Istituzione di un modello di embolia polmonare minimamente invasivo per ratti utilizzando coaguli di sangue autologhi

Riepilogo

Viene descritta una metodologia dettagliata per stabilire un modello minimamente invasivo di embolia polmonare nel ratto utilizzando coaguli di sangue autologhi. Vengono inoltre forniti ulteriori metodi per quantificare l'area infartuata e visualizzare l'albero arterioso polmonare.

Abstract

L'embolia polmonare (EP) è una delle principali cause di morte cardiovascolare, con conseguente onere socioeconomico significativo. Sebbene i trattamenti attuali si concentrino principalmente sull'anticoagulazione e sulla trombolisi, vi è un urgente bisogno di una migliore comprensione della sua fisiopatologia e dello sviluppo di nuove strategie di trattamento. I modelli animali svolgono un ruolo cruciale nella comprensione dell'EP e nello sviluppo di nuove terapie per la malattia, con i roditori comunemente utilizzati per considerazioni etiche e di costo. Tuttavia, i modelli esistenti di roditori per l'EP sono limitati dalla mancanza di procedure standardizzate, che ostacolano la riproducibilità e i confronti tra studi. Questo studio mira a stabilire un modello di ratto minimamente invasivo di EP utilizzando coaguli di sangue autologhi. Il modello presenta una tecnica di prelievo di sangue minimamente invasiva, una procedura standardizzata di generazione di trombi e un accesso venoso minimamente invasivo. Inoltre, vengono forniti protocolli per la quantificazione delle aree infartuate e la visualizzazione dell'albero arterioso polmonare. Queste procedure mirano a migliorare l'affidabilità dei modelli di roditori per lo studio della progressione dell'EP e a facilitare lo sviluppo di nuovi trattamenti.

Introduzione

L'embolia polmonare (EP) è una delle principali cause di morte intraospedaliera e la terza causa più frequente di morte cardiovascolare. Nonostante la sua elevata incidenza, la prevenzione e la diagnosi tempestiva rimangono impegnative ^1,2. Le terapie anticoagulanti e trombolitiche sono fondamentali nel trattamento dell'EP, ma una comprensione più profonda della progressione della malattia e nuovi approcci terapeutici è essenziale per migliorare la gestione della malattia³.

Nella moderna ricerca biomedica, i modelli animali svolgono un ruolo fondamentale nel chiarire i meccanismi delle malattie umane e nello sviluppo di nuove terapie ^4,5. Topi, ratti, criceti e conigli sono spesso utilizzati nella modellazione PE a causa di considerazioni etiche e di economicità 6,7,8,9,10. Gli approcci di modellazione PE generalmente si dividono in tre categorie: formazione di trombi in vivo, iniezione di coaguli di sangue in vitro e somministrazione di particelle non trombotiche. La scelta delle specie animali e della tecnica di modellazione è determinata dagli obiettivi specifici della ricerca, poiché nessun singolo modello è adatto a tutti gli scopi. Ad esempio, gli studi incentrati sull'esplorazione di nuove terapie trombolitiche spesso impiegano modelli che coinvolgono coaguli di sangue autologhi invece di particelle non trombotiche.

Gli attuali metodi per la modellazione dell'EP nei roditori affrontano sfide a causa della mancanza di metodologie dettagliate e standardizzate. Ciò influisce su processi chiave come il prelievo di sangue, la formazione di coaguli di sangue e la successiva embolizzazione, tutti fondamentali per garantire risultati riproducibili in tutti gli studi. Inoltre, c'è una lacuna significativa nella capacità di quantificare l'area embolizzata e mappare accuratamente la distribuzione degli emboli dopo l'embolizzazione. Affrontare queste carenze è essenziale per migliorare l'affidabilità e l'utilità dei modelli di roditori nella ricerca sull'EP.

In questo studio, vengono descritti protocolli dettagliati per stabilire un modello di PE nel ratto utilizzando coaguli di sangue autologhi. Questo modello presenta una tecnica di prelievo del sangue minimamente invasiva, una procedura standardizzata di generazione di trombi e un accesso venoso minimamente invasivo. Inoltre, vengono forniti protocolli per quantificare le aree infartuate nei polmoni e visualizzare l'albero arterioso polmonare, che possono facilitare ulteriori scoperte di ricerca.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti con l'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Accademia cinese delle scienze mediche e del Peking Union Medical College (numero di approvazione: IRM/2-1ACUC-2311-015). In questo studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley, di 6 settimane di età e del peso di circa 250 g. Gli animali sono stati alloggiati in un ambiente specifico privo di agenti patogeni con accesso ad libitum a una dieta equilibrata e acqua. Sono stati mantenuti sotto un ciclo luce/buio di 12 ore a una temperatura ambiente di 22 °C ± 2 °C. Gli animali sono stati lasciati adattare all'ambiente per 1 settimana prima di sottoporsi a qualsiasi procedura chirurgica. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Attrezzature e materiali

1. Attrezzatura per anestesia: utilizzare una macchina per anestesia gassosa per piccoli animali e isoflurano.
2. Materiale chirurgico: Preparare tamponi di cotone, disinfettante iodoforico, uno stereomicroscopio, un rasoio, nastro medico, una siringa da 1 ml con ago da 27 G, una siringa da 5 ml, una siringa da 10 ml, soluzione fisiologica normale, una garza, 8-0 fili di nylon, filo di nylon 6-0 con ago da sutura, micro pinze emostatiche, micro pinzette e forbici fini.
3. Altri materiali: Procurarsi aghi da dispensazione da 19 G e 18 G compatibili con siringhe mediche, un tubo in silicone con diametro interno di 1,2 mm e lunghezza di 10 cm, un tubo per infusione con diametro interno di 3,0 mm e lunghezza di 20 cm, una provetta da centrifuga da 1,5 ml, una pipetta e puntali per pipette.
4. Generatore di trombi autocostruito e iniettore di coaguli di sangue (Figura 1): collegare il tubo di silicone all'ago di erogazione da 19 G collegato a una siringa da 1 ml per creare il generatore di trombi. Collegare un'estremità della provetta per infusione all'ago da 18 G e collegare l'altra estremità a una siringa da 5 ml per creare l'iniettore di coagulo.

2. Preparazione di coaguli di sangue autologhi

1. Anestesia
   1. Posizionare l'animale all'interno della camera di induzione dell'anestesia e somministrare una miscela di isoflurano al 4% con aria ambiente a una portata di 2 L/min per 2-3 minuti (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
   2. Posizionare l'animale sulla piattaforma operativa in posizione supina. Mantenere l'anestesia somministrando isoflurano al 2,5% a una velocità di flusso di 0,4 L/min. Testare il riflesso del pedale per assicurarsi che si ottenga un'anestesia adeguata.
   3. Estendi entrambi gli arti anteriori orizzontalmente dal corpo ed estendi gli arti posteriori per esporre adeguatamente la zona inguinale. Fissare l'animale in questa posizione utilizzando del nastro adesivo (Figura 2A).
2. Prelievo di sangue attraverso la vena cava cranica (CVC)
   1. Rimuovere i peli intorno al manubrio usando un rasoio e una crema depilatoria. Disinfettare la pelle con iodofor.
   2. Inserire verticalmente l'ago da 27 G collegato alla siringa da 1 ml a una profondità di 8 mm per perforare il CVC sinistro o destro, come mostrato nella Figura 2A.
      NOTA: La sporgenza della superficie corporea del CVC è di 5 mm lateralmente al manubrio. È possibile utilizzare entrambi i lati e la scelta non influisce sui passaggi successivi.
   3. Tenere la siringa e tirare delicatamente indietro lo stantuffo per creare una pressione negativa all'interno del cilindro. Estrarre gradualmente l'ago fino a quando il sangue non entra, quindi mantenere tale posizione fino a quando non vengono raccolti 0,3 ml di sangue (Figura 2B).
3. Preparazione del coagulo di sangue
   1. Spingere il sangue raccolto in una provetta da centrifuga da 1,5 mL, facendo attenzione a non produrre bolle.
   2. Aspirare il sangue nel tubo di silicone del generatore di trombi autocostruito fino a quando la colonna sanguigno non raggiunge i 10 cm di lunghezza.
      NOTA: Eseguire rapidamente questi due passaggi, poiché la coagulazione inizierà e si propagherà nella provetta da centrifuga, riducendo la qualità dei coaguli di sangue raccolti.
   3. Attendere 30 minuti fino a quando il sangue non è completamente trombizzato. Durante questo periodo, prepara le colonne di sangue per altri animali allo stesso modo.
   4. Sciacquare la colonna di sangue trombizzata in una piastra di Petri contenente soluzione fisiologica normale e lavare la colonna tromboidale con soluzione fisiologica normale tre volte (Figura 2C).
   5. Utilizzare le forbici sottili per tagliare la colonna trombica in coaguli di sangue uniformi, ciascuno di 4 mm di lunghezza (Figura 2D). Aspirare 10-20 coaguli nell'iniettore autocostruito pre-riempito con 2 mL di soluzione fisiologica.
      NOTA: La lunghezza dei coaguli di sangue non deve superare 1 cm, altrimenti rimarranno intrappolati nel ventricolo destro.

3. Preparazione dell'accesso alle vene

1. Esposizione dei vasi epigastrici superficiali
   1. Anestetizzare e fissare l'animale come descritto al punto 2.1.
   2. Radere i peli che circondano la zona inguinale sinistra. Applicare la crema depilatoria su queste aree, attendere 1 minuto, quindi rimuovere la crema con una garza. Disinfettare la pelle con iodofor.
   3. Praticare un'incisione cutanea di 5 mm sopra l'origine dei vasi epigastrici superficiali nella zona inguinale. Di solito, l'origine dei vasi epigastrici superficiali può essere tracciata osservando una piccola pulsazione nella zona inguinale.
   4. Utilizzando uno stereomicroscopio con ingrandimento 10x, separare un sottile strato di grasso sottocutaneo per esporre i vasi epigastrici superficiali (Figura 3A).
2. Isolare la vena epigastrica superficiale
   1. Isolare attentamente la vena epigastrica superficiale dall'arteria, dal nervo e dal tessuto adiposo. Esegui questa operazione sia prossimalmente, fino al punto in cui drena nella vena femorale, sia distalmente, fino alla prima biforcazione venosa.
   2. Legare il lato distale con 8-0 infilare e bloccare il filo con un micro-morsetto. Controlla il lato prossimale con un 8-0 anello del filo attaccato a un altro micro-clamp (Figura 3B).
   3. Praticare una piccola incisione trasversale sul lato distale della vena isolata. Controllare il lato prossimale per evitare sanguinamenti. Sciacquare il sangue rimanente nel lume venoso con soluzione fisiologica. Una volta che la vena è chiara, utilizzare delle micro pinzette per allargare l'incisione venosa.

4. Embolizzazione

1. Incannulamento venoso
   1. Inserire delicatamente l'ago dell'iniettore autocostruito nella vena attraverso l'incisione venosa. Fissare l'ago con un terzo morsetto per evitare che scivoli fuori dalla vena.
2. Procedura di embolizzazione
   1. Spingere lentamente lo stantuffo per somministrare una piccola quantità di soluzione fisiologica. La pienezza della vena senza resistenza indica un accesso non ostruito alla vena (Figura 3D).
   2. Continuare a spingere lo stantuffo per somministrare coaguli nella vena femorale attraverso l'accesso superficiale della vena epigastrica. Controllare la velocità di embolizzazione a 5 emboli al minuto. Monitorare la respirazione dell'animale; La dispnea emergente ed esacerbante indica il successo dell'embolizzazione.
   3. Dopo aver iniettato la quantità predefinita di coaguli di sangue, ritirare l'ago e legare il lato prossimale della vena epigastrica superficiale.
   4. Sutura l'incisione e metti l'animale in una scatola calda. Trasferisci l'animale nella sua gabbia una volta che si è svegliato.

5. Quantificazione dell'area infartuata

1. Eutanasia e perfusione cardiaca
   1. Aggiungere 25.000 U di eparina sodica a 250 ml di soluzione fisiologica normale e mescolare accuratamente. Collegare il flacone a un dispositivo di infusione e appendere il flacone capovolto a un'altezza di 80 cm. Chiudere la valvola del dispositivo di infusione.
   2. Eutanasia degli animali con un sovradosaggio di isoflurano (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
   3. Taglia le costole con grandi forbici e apri il torace, evitando danni ai polmoni e ai vasi grandi.
   4. Inserire l'ago del dispositivo di infusione nel ventricolo sinistro. Aprire la valvola del dispositivo di infusione per consentire l'infusione di soluzione salina eparinizzata. Usa le forbici per tagliare la vena cava inferiore e l'appendice sinistra per consentire il drenaggio. Controllare la velocità di perfusione a 50 mL/min.
      NOTA: Durante questa procedura, il tessuto polmonare normale diventerà bianco, mentre la zona embolizzata rimarrà arrugginita.
   5. Dopo aver completato la perfusione con soluzione fisiologica eparinizzato, perforare il tronco dell'arteria polmonare attraverso il ventricolo destro utilizzando una siringa da 10 ml riempita con una soluzione di paraformaldeide al 4%. Fissare il tessuto polmonare eseguendo la perfusione di paraformaldeide al 4% attraverso i polmoni per un volume totale di 30 ml.
2. Introduzione di un indice chiamato Rapporto di infarto
   1. Dopo la fissazione, asportare i polmoni, il cuore, la trachea, l'esofago, il timo e i grandi vasi nel loro insieme dalla colonna vertebrale e dal diaframma¹¹.
   2. Rimuovere con cura l'esofago, il timo e il tessuto adiposo dalla massa iniziale, lasciando solo il cuore, i polmoni e i grandi vasi.
   3. Immergere la parte rimanente in un volume adeguato di soluzione di paraformaldeide al 4% per almeno 48 ore.
   4. Utilizzare una bilancia analitica per pesare l'intero polmone. Usa le forbici sottili per separare la parte infartuata dei polmoni e pesa il tessuto infartuato con la stessa bilancia. Calcola il rapporto di infarto utilizzando la seguente equazione:
      
      i è il peso del tessuto infartuato, w è il peso dell'intero polmone, I rappresenta il rapporto di infarto.
   5. Dopo aver quantificato l'area infartuata, tagliare il tessuto polmonare fissato con paraformaldeide per l'inclusione di paraffina¹¹.

6. Visualizzazione dell'albero arterioso polmonare

1. Fusione dell'arteria polmonare
   1. Sopprimere l'animale ed eseguire la perfusione cardiaca come descritto al punto 5.1.
   2. Aggiungere una quantità uguale (in peso) di diluente al composto di colata in silicone, frullare la miscela e quindi aggiungere il 5% (in peso o volume) dell'agente indurente. Frullare nuovamente il composto.
   3. Aspirare 1 mL di miscela in una siringa da 1 mL, scaricare l'aria e inserire l'ago nel tronco dell'arteria polmonare attraverso il ventricolo destro. Fissare l'ago all'arteria polmonare per evitare lo scivolamento e il riflusso.
   4. Premere delicatamente lo stantuffo per consentire alla miscela di colata di silicone di riempire l'albero arterioso polmonare. Le aree polmonari normali saranno colorate dalla miscela di colata, mentre le aree infartuate rimarranno rosso ruggine.
      NOTA: Il calco dell'arteria polmonare deve essere applicato solo al tessuto polmonare intatto. In genere, 0,6-0,8 ml della miscela di colata sono sufficienti per riempire l'albero arterioso polmonare. L'iniezione eccessiva della miscela di colata può portare al calco della vena polmonare, che influisce sulla visualizzazione dell'albero arterioso polmonare. La miscela di colata deve essere utilizzata entro 20 minuti dall'aggiunta dell'agente indurente, poiché cristallizzerà oltre questo tempo.
   5. Estrarre la siringa dopo aver colato la perfusione, legare il tronco dell'arteria polmonare e prelevare i polmoni, il cuore e i grandi vasi sanguigni come descritto al punto 5.2. Mettere l'intera massa in una capsula di Petri e conservarla in frigorifero a 4 °C per una notte per consentire alla miscela di colata di cristallizzare.
2. Pulizia e visualizzazione
   1. Rimuovere il cuore e i vasi sanguigni grandi dai polmoni con le forbici, quindi pulire i detriti della miscela di polimerizzazione dalla superficie polmonare.
   2. Immergere i polmoni in sequenza in soluzioni di alcol etilico al 25%, 50%, 75%, 95% e 100%, ciascuna per 24 ore. Questa procedura disidraterà completamente i polmoni.
   3. Immergere i polmoni disidratati nel salicilato di metile per 24 ore. Dopo questo processo di pulizia, l'albero arterioso polmonare sarà visibile e si potranno vedere anche gli emboli, poiché il salicilato di metile non elimina l'emoglobina (Figura 4B, D).

Risultati

Sintomi e patologia del modello di PE
Durante l'embolizzazione, i ratti hanno sperimentato mancanza di respiro e il torace ha mostrato fluttuazioni ampliate. Quasi tutti gli animali sono sopravvissuti all'episodio di embolia polmonare quando sono stati somministrati meno di 10 cm di coaguli di sangue (14 su 15 animali modellati). Dopo essere stati riportati nelle loro gabbie, gli animali si sono raggomitolati negli angoli e hanno mostrato un ridotto interesse per il c...

Discussione

In questo studio, è stato stabilito con successo un modello di ratto minimamente invasivo di EP utilizzando coaguli di sangue autologhi. Una volta padroneggiata, questa procedura di modellazione può essere completata entro 30 minuti. Il modello cattura efficacemente le caratteristiche chiave dell'EP clinica, come confermato dagli esami patologici. Di conseguenza, offre uno strumento prezioso per chiarire i cambiamenti emodinamici e la patogenesi delle complicanze a seguito di EP, svilu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical balance	METTLER TOLEDO	MA55/A	None
Dispensing needle	Jinrong electronics	None	19 G and 18 G
Fine scissors	Stronger	XGJ1300	None
Heparin sodium salt	Solarbio	01-08-9041	140U/mg
Isoflurane	RWD	R510-22-10	None
Methyl salicylate	Macklin	M813577	AR, 99%
Micro clamp	JZ	W40160	None
Micro tweezers	Stronger	XGN1310	None
Silicone casting compound	Flow Tech	MV-130	None
Sprague-Dawley rats	Vital River	SD-IGS	None
Stereo microscope	Murzider	MSD204	None