전단지 방향이 각각 X축 및 Y축과 정렬되어 있는지 확인합니다.
   5. 1.1.3단계에서 확인된 큰 화음 삽입 또는 얇은 영역을 피하는 전단지 조직에서 정사각형 12 x 12mm 표본을 절단합니다. 포셉으로 전단지 조직의 손질된 부분을 제거하고 폐기물 용기에 넣으십시오.
      1. 큰 화음 삽입을 완전히 피할 수 없다면 조직이 사각형 표본의 가장자리를 따라 오도록 조직을 자릅니다. 화음 삽입을 피하는 것은 나중에 미세 해부를위한 문제를 예방하는 데 도움이되므로 중요합니다.
   6. 수술용 펜을 사용하여 오른쪽 상단 모서리에 작은 점을 배치하여 표본의 방향을 추적합니다. 잉크를 약 30초 동안 건조시킵니다.
   7. 심실 표면(즉, 코드 삽입이 있는 표면)이 위쪽을 향하도록 시편을 뒤집습니다. 전단지에서 화음을 스트레칭하고 면도날을 사용하여 삽입 위치 근처를 잘라 조직 뒤쪽의 화음 부착물을 다듬습니다. 심방 표면(즉, 매끄러운 표면)이 위쪽을 향하도록 시편을 다시 뒤집습니다.
2. 두께 측정
   1. 비접촉 레이저 변위 센서를 검색합니다. 트리밍된 조직 근처의 절단 매트의 평평한 부분에 변위 센서를 제로로 고정시킵니다.
      주의: 레이저를 눈에 직접 비추지 마십시오.
   2. 레이저를 시편의 중앙 영역 위에 놓습니다. 전단지 표면 아래에 갇힌 공기는 측정 오류를 일으킬 수 있으므로 제거하십시오. 갇힌 공기를 방출하려면 핀셋을 사용하여 거품을 조직의 가장자리로 밀어 넣거나 조직의 한쪽 모서리를 들어 올립니다.
   3. 변위 센서의 디스플레이에 표시된 두께를 기록합니다. 표본의 다른 위치에서 두 번 더 측정을 반복합니다.
   4. 이전 단계에서 기록한 세 가지 측정값을 사용하여 평균 전단지 두께를 계산합니다. 이축 기계적 특성화 프로토콜을 생성할 때 이 값을 사용하십시오.
3. 이축 테스터 설정 및 조직 장착
   1. 시험 시스템의 지침에 따라 37°C에서 DI 수조를 준비하여 생체 내 생리학적 조건 하에서 온도를 보장한다.
   2. 포셉, 조직 표본, 장착 하드웨어, 미세 팁 공구, 액체 시아 노 아크릴레이트 접착제 및 검은 색 페인트 유리 비드 (직경 : 300-500 μm)를 검색하십시오.
      주: 장착 하드웨어에는 주석, 장착 브리지 및 장착 고무가 포함됩니다.
   3. 조직 표본을 테스트 시스템에 장착합니다. 조직의 원주 방향이 X 방향과 일치하는지 확인하고, 이는 이전에 단계 1.1.6에서 배치된 점에 의해 보조될 수 있다.
      참고 : 여기에 사용 된 색조는 전체 조직 가장자리 길이에 걸쳐 고르게 이격되어야합니다. 유효 모서리 길이는 무손상 조직의 경우 10mm, 복합 층의 경우 >3.3mm로 설정됩니다.
4. 신탁 마커 배치
   1. 탑재된 조직의 중앙 삼분의 일 사각형 영역을 확인합니다. 신탁 마커 배치를 위해이 영역의 대략적인 모서리를 사용하십시오.
   2. 유리 구슬을 개방 된 계량 보트에 놓고 별도의 계량 보트에 액체 시아 노 아크릴레이트 접착제의 작은 풀을 만듭니다. 미세 팁이 달린 공구의 상단을 소량의 접착제로 코팅하십시오. 무게 보트의 측면에 과도한 접착제를 닦으십시오.
   3. 접착제로 코팅된 팁을 조직에 부드럽게 눌러 중앙 삼분의 일 사각형 배열의 한쪽 모서리를 만듭니다. 포셉을 사용하여 유리 구슬을 잡고 조심스럽게 접착제 점 위에 놓습니다. 이축 테스트 장치의 카메라를 사용하여 비드 배치에 도움을줍니다.
   4. 사각형 배열이 완료될 때까지 세 개의 추가 비드에 대해 1.4.2단계와 1.4.3단계를 반복합니다. 구슬이 단단히 부착되어 있고 각각의 접착제 점이 만지거나 서로 달라 붙지 않도록하십시오. 조직을 수조로 낮추기 전에 접착제를 말리십시오.
      1. 구슬이 서로 붙어있는 경우 접착제가 건조 될 때까지 기다린 다음 포셉을 사용하여 구슬이나 접착제를 부드럽게 잡고 조직에서 떼어냅니다.
         참고: 접착제와 비드가 벗겨져 비드 배치를 다시 시도할 수 있어야 합니다.
5. 사전 조정
   1. 힘 제어 사전 컨디셔닝 프로토콜을 생성하여, 가장자리 길이와 두께를 가진 조직이 40N/m의 피크 막 장력 T _피크에 등축 로딩의 여섯 번의 반복을 거치고, 3% × T_피크¹⁰의 프리로드와 30초의 스트레치 및 회복 시간을 각각 겪게 된다.
      1. 향후 계산을 위해 데이터를 임시로 저장할 임의 테스트 디렉터리를 구성합니다. 로딩 속도를 4.42 N/m으로 설정합니다.
      2. Preconditioning0이라는 이름으로 새 테스트 매개 변수 집합을 구성합니다. X축 및 Y축 제어 모드를 강제 설정하여 제어 기능을 단계별로 설정합니다. 부하 크기를 T_피크와 관련된 힘으로 정의, 즉 f 피크 = T_피크 · L. 프리로드 크기를 첫 번째 반복에 대해서만 f_피크의 3%로 정의하고 스트레치 지속 시간과 복구 지속 시간을 모두 30초로 정의합니다. 반복 횟수를 10으로 정의합니다.
         참고: 계산된 피크 첫 번째 Piola-Kirchhoff 응력, 즉 P_피크 = T_peak/t는 더 얇은 조직의 경우 200kPa를 초과할 수 있으며, 이로 인해 테스트 중에 조직이 찢어질 수 있습니다. 이들 시나리오에서, 피크 막 장력은 200 kPa의 최대 첫 번째 피올라-키르히호프 응력으로 조정되었다.
   2. 사전 조정 프로토콜을 실행합니다. 사전 조정 후, 이축 테스트 프로토콜에 사용하기 위해 시편의 현재 X- 및 Y 치수를 기록하십시오.
6. 이축 테스트 프로토콜의 생성 및 실행
   1. 원하는 변위율로 사전 조정 후 구성에서 피크 등축 구성을 달성하는 데 필요한 시간을 결정합니다. 일정한 변위율을 고려하여 나머지 로딩 비율에 대한 로딩 시간을 계산합니다(즉, T XX:T YY = 1:0.5 및 T_XX:T _YY = 0.5:1).
   2. 선형 액추에이터를 수동으로 조깅하여 주어진 하중 비율에 대한 목표 힘을 일치시킵니다. 이 과정을 반복하고 모든 로딩 비율에 대한 리플릿 치수를 기록하십시오.
   3. 단계 1.6.1에서 결정된 시간 내에 사후 사전 컨디셔닝된 구성으로부터 단계 1.6.2에 기록된 구성(즉, T_XX:T_YY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1)으로 조직을 이축 대체하는 변위 제어 시험 프로토콜을 준비한다. 각 프로토콜에 기계적 동작의 반복성을 위해 세 번의 로딩/언로딩 사이클이 있는지 확인하십시오.
      1. 향후 계산을 위해 데이터를 저장할 테스트 디렉터리를 구성합니다. 디렉토리 이름이 현재 표본과 일치하는지 확인하십시오.
      2. 이름이 1:1인 새 테스트 매개변수 세트를 구성하고, X축 및 Y축 제어 모드를 변위로 설정하고, 제어 기능을 램프로 설정합니다. 스트레치 크기를 1.6.1단계에서 기록된 구성으로 정의합니다. 프리로드 크기를 첫 번째 반복에 대해서만 f_피크 의 3%로 정의하고 스트레치 지속 기간과 회복 지속 시간을 모두 단계 1.6.1에 기록된 시간으로 정의합니다. 반복 횟수를 3으로 정의합니다.
      3. 프리로드 크기를 적용되지 않은 것으로 정의하는 경우를 제외하고 나머지 로딩 비율(즉, T XX:T YY = 1:0.5 및 T_XX:T _YY = 0.5:1)에 대해 1.6.3.2단계를 반복한다. 스트레치 크기, 스트레치 지속 시간 및 회복 지속 시간이 1.6.2 단계에서 기록한 것과 일치하는지 확인합니다.
         참고: 최종(세 번째) 주기의 데이터만 응력 및 변형 분석에 사용됩니다.
   4. 변위 제어 프로토콜을 실행합니다. 이축 검사가 끝나면 조직을 사전 조정 된 치수로 되돌립니다.
      참고 : 조직이 찢어지기 시작하면 즉시 검사를 중단해야합니다.
7. 추가 특성화
   1. 조직을 DI 물에 담그고 이축 테스트 시스템에 장착하십시오. 단계 2.1-2.3에 설명된 대로 pSFDI 이미징을 수행합니다.
   2. 조직을 마운트 해제합니다. 손상되지 않은 조직인 경우 단계 3.1-3.7에 설명된 미세 해부를 진행하십시오. 그렇지 않은 경우 3.7 단계에 따라 조직학을 수집하십시오.
      참고 : DI 수조는 같은 날 이내에 후속 특성화에 사용할 수 있습니다.
   3. 미세 해부 후 획득한 A/S 및 F/V 층으로 1.2-1.7단계를 반복합니다(3.1-3.6단계).
      참고 : 레이어에 대한 테스트 프로토콜을 반복하면 손상되지 않은 조직을 자체 레이어와 직접 비교할 수 있습니다.
8. 이축 테스트 데이터 사후 처리 절차
   1. 획득된 이축 테스트 이미지의 디지털 이미지 상관 관계를 수행하여 시간 종속 마커 위치를 결정합니다. Eq (1)를 통해 신탁 마커 변위를 계산합니다. ⁵
      (1)
      본원에서, xi(t), Xi, 및 _di(t)는 시간-의존적 위치, 초기(reference) 위치, 및 마커 i의 변위이다.
   2. Eq (2)⁵에 나타낸 바와 같이 신탁 마커를 4 노드 쌍선형 유한 요소로 간주하여 변형 구배 F를 계산하십시오.
      (2)
      여기서 _BCI 및 _BYi는 각각 X- 및 Y 방향에서 노드 i에 대한 형상 함수의 유도체이고, ui(t) 및 vi(t)는 di(t)의 성분이다: di(t) = [ui(t), vi(t)]^T.
   3. Eq (3)⁵에서와 같이 기록된 힘을 사용하여 적용된 첫 번째 Piola-Kirchhoff 응력 P를 계산합니다.
      (3)
      _PXX 및 _PIY는 P의 X- 및 Y-성분이고; L 및 t는 조직 가장자리 길이 및 두께이고; f X 및 f_{Y는 X}- 및 Y 방향으로 기록된 힘이다.
   4. 필요에 따라 다른 변형 및 응력 측정을 결정하십시오.¹³ 여기에는 우측 코키-그린 변형 C = F T/F, 그린-라그랑주 균주 E = (C - I)/2, 코시 응력 σ = J-1 PF^T, 및 두 번째 피올라-키르히호프 응력 S = ^F-1P가 포함됩니다.
      참고: 여기서, I는 이차 동일성 텐서이고, J = det(F)는 변형 구배 F의 자코비안이다.

2. 편광 공간 주파수 영역 이미징

1. 시스템 준비
   참고: 원하는 경우, 신탁 마커는 다음 단계 이전에 조직으로부터 제거될 수 있다.
   1. pSFDI 장치를 시편 위에 중앙에 놓습니다(그림 2). 프로젝터를 켜고 490nm(시안색) 조명으로 시편을 비춥니다.
   2. 카메라 소프트웨어를 열고 카메라의 시야각을 검사합니다. 시편이 프레임의 중앙에 있고 시야각 내에 완전히 포함되어 있는지 확인하십시오.
   3. 장착된 시편이 손상되지 않은 전단지인 경우 DLP(디지털 광 처리) 프로젝터 밝기를 조정하여 조직 표면에 눈부심 없이 조직이 완전히 비춰지도록 합니다. 시편이 복합 층 중 하나인 경우 밝기를 조정하지 마십시오.
   4. 편광판을 전체 동작 범위에 걸쳐 회전시켜 편광판 렌즈에서 발생할 수 있는 눈부심이나 먼지를 감지합니다. 필요에 따라 극세사 천으로 편광판 렌즈를 조심스럽게 청소하십시오.
2. 데이터 수집
   참고: 다음 데이터 수집은 LabVIEW 또는 Python과 같은 소프트웨어를 사용하여 자동화할 수 있습니다.
   1. 편광자를 홈 위치로 이동(이상적으로 이축 테스트 축 중 하나와 정렬)합니다. 하나의 회색 음영 이미지를 캡처하여 편광판 위치(예: 0°)를 사용하여 컴퓨터에 저장합니다.
   2. 편광자를 5° 회전하고 다른 회색 음영 이미지를 캡처합니다. 이 과정을 반복하여 0° ~ 180° 범위의 37개의 이미지를 5° 단위로 획득합니다.
      참고: 첫 번째 pSFDI 이미징 시퀀스로부터의 이미지는 조직으로부터 원하는 광학 반응을 보장하기 위해 사전 분석될 수 있다. 지침은 2.3단계를 참조하십시오.
   3. pSFDI 이미징 서열을 다른 원하는 조직 구성, 예를 들어 이축 기계적 시험을 위해 고려되는 로딩 프로토콜의 피크 구성에 대해 반복한다.
3. pSFDI 데이터 후처리 절차
   참고: 다음 방법에는 MATLAB 프로그램 언어에 대한 단계가 포함되어 있습니다. 그러나, 임의의 선호되는 언어(예를 들어, 파이썬, C++)가 대신 사용될 수 있다.
   1. MATLAB imread() 함수를 사용하여 획득한 37개의 이미지의 픽셀 단위 강도를 포함하는 배열을 구성합니다. 편의를 위해 n×m × 37 3차원 배열로 정렬합니다. 여기서 n과 m은 두 축을 따른 픽셀 수입니다.
   2. 사용자 정의 grabit () 함수를 사용하여 관심 조직 영역(ROI)을 정의합니다.
   3. Eq (4)에서와 같이 3항 푸리에 시리즈를 사용하여 각 ROI 픽셀에 대한 강도 대 편광자 각도 데이터를 맞춥니다.
      (4)
      여기서, I(θ)는 편광자 각도의 함수로서 픽셀별 강도이고,_bi는 푸리에 상수이다. 표준 선형 최소 제곱 회귀를 사용하여 bi를 결정합니다.
   4. 픽셀 단위 섬유 방향을 I(θ)의 최대값과 연관된 편광자 각도로 결정한다. Eq (5)를 통해 광학 이방성 (DOA)의 정도를 계산하십시오.
      (5)
   5. plot() 및 히스토그램()을 사용하여 획득한 파이버 방향 및 DOA 값을 시각화합니다. 나중에 사용할 수 있도록 처리된 결과를 저장합니다.

3. 트리쿠스피드 밸브 전단지 복합 층의 미세 해부

1. 왁스 보드에 조직 부착
   1. 왁스 보드, DI 물, 피펫, 메스, 마이크로 가위, 얇은 포셉, 곡선 포셉, 두꺼운 포셉 및 핀과 같은 필요한 재료를 수집하십시오.
      참고 :이 유형의 포셉은 해부를 수행 할 때 A / S 층의 얇은 조직을 매우 쉽게 찢을 수 있으므로 치아 나 그립이없는 핀셋 만 사용하십시오.
   2. 이축 테스터로부터 조직을 마운트 해제하고 단계 1.2에서 설명된 레이저 변위 센서를 사용하여 두께를 측정합니다. 조직을 왁스 보드에 놓습니다.
   3. 큰 chordae 삽입을 위해 조직의 심실 측면을 검사하십시오. 이러한 삽입물의 위치는 해부 중에 피하도록 주의한다(보충 그림 S1). 참고로 사진을 찍습니다.
   4. 심방이 위를 향하게하여 왁스 보드에 조직을 평평하게 펴십시오. 핀을 사용하여 보드에 티슈를 부착하십시오.
      1. 조직의 각 모서리에 조직에서 멀리 기울어진 핀 하나를 놓고(더 잘 보기 위해) 조직 타우트를 약간 당깁니다(그림 3A). 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 정렬하십시오. 조직을 장착할 때 핀이 색조에 의해 생성된 구멍 밖에 있는지 확인하십시오.
      2. 핀 배치를 약간 조정하여 조직이 타우트 및 정사각형 구성(그림 3B)으로 되어 조직이 평평하게 놓여 있고 층 미세 해부 중에 이동하지 않도록 합니다.
      3. 필요한 경우 해부 중에 조직의 측면을 따라 핀을 배치하여 조직을 더 늘립니다. 추가 핀을 배치하고 앵글링 할 때 해부 중에 해결해야한다는 것을 명심하십시오.
      4. 유리 비드 신탁 마커를 제거하십시오.
         참고: 다음 단계는 선택 사항입니다. 첨가 된 DI 물은 조직 수분 공급을 유지하고 미세 해부 과정에서 조직이 스스로 달라 붙는 것을 방지합니다.
      5. 피펫을 사용하여 DI 물을 조직 표면에 올려 놓고 거품과 같은 방식으로 조직을 완전히 덮습니다. 해부 전반에 걸쳐 필요에 따라 DI 물을 보충하십시오.
2. 초기 모서리를 만듭니다.
   1. 고정된 시편의 모서리를 선택하여 해부를 시작합니다. 큰 코드 삽입과 매우 얇은 영역을 피하십시오.
   2. 기계 테스트에서 장착 구멍을 따라 메스를 조직 표면 위로 가볍게 드래그하여 A/S 레이어를 절단합니다(그림 3C). 컷의 길이가 5mm 이상이고 컷의 가장자리가 떨어져 나가기 시작하여 아래에 F/V 레이어가 표시되는지 확인합니다.
   3. 얇은 포셉(날카로운 팁 없음)을 사용하여 컷을 따라 단단히 문지르고 컷의 가장자리를 잡아당깁니다(보충 그림 S2).
      1. A/S 레이어의 컷이 분리되기 시작하지 않으면 메스로 동일한 컷을 다시 가볍게 추적하여 이 작업을 시작할 때까지 합니다. 층을 깨끗하게 분리하는 것이 더 어려워 지므로 (A / S 복합 층을 지나서) 조직에 너무 깊게 자르지 않도록주의하십시오.
   4. 3.2단계와 3.2.3단계를 반복하여 첫 번째 컷에 수직인 두 번째 컷을 만듭니다(그림 3D). 두 컷이 연결되어 있고 모서리를 형성하는지 확인하십시오.
      1. 두 컷이 연결되지 않은 경우, 조직의 작은 영역 아래에서 얇은 핀셋을 실행하여 두 컷을 분리합니다(보충 그림 S3). 그런 다음 조심스럽게 가위를 사용하여 조직을 자릅니다.
3. 모서리에서 조직을 껍질을 벗기십시오.
   1. 조직이 F / V 층에서 분리되기 시작할 때까지 얇은 포셉을 사용하여 컷을 따라 문지릅니다. 작은 조직 조각이 분리되면 핀셋으로 잡고 부드럽게 잡아 당겨 복합 층을 더 분리하십시오.
      참고 : 잡을 때 항상 얇은 핀셋의 끝을 조직의 가장자리를 지나쳐 놓으십시오. 그렇지 않으면 실수로 A/S 복합 레이어에 구멍을 뚫을 수 있습니다.
   2. 조직을 계속 껍질을 벗기고 모서리에 만들어진 두 컷의 끝에 도달 할 때까지 솔기를 문지릅니다. 이 과정에서 더 큰 핀셋으로 전환하여 필링 공정을위한 조직을 파악하여 A / S 복합 층의 바람직하지 않은 찢어짐 및 찢어짐을 방지하십시오.
      1. 시도한 첫 번째 모서리에 분리와 관련된 주요 문제가 있는 경우 다른 모서리를 시작점으로 시도합니다(3.2단계로 돌아가기).
4. 상처를 확장하고, 조직을 벗기고, 두 번째 모서리를 만듭니다.
   1. 메스 팁을 각 컷의 아래쪽에 놓고 조직 표면을 따라 가볍게 드래그하여 첫 번째 모서리에 대해 만들어진 두 컷을 확장합니다(그림 4A). 모든 연장 컷이 5mm 이상이고 절단 확장이 원래 컷에 연결되고 주석 또는 봉합사 구멍을 계속 따라가는지 확인하십시오.
      참고: 연장 절단이 너무 깊으면 섬유사의 일부가 A/S 복합 층과 분리되지 않도록 향후 박리를 면밀히 모니터링해야 합니다(그림 5A).
   2. 컷을 계속 연장하고 한쪽이 끝날 때까지 솔기를 문지르는 동안 상단 복합 A/S 레이어를 다시 벗겨냅니다. 조직이 하나의 컷을 따라 완전히 분리 될 것임을 관찰하십시오. A/S와 F/V 복합 레이어 사이의 이음새가 직선인지 확인합니다(그림 4B).
   3. 3.2단계와 3.3단계의 지침을 반복하여 완전히 벗겨진 면의 끝에 수직인 두 번째 모서리를 만듭니다(그림 4C).
5. A/S 레이어를 완전히 분리합니다.
   1. 큰 코드 삽입을 피하면서 나머지 컷을 확장합니다. 첫 번째 모서리에 사용된 문지르기 및 당김 기술을 사용하여 A/S 및 F/V 레이어를 계속 분리합니다. 이 과정에서 발생할 수 있는 몇 가지 고려 사항이나 문제를 기록해 둡니다.
      1. A/S 분리 영역에서 chordae 삽입을 제외합니다(그림 5B), 이 제외로 인해 실험 특성화(>3.3mm)에 충분히 큰 A/S 표본이 허용됩니다.
      2. 조직 눈물 또는 구멍이 형성되면 즉시 조직 분리를 중단하십시오. 핀셋이 잡히지 않도록 하려면 형성되는 구멍에 가위를 놓고 중심에서 조직을 잘라냅니다. 분리의 이음새를 따라 결함이 형성되면 더 이상 찢어지지 않도록 다른 가장자리를 따라 조직을 분리하기 시작합니다 (그림 5C).
      3. 조직을 분리하는 동안 나타날 수 있는 층간 연결을 찾고 찢어질 위험이 높은 조직 분리를 방지합니다(그림 5D). 이것들은 가위를 사용하여 조심스럽게 절단해야하는 얇지 만 강한 가닥이라는 것을 관찰하십시오. A/S 레이어에 구멍을 만들거나 F/V 레이어로 아래쪽으로 절단하면 분리가 고르지 않을 수 있으므로 피하십시오.
      4. A/S 레이어의 가능한 가장 큰 샘플이 분리될 때까지 이 프로세스를 계속합니다. 수술용 펜을 사용하여 샘플의 방향을 표시하십시오(그림 6A).
6. 해부를 마칩니다.
   1. 가위를 사용하여 나머지 조직 가장자리에 대한 분리의 솔기를 따라 절단하십시오 (그림 6B). 이 컷이 가능한 한 분리의 솔기에 가깝는지 확인하십시오.
   2. 분리 된 A / S 복합 층을 절단 매트 위에 평평하게 놓습니다. 필요한 경우 메스를 사용하여 조직의 가장자리를 곧게 펴고 이축 기계 테스트에 적합한 사각형 조직 모양을 만듭니다. A/S 층을 테스트할 준비가 될 때까지 DI 물에 넣습니다.
   3. 왁스 보드에 남아 있는 F/V 레이어의 방향을 표시합니다. A/S 층이 제거된 영역에서 가능한 가장 큰 사각형을 잘라낸 다음(그림 6C) DI 물에 놓습니다.
7. 조직학
   1. 조직학에 사용하기 위해 원주 및 방사형 방향과 정렬된 두 개의 조직 스트립을 절제하십시오. 온전한 레이어와 복합 레이어(예: A/S 및 F/V)에 대해 서로 다른 프로토콜을 사용합니다.
      1. 손상되지 않은 층의 경우 왁스 보드에 고정 된 조직에서 표본을 가져 오십시오. 색조 / 봉합사 구멍 외부의 조직을 사용하십시오.이 부분은 해부되지 않았으며 손상되지 않은 전단지를 나타냅니다.
      2. A/S 및 F/V 복합 레이어의 경우 테스트 및 이미징을 완전히 완료한 후에만 조직학 샘플을 수집합니다. 이축 시험 시스템에서 시편을 분리하고, 조직을 절단 매트 위에 평평하게 놓고, 면도날을 사용하여 원주 및 방사형 스트립을 절제합니다.
   2. 적출 된 스트립을 조직 카세트에 넣고 카세트를 10 % 포르말린에 담그십시오.
   3. 나머지 조직은 버립니다. 세척 화합물을 사용하여 해부 도구를 청소 하십시오 (재료 표 참조).
   4. 고정 24-48 시간 후, 카세트를 에탄올로 옮기면 조직학 처리 및 염색까지 무기한 보관할 수 있습니다.
      참고: 이 조직학적 분석은 미세 해부가 성공적임을 확인할 수 있습니다. 주의: 10% 포르말린은 피부 자극과 심각한 눈 손상을 일으킵니다. 또한 흡입을 통해 알레르기 반응이나 암을 일으킬 수 있습니다. 취급 시에는 장갑, 고글, 실험실 코트와 같은 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드와 같이 통풍이 잘되는 공간에서만 사용하십시오. 사용하지 않을 때는 보관 용기가 단단히 닫혀 있는지 확인하십시오.

결과

미세 해부는 (상용) 이축 테스트 장치에 장착 할 수있는 비교적 균일 한 두께의 A / S 및 F / V 표본을 생산합니다. 무손상 전단지와 두 해부된 층의 조직학 분석은 조직이 해면질과 섬유사 사이의 경계를 따라 정확하게 분리되었는지를 검증할 것이다(도 7). 추가적으로, 조직학 현미경 사진은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 조직층 두께 및 구성 질량 분율을 결정하는데 사용될 수 ...

토론

프로토콜에 대한 중요한 단계는 (i) 층 미세 해부, (ii) 조직 장착, (iii) 신탁 마커 배치, 및 (iv) pSFDI 셋업을 포함한다. 적절한 층 미세해부는 본원에 기재된 방법의 가장 중요하고 어려운 측면이다. 이 기술을 활용한 조사를 시작하기 전에, 해체(들)는 미세 해부 기술과 세 개의 TV 전단지를 모두 사용하여 장기적인 연습을 해야 한다. 디스섹터는 복합 층 시편이 충분히 크고 (>3.3mm) 균일 한 두께를 갖도...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Solution, Neutral Buffered	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Alconox Detergent	Alconox		cleaning compound
BioTester - Biaxial Tester	CellScale Biomaterials Testing		1.5 N Load Cell Capacity
Cutting Mat	Dahle	B0027RS8DU
Deionized Water	N/A
Fine-Tipped Tool	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
Forceps - Curved	Scientific Labwares	16122
Forceps - Thick	Scientific Labwares	161001078
Forceps - Thin	Scientific Labwares	16127
LabJoy	CellScale Biomaterials Testing	Version 10.66
Laser Displacement Sensor	Keyence	IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	Version 2020a
Micro Scissors	HTI Instruments	CAS55C
Pipette	Belmaks	360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device	N/A		Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.
Scalpel	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)	VWR International	H3515541105024
Surgical Pen	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	Business Source	BSN32351
Wax Board	N/A		Made in-house using modeling wax and baking tray
Weigh Boat	Pure Ponta	mdo-azoc-1030