Caratterizzazione di proteine transmembrana di vescicole extracellulari singole mediante citometria a nano-flusso

Riepilogo

L'ultima generazione di strumenti di caratterizzazione dei veicoli elettrici è in grado di eseguire l'analisi di singoli veicoli elettrici su più parametri contemporaneamente. La citometria a nano-flusso misura tutte le particelle biologiche più grandi di 45 nm senza etichettatura e identifica le caratteristiche specifiche delle sottopopolazioni mediante una varietà di tecniche di etichettatura fluorescente.

Abstract

La caratterizzazione di singole particelle è diventata sempre più rilevante per la ricerca sulle vescicole extracellulari, passando dalle tecniche di analisi di massa e dall'analisi delle particelle di prima generazione a misurazioni multiparametriche complete come la citometria a nano-flusso (nFCM). nFCM è una forma di citometria a flusso che utilizza strumentazione specificamente progettata per l'analisi delle nanoparticelle, consentendo di caratterizzare migliaia di EV al minuto sia con che senza l'uso di tecniche di colorazione. Il rilevamento a dispersione laterale (SS) ad alta risoluzione consente di determinare dimensioni e concentrazione per tutte le particelle biologiche più grandi di 45 nm, mentre il rilevamento simultaneo a fluorescenza (FL) identifica la presenza di marcatori marcati e target di interesse. Le sottopopolazioni marcate possono quindi essere descritte in unità quantitative di particelle/ml o come percentuale delle particelle totali identificate dalla dispersione laterale.

Qui, le EV derivate da terreni di coltura cellulare condizionati (CCM) sono etichettate sia con un colorante lipidico, per identificare le particelle con una membrana, sia con anticorpi specifici per CD9, CD63 e CD81 come marcatori EV comuni. Le misurazioni del materiale di confronto, uno standard di concentrazione e uno standard di dimensioni delle nanosfere di silice, nonché il materiale campione etichettato vengono analizzati in un'analisi di 1 minuto. Il software viene quindi utilizzato per misurare la concentrazione e il profilo di distribuzione dimensionale di tutte le particelle, indipendentemente dall'etichettatura, prima di determinare le particelle positive per ciascuna delle etichette.

Il rilevamento simultaneo di SS e FL può essere utilizzato in modo flessibile con molte diverse fonti EV e target di etichettatura, sia esterni che interni, descrivendo i campioni di veicoli elettrici in modo completo e quantitativo.

Introduzione

Cosa sono i veicoli elettrici?
Le vescicole extracellulari (EV) sono il termine collettivo per una serie di particelle membranose derivate da cellule integrali a molte normali attività cellulari e tissutali. Il loro impatto su una vasta gamma di campi scientifici e la loro potenziale rilevanza clinica hanno guidato una crescita della ricerca sui veicoli elettrici e dell'interesse industriale¹. La ricerca sulle piccole EV (sEV) si concentra principalmente sugli esosomi, particelle di 40-100 nm che iniziano la formazione nei primi endosomi prima della maturazione e rilasciano attraverso la fusione di corpi multi-vescicolari (MVB) alla membrana plasmatica, così come le microvescicole, che germogliano direttamente dalla membrana plasmatica formando particelle di 80-1.000 nm². Una terza popolazione di EV sono corpi apoptotici, particelle di 50-1.500 nm formate durante la morte cellulare, il che significa che la loro proporzione relativa rispetto ad altre EV può essere notevolmente variabile³.

Poiché le caratteristiche EV possono rappresentare cambiamenti che si verificano nella loro cellula / tessuto di origine, esiste il potenziale per il loro uso nella diagnostica. Varie analisi "omiche" hanno iniziato a identificare marcatori di origine cellulare e stato di malattia, che possono consentire una valutazione non invasiva dei pazienti utilizzando fonti EV come plasma sanguigno/siero, urina, saliva e liquido cerebrospinale (CSF)^4,5. Una forza trainante dietro queste innovazioni legate ai veicoli elettrici sono le nuove tecniche di caratterizzazione che superano i limiti precedenti.

La necessità e le sfide della caratterizzazione dei singoli veicoli elettrici
La caratterizzazione di singoli EV sta diventando sempre più importante sia per la convalida che per la descrizione degli isolati di EV, nonché per chiarire le caratteristiche chiave di queste nanoparticelle per la progressione delle terapie e della diagnostica basate su EV⁶. A seconda della fonte EV e dell'uso previsto, l'analisi della purezza, spesso descritta come un rapporto tra particelle EV e non EV o come EV per proteine libere, può richiedere quantità significative di dati da più analisi⁷.

Le misurazioni del conteggio e del dimensionamento delle particelle nelle pubblicazioni EV hanno precedentemente fatto molto affidamento sul tracciamento delle nanoparticelle (NTA), sul rilevamento degli impulsi resistivi (RPS) e sulla microscopia elettronica (EM)². Gli standard NTA e RPS non sono in grado di distinguere i veicoli elettrici dalle particelle non EV e hanno i loro avvertimenti come il throughput lento⁸ e il limite inferiore di rilevamento inadatto visto con NTA 9,10,11.

Le tetraspanine CD9, CD63 e CD81 sono state storicamente importanti identificatori per la presenza di EV negli isolamenti/preparati EV. Comunemente, le tecniche di western blotting (WB) e dot blotting sono utilizzate per mostrare l'arricchimento di queste proteine negli isolati EV rispetto al lisato cellulare¹². Tuttavia, la mancanza di quantificazione di questi metodi e l'eterogeneità di questi marcatori EV, per quanto riguarda sia la visualizzazione all'interno delle sottopopolazioni EV che la variazione correlata a cellule, tessuti o pazienti, incoraggia tecniche analitiche avanzate, che unificano la caratterizzazione fisica e fenotipica¹³.

La citometria a nano-flusso come tecnica completa di analisi EV
Determinare le vere concentrazioni di EV richiede l'identificazione di particelle intatte e un marcatore universale, in particolare in isolati di particelle complesse, con una risoluzione in grado di rilevare tutti i veicoli elettrici distinguendoli dalle particelle non EV¹⁴.

La citometria a nanoflusso (nFCM) è una tecnica che consente l'analisi non etichettata di particelle di dimensioni comprese tra 45-1.000 nm e contemporaneamente utilizza l'etichettatura e il rilevamento fluorescenti per identificare le sottopopolazioni di particelle. Una distinzione chiave dalla citometria a flusso convenzionale è l'uso di apparecchiature dedicate all'analisi delle nanoparticelle, che consentono la massima risoluzione¹⁵. L'analisi EV, che utilizza strumentazione di flusso convenzionale riproposta per l'analisi di piccole particelle, sta migliorando, ma fatica ancora a raggiungere la risoluzione per rilevare e analizzare <100 nm EV^16,17. La citometria a flusso basata su perline è un ulteriore adattamento spesso impiegato per l'analisi EV, ma questo elimina la possibilità di rilevamento di singole particelle e introduce distorsioni basate sulla cattura¹⁸.

Beneficiando di un limite inferiore di rilevamento di ~45 nm nel canale di dispersione laterale (SS) per l'analisi EV, nFCM utilizza l'attivazione SS. Questo può essere pensato come analisi "prima particella" in quanto significa che gli eventi devono fornire un segnale SS, superando una soglia stabilita prima dell'analisi dell'intensità di fluorescenza. Ciò rimuove i falsi positivi come le aggregazioni degradate di membrane e fluorofori e focalizza l'analisi sugli EV intatti¹⁵. Le misurazioni SS sono anche utilizzate per dimensionare le singole particelle rispetto a uno standard di nanosfera di silice a quattro modali¹⁹. Le misure di fluorescenza sono effettuate su due ulteriori rivelatori che consentono tre misurazioni simultanee per ciascuna particella per descrivere la concentrazione delle particelle, le dimensioni e la presenza di marcatori o altri bersagli di interesse al fine di identificare le sottopopolazioni EV²⁰.

Nell'esperimento seguente, le misurazioni SS e fluorescenti (FL) vengono utilizzate per misurare particelle di >45 nm, mostrare il sottoinsieme di EV positivi alla membrana e identificare la presentazione di CD9, CD63, CD81 sulle sottopopolazioni di EV. Sono descritte sia la concentrazione di queste sottopopolazioni che il loro rapporto come parte delle particelle totali misurate da SS, così come i loro profili dimensionali.

Protocollo

1. Configurazione dello strumento nFCM e misure degli standard nFCM

NOTA: vengono effettuate tre misurazioni prima di iniziare l'acquisizione dei dati per i campioni per convalidare il corretto allineamento dello strumento nFCM e fornire un confronto efficace tra gli strumenti. Questi sono lo standard di concentrazione / controllo di qualità (QC), lo standard di dimensione e un vuoto.

1. Diluire le sfere QC 1:100 in acqua distillata in un tubo appropriato da 0,6 μL e porle nella baia di carico.
2. Dal menu a discesa Flusso di campionamento, selezionare Boosting per introdurre il campione QC nel sistema per 45 s per sostituire completamente la precedente soluzione di campionamento/pulizia.
   1. Durante il boosting, impostare la potenza del laser sul modello preimpostato per le perline QC "250 nm FL QC standard", ad esempio, 10/40 mW per il laser blu, 20/50 mW per il laser rosso, con 0,2% di decadimento SS.
3. Selezionare Pressione di campionamento dallo stesso menu in basso per ridurre la pressione del sistema.
4. Impostare la pressione di campionamento automatico su 1,0 kPa per mantenere una pressione costante.
5. Avviare l'analisi di 1 minuto selezionando Tempo di registrazione dai controlli di acquisizione. I dati verranno tracciati sul dot-plot mostrando una scala logaritmica per l'intensità SS e un'intensità FL selezionata.
6. Inserire il nome del file e la diluizione del campione prima di salvare il file.
7. Selezionare scarico per rimuovere il tubo dalla baia di carico. Sostituire con 150 μL di soluzione detergente e pulire per >30 s selezionando Potenziamento prima di rimuovere la soluzione detergente selezionando Scarica.
   1. Rimuovere la soluzione detergente in eccesso dalla punta capillare utilizzando un tubo contenente 150 μL di acqua.
8. Diluire le sfere standard di dimensioni 1:100 in acqua e caricare 100 μL nella baia di carico, prima di aumentare il campione per 45 s.
9. Impostare la potenza del laser sul modello preimpostato "S16 exo 68-155 nm". Questa impostazione è valida sia per le dimensioni standard che per i campioni contenenti veicoli elettrici < 200 nm. Ad esempio, 15/40 mW per il laser blu, 20/50 mW per il laser rosso, con 0,2% di decadimento SS.
10. Selezionare Campionamento e procedere alla registrazione del campione per 1 minuto come prima.
11. Eseguire la terza misurazione con un campione di acqua o PBS per creare una misurazione in bianco dell'eluente, identificando i falsi positivi per la rimozione da parte del software. L'immissione delle misure standard è descritta nella sezione seguente.

2. Determinazione della concentrazione di particelle di un campione non etichettato e generazione di un report PDF

1. Diluire il campione EV non marcato in PBS in un intervallo di concentrazione di particelle adatto per l'analisi nFCM, 1 x 10 8- 5 x 10⁸ particelle / ml. Caricare 10-100 μL del campione diluito nella baia di carico.
2. Quando la concentrazione di particelle è sconosciuta, iniziare con una diluizione 1:100 del campione EV. La concentrazione del campione può essere rapidamente approssimata dalla dimensione dello spot laser sulla telecamera CCD durante il boost o dall'osservazione dell'Event Burst Trace durante il campionamento.
3. Aumentare il campione caricato per 45 secondi prima di selezionare Campionamento e registrare per 1 minuto, salvando come descritto in precedenza.
4. Per iniziare ad analizzare questi dati, passare dalla scheda Acquisizione alla scheda Analisi . Apri i file NFA salvati.
5. Per consentire una misurazione accurata del campione, utilizzare le due misurazioni standard effettuate prima della misurazione del campione per impostare i valori per il confronto del campione e il bianco.
6. Create la curva standard di dimensione per la conversione da SS a diametro selezionando innanzitutto il file standard di dimensione e utilizzando lo strumento imposta soglia (noto anche come soglia automatica). La soglia, visibile nella traccia dell'evento burst, identifica l'intensità minima del segnale richiesta affinché un evento sia considerato significativo.
7. Con la soglia impostata, controllare che i parametri del grafico del punto x e y siano SS-H o SS-A sull'asse x e FITC-A sull'asse y.
8. Aprite lo strumento di generazione della curva standard e selezionate S16 exo 68-155 nm come modello di dimensionamento. Fare clic su Trova picchi per identificare le intensità SS di picco come una particella di 68, 91, 113 o 155 nm di diametro.
9. Verificare se la curva SS-diametro è stata generata con un valore r prossimo a 1 prima di chiudere la finestra.
10. Impostare lo standard di concentrazione selezionando il file salvato e facendo clic su Count STD. Immettere la concentrazione di particelle dello standard.
11. Dopo aver impostato le informazioni standard, selezionare il file di esempio EV e impostare la soglia.
12. Selezionare il file vuoto e fare clic su Imposta vuoto per identificare il numero di falsi positivi da rimuovere dal conteggio dei campioni. Questo dovrebbe essere fatto con la stessa soglia del campione. Tornare al file di esempio EV.
13. Aprire lo strumento di generazione PDF e selezionare Dimensionamento e concentrazione. Inserire le diluizioni del campione. Vengono mostrati la concentrazione del campione e la distribuzione dimensionale delle particelle.

3. Etichettatura del campione

NOTA: Due strategie di colorazione possono essere utilizzate contemporaneamente per un'analisi completa delle particelle in sospensione. I protocolli di etichettatura spesso richiedono l'ottimizzazione per nuovi anticorpi o fonti di campioni.

1. Diluire una porzione del campione EV ad una concentrazione di 1,25 x 10¹⁰ particelle/ml in PBS. Incubare 8 μL del campione EV diluito con 1 μL di anticorpo e 1 μL di colorante per una concentrazione di particelle di 1 x 10 10 particelle/ml (le particelle totali saranno 1 x 10⁸ sospese in¹⁰ μL). Il rapporto di incubazione per l'anticorpo è 1:50 (1 μL di anticorpo 1:5) in questo caso.
   1. Utilizzare più di tre diverse concentrazioni di anticorpi o coloranti durante l'ottimizzazione, per fornire dati che indicano che il protocollo consente il massimo legame dell'epitopo senza sovrasaturazione dell'etichetta scelta, che può compromettere l'identificazione di eventi di fluorescenza a bassa intensità. La concentrazione di incubazione per il colorante di membrana è di 40 nM (1 μL di 400 nM).
2. Mescolare il campione da 10 μL mediante vortice per 5 s e incubare a RT per 30 minuti al buio.
   NOTA: nella discussione sono incluse raccomandazioni per i controlli.
3. Dopo l'incubazione, prelevare 1 μL del campione marcato e diluire 1:50 in PBS in una provetta da 0,6 ml.
4. Caricare il campione nella baia di carico e applicare una pressione di amplificazione per 45 s. Assicurarsi che le impostazioni laser siano corrette e che siano caricate le lenti appropriate.
5. Passare alla pressione di campionamento e selezionare Tempo di registrazione. Dopo l'acquisizione di 1 minuto, assegnare un nome al file di dati e salvare.
6. Scaricare il campione e sostituirlo con una soluzione detergente. Aumentare questo per >30 s prima di caricare il prossimo campione etichettato.

4. Analisi nFCM-generazione PDF per l'analisi delle sottopopolazioni

1. Per la generazione di PDF, applicare gli stessi standard di prima; Solo la misurazione del vuoto verrà impostata in modo diverso.
2. Selezionare il file di esempio e impostare la soglia. Nel grafico a punti, modificate l'asse y per visualizzare le misurazioni FL dal canale verde o rosso.
3. Selezionare lo strumento di gating quadrato e utilizzare il clic sinistro per disegnare un quadrato attorno alla popolazione FL +.
4. Aprire il file di misurazione vuoto e fare clic su Imposta vuoto prima di tornare al file di esempio.
5. Apri lo strumento di generazione PDF come prima e la distribuzione delle dimensioni, la concentrazione e la percentuale (rispetto a tutti gli eventi SS+) vengono identificate per la sottopopolazione FL+.
   1. Ripetere per ogni sottopopolazione di interesse identificata come "Totale, P1, P2 ecc."

Risultati

Presentazione della tetraspanina sui veicoli elettrici derivati da SW620 e EV derivati da C2C12
L'analisi moderna dell'abbondanza di tetraspanine chiave CD9, CD63 e CD81 sulle EV da una varietà di fonti ha evidenziato l'estrema variabilità della loro presenza, sia nelle analisi di massa che quando si analizza la loro presentazione sulle sottopopolazioni EV²¹. Ciò è probabilmente correlato alla disponibilità di diversi percorsi di biogenesi come i percorsi indipendenti e dipendenti dall'ESCRT²².

CD9 è stato presentato sulla più grande percentuale di EV C2C12 a ~ 50%, con la presentazione CD63 solo su ~ 30%, nella Figura 1. Quando l'etichettatura è stata eseguita con tutte e tre le anti-tetraspanine in un'incubazione, ~ 70% delle particelle ha dimostrato di presentare almeno uno dei marcatori EV. Le misurazioni ripetute hanno mostrato la deviazione standard più bassa per l'etichettatura CD9/63/81 dei veicoli elettrici C2C12 a ~ 3,8%, mentre questo era ~ 8,1% per i veicoli elettrici C2C12 etichettati CD81.

Gli EV derivati dall'SW620 hanno mostrato un diverso profilo tetraspanina, con una differenza molto maggiore tra il CD9 più presentato a ~ 40% e il CD63 meno presentato a ~ 7%. Simile agli EV C2C12, CD9 era presente nella maggior parte della popolazione positiva alla tetraspanina, poiché l'etichettatura combinata CD9/63/81 identificava ~ 42% delle particelle come aventi almeno uno dei tre marcatori.

La maggior parte delle particelle derivate da C2C12, la popolazione totale SS+, variava in dimensioni da 45-120 nm, con un diametro mediano ~ 65 nm. I profili dimensionali per ciascuna delle singole sottopopolazioni EV marcate con tetraspanina, mostrati in Figura 1, sono simili tra loro, mostrando una dimensione mediana maggiore di ~ 75-85 nm e meno EV <65 nm rispetto alla popolazione totale di particelle.

Le particelle derivate dall'SW620 variavano tra 45-160 nm con una dimensione media di ~ 65 nm, mostrando una distribuzione distorta. Le EV marcate con tetraspanina mostrano una distribuzione più normale e un diametro mediano maggiore tra 90-110 nm, con distribuzioni simili tra le singole sottopopolazioni positive di tetraspanina.

Mentre le tetraspanine più e meno presentate sono le stesse per queste due linee cellulari, la loro rappresentazione proporzionale differisce notevolmente e c'è una differenza interessante tra la potenziale co-presentazione delle tetraspanine osservabile dalla differenza nella positività CD9 e la positività CD9/63/81.

Combinare l'etichettatura a membrana EV con l'etichettatura degli anticorpi
La membrana a doppio strato dei veicoli elettrici fornisce un obiettivo di etichettatura più generico, che può consentire la distinzione da particelle non EV di dimensioni simili come aggregati proteici e alcune forme di LDL con monostrati lipidici²³. La specificità di questo tipo di etichettatura deve essere convalidata poiché alcuni coloranti di membrana comuni utilizzati nella ricerca EV hanno dimostrato di legarsi anche a particelle non EV²⁴.

L'etichettatura a membrana ha ripetutamente mostrato ~ 80% di positività di EV derivati da C2C12 e EV SW620. L'intensità SS (SS-H) mostra una buona correlazione con l'intensità FITC sui grafici a punti dei risultati C2C12 e SW620 mostrati nella Figura 2. Ciò è previsto poiché l'intensità SS è relativa alla dimensione delle particelle e quindi all'area superficiale della membrana.

La maggior parte delle EV marcate con anticorpi erano anche positive per l'etichettatura della membrana che mostravano percentuali doppie positive (FETC + e APC +) molto simili alle percentuali positive della tetraspanina. I grafici a punti FITC vs APC mostrano una leggera correlazione tra l'etichettatura a membrana e tetraspanina con l'etichettatura CD63 che sembra mostrare la correlazione più debole con l'etichettatura a membrana. Sono stati rilevati pochi eventi positivi per l'etichettatura degli anticorpi ma negativi per l'etichettatura della membrana.

Riproducibilità, doppia efficienza di etichettatura e output di dati alternativi
Una considerazione importante nella progettazione di esperimenti nFCM è l'interattività del fluoroforo o dell'etichetta. La figura 3a mostra che ripetere l'etichettatura degli anticorpi con e senza ulteriore marcatura a membrana porta a misurazioni di positività % molto simili. In particolare, l'etichettatura SW620 mostra pochissime variazioni tra i due set di misurazione. Ciò mostra un'interferenza limitata tra il colorante e il legame anticorpale e evidenzia anche una buona riproducibilità quando si ripete l'etichettatura EV.

Le misure di intensità, sia a dispersione laterale che a fluorescenza, possono essere esportate per eccellere per ogni singola particella misurata. Da questo possiamo generare misurazioni dell'intensità media di fluorescenza (MFI) per fornire approssimazioni comparative dell'abbondanza del nostro target etichettato. Le MFI per le popolazioni fluorescenti di EV derivate da C2C12 suggeriscono una presentazione leggermente inferiore di CD63 e CD81 con misurazioni MFI di ~ 550 e ~ 600, rispettivamente, rispetto alle ~ 850 MFI osservate per le EV CD9 +. Le unità di misura per MFI in questo caso sono FL-A e non sono standardizzate rispetto a una calibrazione fluorescente. L'uso di tutti e tre gli anticorpi non suscita una fluorescenza molto maggiore della semplice etichettatura CD9. Questo è molto diverso dalle misurazioni MFI SW620, che suggeriscono che l'uso di un cocktail di tutti e tre gli anticorpi fornisce un segnale di fluorescenza maggiore per EV marcati, rispetto all'uso di qualsiasi etichetta di anticorpi individuale.

Gli istogrammi di distribuzione dimensionale prodotti dal software NanoFCM possono anche essere esportati in excel consentendo di sovrapporre set di dati triplicati. I profili di distribuzione delle dimensioni della Figura 3 sono simili a quelli della Figura 1 , ma includono barre di errore. La dimensione media delle EV delle sottopopolazioni tetraspanina positive nelle EV derivate da C2C12 mostra una mediana di circa 70 nm, leggermente più grande della media di 60 nm delle popolazioni totali di particelle. Gli EV SW620 positivi per i marcatori tetraspanina sono più grandi, mostrando picchi a ~ 100 nm.

Figura 1: Sottopopolazioni di EV CD9, CD63, CD81 positive identificate mediante etichettatura anticorpale . (A) Grafico a barre che mostra la percentuale di EV marcati rispetto alle particelle totali osservate da SS per EV derivate da C2C12. (B) Grafico a barre che mostra la percentuale di EV marcati rispetto alle particelle totali osservate da SS per i veicoli elettrici derivati da SW620. (C) Profili di distribuzione dimensionale rappresentativi per i veicoli elettrici derivati da C2C12. Ogni istogramma è tratto dai PDF generati per la prima misurazione di set di dati triplicati. (D) Profili di distribuzione dimensionale rappresentativi per i veicoli elettrici derivati dall'SW620. Ogni istogramma è tratto dai PDF generati per la prima misurazione di set di dati triplicati. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard delle misurazioni triplicate degli stessi campioni etichettati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Marcatura a membrana ed etichettatura anticorpale di CD9, CD63, CD81 che presentano sottopopolazioni EV. (A) Grafico a barre che mostra Membrane+ %, tetraspanin+% e double+ % per C2C12 EV. (B) Grafico a barre che mostra Membrane+ %, tetraspanina+ % e doppio+% per i veicoli elettrici SW620. (C) Grafici a punti rappresentativi SS vs FITC che mostrano il gating per la popolazione positiva alla membrana. (D) Grafici a punti rappresentativi FITC vs APC che mostrano il gating per una doppia popolazione positiva di EV da C2C12. (E) Grafici a punti rappresentativi FITC vs APC che mostrano il gating per una doppia popolazione positiva di veicoli elettrici da SW620. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard delle misurazioni triplicate degli stessi campioni etichettati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Valutazione della variazione nelle misurazioni ripetute . (A) Grafici a barre che mostrano la percentuale di positività dell'etichettatura degli anticorpi con e senza etichettatura aggiuntiva della membrana. (B) Misure dell'intensità media di fluorescenza per sottogruppi di EV gated. (C) Istogrammi di distribuzione dimensionale media per set di dati triplicati per veicoli elettrici C2C12. (D) Istogrammi di distribuzione dimensionale media per set di dati triplicati per veicoli elettrici SW620. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard delle misurazioni triplicate degli stessi campioni etichettati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Dettagli del campione e del reagente
Sono stati selezionati due isolati EV da linee cellulari separate per la dimostrazione della marcatura fluorescente e la successiva analisi nFCM. Entrambi i set di EV sono stati sospesi in PBS e conservati a -80 ° C per <3 mesi, ma la maggior parte delle altre condizioni erano diverse tra gli isolati. La linea cellulare di mioblasti di topo C2C12 rappresenta un precursore embrionale delle cellule muscolari scheletriche e sono state coltivate in coltura 2D, condizionando il terreno di crescita per oltre 72 ore prima dell'isolamento EV mediante ultracentrifugazione. SW620 è una linea cellulare di adenocarcinoma del colon umano ed è stata coltivata in un bioreattore rudimentale, arricchendo i terreni per 7 settimane, con isolamento EV condotto mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e frazioni 7-9 eluite da colonne CL-2B di sefarosio combinate in un singolo campione.

Mentre i veicoli elettrici isolati e concentrati dal CCM sono i tipi di campioni più facili con cui lavorare, l'nFCM è applicabile alla maggior parte degli isolati di veicoli elettrici, compresi i biofluidi come siero, plasma, urina e liquido cerebrospinale. Queste analisi dei campioni beneficiano del rilevamento nFCM SS di tutte le particelle, consentendo la corroborazione con NTA, TRPS e altre analisi delle particelle, descrivendo al contempo le sottopopolazioni EV marcate fluorescentmente in termini quantitativi e una percentuale del totale, per un approccio imparziale di analisi delle particelle multiparametriche. È possibile anche l'analisi di campioni a bassa lavorazione, come l'urina non chiarificata e il CCM arricchito con EV con l'avvertenza di richiedere proteine a bassa contaminazione.

Il colorante di membrana qui utilizzato è destinato a integrarsi nel doppio strato lipidico, con una porzione lipofila per il carico della membrana e un colorante idrofilo per rimanere nella membrana plasmatica²⁵. Attualmente non esiste un colorante perfetto per l'etichettatura dei veicoli elettrici e diversi criteri devono essere considerati nella scelta, tra cui la specificità per i veicoli elettrici, l'idoneità alla fissazione o alla permeabilizzazione e l'efficienza dell'etichettatura dei veicoli elettrici²⁶.

L'etichettatura con anticorpi coniugati fluorescenti di epitopi esposti in superficie si è dimostrata un metodo efficace per identificare le sottopopolazioni EV²⁷. Un aspetto chiave dell'ottimizzazione del protocollo è soddisfare, e non superare, il punto di saturazione dell'etichettatura per legarsi a tutti gli epitopi disponibili senza inibire il rilevamento di particelle a bassa fluorescenza consentendo al tampone circostante di essere riempito con anticorpo fluorescente non legato²⁸. Inoltre, la disponibilità di siti di legame esposti per l'etichettatura degli anticorpi è potenzialmente influenzata da diversi fattori. È stato dimostrato che le condizioni di conservazione dei veicoli elettrici influenzano i profili di concentrazione e dimensione dei veicoli elettrici²⁹ con osservazioni che indicano anche effetti sull'etichettatura degli anticorpi³⁰. La presenza di proteine corona superficiali, le modifiche proteiche e gli impatti delle tecniche di isolamento possono anche avere effetti sulla marcatura degli anticorpi in alcuni casi. In definitiva, man mano che l'utilizzo dell'etichettatura fluorescente diventa più prevalente per gli studi EV, la progettazione sperimentale e l'ottimizzazione per più tecniche analitiche diventeranno più raffinate.

Per aumentare l'accuratezza dei risultati, possono essere inclusi diversi controlli come (1) PBS + controllo del colorante, per valutare la micella o la formazione di aggregati in alcuni coloranti, che possono apparire come particelle SS + nell'analisi nFCM, (2) PBS + controllo degli anticorpi, possono verificarsi aggregati, anche se spesso non abbastanza grandi da diffondere abbastanza luce per il rilevamento SS, (3) campione EV + controllo degli anticorpi IgG, comune nella citometria a flusso e utilizzato per identificare qualsiasi legame non specifico, (4) campione di particelle non EV + controllo anticorpo / colorante - particolarmente importante quando è necessario identificare EV in campioni di particelle complesse, controlli come particelle di lipoproteine a bassa densità purificate (LDL) o campioni impoveriti / ablati EV possono agire come un controllo negativo per convalidare l'etichettatura selettiva, (5) i controlli positivi sono difficili da progettare, ma la convalida di un anticorpo sulle cellule è un'inclusione utile.

Presentazione delle tetraspanine sui veicoli elettrici
L'etichettatura degli anticorpi e della membrana di questo esperimento dimostra l'alto livello di dati quantitativi che possono essere ottenuti in un breve lasso di tempo mediante analisi nFCM. La misurazione simultanea degli attributi fisici chiave del diametro/concentrazione delle particelle con le misurazioni fenotipiche della presenza di membrana e/o proteine porta a descrizioni di alto livello delle sottopopolazioni all'interno dell'isolamento delle particelle.

È importante sottolineare che in questi due campioni di EV sono stati identificati diversi livelli delle tre tetraspanine "chiave" correlate alle EV, CD9, CD63, CD81. CD9 è stato presentato sulla maggior percentuale di EV sia per EV derivate da C2C12 che per SW620, con CD81 e CD63 che sono rispettivamente le seconde e meno presentate proteine.

Nonostante alcune somiglianze osservate qui nei profili tetraspanina delle EV provenienti da due fonti cellulari molto diverse, i livelli di CD9, CD63 e CD81 possono essere molto diversi tra le linee cellulari e le EV derivate dal paziente³¹.

La differenza nell'espressione di CD63 tra i due campioni di EV è particolarmente rilevante per la discussione in corso sugli identificatori chiave di "EV-ness". Mentre la presentazione di CD63 solo in ~ 8% degli EV SW620 può essere inaspettata da alcuni, CD63 è stato suggerito come scarso identificatore dei diversi tipi di EV isolati per dimensione o densità³², e sono stati identificati EV negativi tetraspanina, anche quando descritti come esosomi³³.

Identificazione di EV all'interno di isolamenti di particelle complesse
L'eterogeneità dei profili di tetraspanina EV, sia nelle linee cellulari che nelle EV derivate dal paziente, mette in guardia contro la dipendenza dalla cattura basata sulla tetraspanina delle EV ed evidenzia la futura necessità di nuovi metodi di identificazione delle EV³¹. L'etichettatura delle EV indipendente da proteine specifiche potrebbe rivelarsi molto utile per identificare le EV da particelle non EV di dimensioni simili se la specificità EV può essere dimostrata molto elevata. Ciò è particolarmente vero per gli isolati di EV biofluidi in quanto è stato suggerito che la concentrazione di EV nel plasma sanguigno umano è nell'intervallo di 10 10 particelle / ml mentre le lipoproteine sono misurate a 10¹⁶ per ml^14,34. Anche dopo l'arricchimento EV, gli studi che confrontano la positività delle particelle per i marcatori tetraspanina e / o il marcatore LDL ApoB suggeriscono ~ 50-100 volte maggiore abbondanza di LDL nei campioni di plasma libero piastrinico (PFP) rispetto a EV³⁵.

La tecnica di isolamento utilizzata influisce notevolmente sulla gamma di particelle non EV co-isolate come lipoproteine a densità molto bassa (VLDL), lipoproteine a densità intermedia (IDL) e LDL³⁶. Ci sono anche descrizioni di co-isolati lipoproteici legati alle EV che, pur giocando potenzialmente un importante ruolo biologico, rendono il raggiungimento di campioni puri EV un obiettivo impegnativo³⁵.

Pertanto, si potrebbe sostenere che si dovrebbe porre maggiore attenzione alla descrizione delle particelle che compongono un campione, piuttosto che ottenere l'isolamento di una selezione pura ma limitata di EV. Ottenere una descrizione completa delle particelle misurando separatamente l'abbondanza di tetraspanina in massa e il conteggio delle particelle può essere insufficiente per determinare con precisione le concentrazioni di EV, in particolare da fonti di biofluidi^36,37. Identificare le sottopopolazioni in un approccio basato su livelli, mostrando particelle totali, EV e EV che presentano determinate proteine, come dimostrato in questo esperimento può fornire una soluzione robusta alla caratterizzazione delle nanoparticelle. Questo è stato il caso di progetti che prevedono il caricamento di EV con progetti per future applicazioni terapeutiche²⁰ e l'identificazione di EV CD63+ con carico luminale come i mitocondri³⁸.

nFCM all'interno del repertorio dell'analisi dei veicoli elettrici
Un punto di forza dell'analisi nFCM EV è il modo in cui i dati possono corroborare e basarsi sulle analisi EV più comuni e formare ponti tra set di dati fisici e fenotipici. Tuttavia, questo si basa su protocolli di etichettatura accurati che spesso devono essere ottimizzati per reagenti di etichettatura unici come coloranti e anticorpi. Un criterio chiave per un'analisi accurata è avere particelle marcate sospese in un tampone non fluorescente, che si basa sulla rimozione del fluoroforo non legato in eccesso o sul perfezionamento dei protocolli per non superare la saturazione dell'epitopo.

Studi comparativi hanno dimostrato che il dimensionamento nFCM dei veicoli elettrici fornisce dati in linea con TRPS e cryo-TEM, tecniche che sono descritte come più accurate di NTA per l'analisi delle dimensioni dei veicoli elettrici^10,39. Tuttavia, come per qualsiasi metodo basato sull'ottica, l'influenza delle proprietà ottiche eterogenee osservate per i veicoli elettrici e le differenze tra le proprietà ottiche del materiale di riferimento e dei veicoli elettrici devono essere riconosciute nell'interpretazione dei dati¹⁰.

Il Western blotting è stato un metodo chiave per indicare l'arricchimento EV attraverso l'identificazione dei marcatori EV⁴⁰. Ma il desiderio di dimostrare la presenza di tali marcatori sulle particelle ha guidato i progressi nelle analisi citometriche a flusso basate su EV¹⁷. Tuttavia, le risoluzioni necessarie per fornire dati affidabili sono attualmente meglio raggiunte attraverso strumentazione dedicata per quanto riguarda sia la luce diffusa che quella fluorescente¹⁹.

nFCM fornisce un approccio imparziale di descrivere inizialmente tutte le particelle irrilevanti di marcatori specifici, mediante l'uso della misurazione della dispersione laterale, consentendo la corroborazione con le tecniche più comuni di NTA, RPS e TEM¹, aggiungendo contemporaneamente misurazioni fenotipiche simili a WB o Elisa in modo quantitativo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Anti-CD81 antibody (M38)	abcam	ab233259	Anti-Human CD81 APC conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (EM-04)	Abcam	ab82392	Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted	abcam	ab82389	Anti-Human CD9 APC conjugated antibody
APC anti-mouse CD63 antibody	biolegend	143905	Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody
APC anti-mouse/rat CD81 antibody	biolegend	104909	Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC	invitrogen Via Fisherscientific	A15712	Anti-Human CD63 APC conjugated antibody
Celline AD1000 bioreactor	Merck	Z688037-5EA
Cleaning solution	NanoFCM	17159	In house cleaning solution for nanoanalyser
EVs from C2C12	Gifted		Mouse line
EVs from SW620	Gifted		Human line
Memglow - Fluorogenic Membrane Probe	Cytoskeleton	MG01	non toxic cell membrane dye
NanoAnalyzer	NanoFCM		nano-flow cytometer for measurement of single particles
PBS, pH 7.2	Gibco Via Fisherscientific	12549079	Salt solution for dilution of samples and antibodies
Snaplock Microtubes, 0.60mL	Axygen Via Fisherscientific	11371944	Tubes required to load sample into nanoanalyser